材料和试剂

直径10厘米的玻璃培养皿（斯科特杜兰）
吸水棉
Whatman 1滤纸
剃刀刀片（Glassvan，23号刀片刀片）
15毫升一次性离心管（Tarsons）
幻灯片
针（Dispovan，无菌针，0.45 x 13毫米）
刷（骆驼，大小0）
防毒面具
植物组织（叶，根或整株幼苗）在压力处理后新鲜收集
蒸馏水
氯化汞（HgCl 2）（SRL Sisco Research Laboratories，目录号：25699）
希夫试剂（HiMedia Laboratories，目录号：S074-500ML）
硝酸钙四水合物（Ca（NO 3）2·4H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：GRM3903-500G） >
硝酸钾（KNO 3）（HiMedia Laboratories，目录号：GRM1401-500G）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（HiMedia Laboratories，目录号：RM3943-500G）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：RM684-5KG）
硼酸（H 3 BO 3）（HiMedia Laboratories，目录号：MB007-1KG）
氯化锰（II）四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：RM685-500G）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：PCT0118-1KG）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：GRM415-100G）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：RM630-500G）
氯化铁（FeCl 3）（HiMedia Laboratories，目录号：RM1178-1KG）
EDTA（HiMedia Laboratories，目录号：RM678-100G）
硫酸铵（（NH 4）2 SO 4）（HiMedia Laboratories，目录号：MB004-250G）
硫酸钾（K 2 SO 4）（HiMedia Laboratories，目录号：GRM404-500G）
硫酸锰一水合物（MnSO 4·2H 2 O）（SRL Sisco Research Laboratories，目录号：1347151,500G）
偏硫酸氢钠（Na 2 S 2 O 5）（Sigma-Aldrich，目录号：255556-100G）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：PCT0004-500G）
氯化铝（AlCl 3）（Merck，目录号：8010810100）
氯化镉（CdCl 2）（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q17584）
氯化锌（ZnCl 2）（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q28785）
乙醇（用于DNA提取的稀释剂，HiMedia Laboratories，目录号：MB228-500ML）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：V800196-500ML）
醋酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q21057）
盐酸（HCl）（HiMedia Laboratories，目录号：AS004-2.5L）
Schiff's试剂染色溶液（见配方1）
Hoagland解决方案（见配方2）
改良的营养液（见配方3）
处理溶液（AlCl 3，CdCl 2，ZnCl 2）（见方案4）
亚硫酸盐溶液（见配方5）
漂白解决方案（见第6章）
存储解决方案（请参阅配方7）

设备

移液器（Gilson，PIPETMAN，2-20,20-200和100-1,000μl）
pH计（pH Tutor，Eutech Instruments）
磁力搅拌器和热板（Tarsons）
称量天平（Sartorius，0.1 mg-220 g）
水浴（Equitron unstirred水浴，Medica Instruments）
光学显微镜（奥林巴斯，10倍物镜）
数码相机（尼康，型号：COOLPIX P100,1030万像素，26倍变焦）

程序

准备希夫试剂溶液（配方1）。
水培植物。
1. 籼稻：在用Hoagland营养液（方案2）浸泡的棉床（用Whatman 1滤纸覆盖的脱脂棉）的培养皿中发芽表面灭菌（具有0.01％氯化汞）水稻种子在28±2°C黑暗条件下。在光照时间为14小时，光子通量密度为220μmolm -2 s -1 -1的条件下，在26±2℃的Hoagland营养液（配方2）上水培生长发芽的幼苗，（PAR）5天，然后用500μMCaCl 2溶液预处理24小时。将经过预处理的幼苗暴露于pH 4.5的含有500μMCaCl 2 2的100μMAlCl 3溶液（稀释自储备溶液，配方4）48小时，并收获根尖用于组织化学测定。
  注：由于氯化汞（HgCl 2）的毒性，强烈建议使用预防性服装。
2. 阿萨姆茶：从当地的茶园采集，然后拔出聚乙烯套管，然后在26±2°C的土壤中在14±2°C的光周期内适应环境适应30-35天，光子通量密度为220μmolm -2 -1（PAR）。适应后，用营养液在盆中水培茶苗（方案3）。在施用浓度为250μM的AlCl 3 3 Al 3+前，在营养液（未消毒）中将植物预培养一周。 pH保持在4.2。 3天后，收获根部进行组织化学分析。
3. 印度芥末：表面消毒芥菜的健康种子（L.）Czern＆amp;具有0.01％HgCl 2的Coss并设定用于萌发。将1mM CdCl 2和2.5mM ZnCl 2处理（稀释自储备溶液，配方4）施用于种子，方法是放置在Petri平板中，棉花床浸泡在胁迫溶液中当保持发芽时。第7天后，收获幼苗进行组织化学研究。
  注意：由于没有碳水化合物来源添加到营养液中，所以不会发生细菌污染。
在另一组实验中，保持对照样本不受压力的影响，并允许在正常的非应激条件下生长（未用任何应激因子处理的植物）。
榨取（使用剃刀刀片）籼米和阿萨姆茶的根组织。将根部组织和印度芥菜的整个幼苗转移到15ml离心管中，并向每个管中加入5ml希夫氏试剂溶液。
注意：组织应完全浸入溶液中。
真空渗入浸泡在希夫氏试剂中的组织样品1-2小时，然后用亚硫酸盐溶液冲洗10分钟（配方5）。
注意：真空渗透的时间随组织和植物年龄而变化，应保持至少，并且除非获得品红色着色的对比视觉差异。已经提供了一个代表性的图像，显示颜色变化的程度，表明有足够的渗透（图1）。

图1.代表性图像，显示颜色变化，指示足够的渗透/处理。籼米中的希夫试剂（A）对照，（B）应激，比例尺= 1厘米;阿萨姆茶根（C）对照，比例尺= 1厘米，（D）强调，比例尺= 1厘米; （E）对照，比例尺= 1cm，（F）1mM Cd处理的幼苗，比例尺= 1cm，（G）2.5mM Zn处理的幼苗，比例尺= 1厘米。
用蒸馏水彻底清洗以去除多余的污渍，然后用漂白溶液（配方6）将组织样品在100℃水浴中漂洗5-10分钟。
注意：叶绿素应从组织样本中完全去除。
在完成漂白后，将样品小心地放在载玻片上（使用针头和刷子对大米和茶叶根部）并在10倍放大倍数的显微镜下拍照（图2）。而对于芥末，用数码相机直接拍摄幼苗（图2）。如果需要，将组织样本储存在4°C的储存溶液中（方法7），以备将来摄影时使用。＆nbsp;

图2.用Schiff's试剂测定不同植物物种中脂质过氧化作用的组织化学测定使用Schiff's试剂在籼稻根中检测脂质过氧化（A）对照，比例尺= 100微米; （B）应力，比例尺=100μm;阿萨姆茶根（C）对照，比例尺=100μm，（D）应力，比例尺=100μm;和印度芥菜幼苗（E）对照，比例尺= 5mm，（F）1mM Cd处理的幼苗，比例尺= 5mm，（G）2.5mM Zn处理的幼苗，比例尺= 5毫米。
注意：由于茶树分泌的各种酚类化合物，图2C中的根看起来呈褐色。＆nbsp;

数据分析

由于这是定性分析，因此不进行数据分析。通过用数码相机拍摄照片简单记录染色的植物组织样品。下面的文章介绍了类似的分析：Awasthi et al。（2017）。

食谱

Schiff's试剂染色溶液（Jensen，1962）
在蒸馏水中配制10％（v / v）希夫氏试剂溶液并充分混合
使用市售的Schiff's试剂。每次新鲜制备Schiff's试剂染色溶液。
Hoagland解决方案（表1）

表1. Hoagland解决方案的组成

分别制备储备溶液并按适当比例混合以获得工作溶液。最后用1 N NaOH将pH值调节至6.0-6.2
改良的营养液（加纳蒂等人，2005年）（表2）

表2.改良营养液的组成

分别制备储备溶液并按适当比例混合以获得工作溶液。最后用足量的营养液，用1N NaOH调pH至6.0-6.2
治疗方案
AlCl 3，CdCl 2，ZnCl 2：制备10mM储备液并在4℃下分开储存以备将来使用
注：当制备AlCl 3溶液时，形成HCl有害烟雾。所以应该采取适当的预防措施，例如在通风橱里，使用防毒面具等。CdCl 2具有高致癌性，因此强烈建议使用预防性服装。
亚硫酸盐溶液
在0.05M HCl中的0.5％（w / v）Na 2 S 2 O 5。
漂白解决方案
乙酸：甘油：乙醇（1：1：3，v / v / v）溶液
存储解决方案
甘油：乙醇（1：4，v / v）溶液

致谢

该协议改编自Pompella等人（1987）和Yamamoto等人（2001）。我们真诚地感谢印度UGC的经济支持（UGC NON-NET奖学金）。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Awasthi，J. P.，Saha，B.，Regon，P.，Sahoo，S.，Chowra，U.，Pradhan，A.，Roy，A.and Panda，S.K。（2017）。印度东北部水稻品种耐铝性的形态生理学分析 PLoS One 12（4）：e0176357。
Cakmak，I.和Horst，W.J。（1991）。铝对脂质过氧化，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和过氧化物酶在大豆根尖中的活性（ Physiologia Plantarum 83：463-468。
Du，B。，Nian，H.，Zhang，Z。和Yang，C.（2010）。铝对超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性的影响以及根中的脂质过氧化和大豆在铝耐受性方面不同的愈伤组织。 Acta Physiologiae Plantarum 32：883-890。
Ghanati，F.，Morita，A。和Yokota，H。（2005）。铝对茶树生长和抗氧化系统激活的影响。 a> Plant Soil 276：133-141。
Jensen，W.A。（1962）。植物组织化学：原理与实践 W。 H.Freeman and Company ，旧金山。
Ma，B.，Gao，L.，Zhang，H.，Cui，J。和Shen，Z。（2012）。铝诱导的氧化胁迫以及耐铝性不同的水稻品种根部抗氧化防御能力的变化。 Plant Cell Rep 31（4）：687-696。
Mandal，C.，Ghosh，N.，Maiti，S.，Das，K.，Gupta，S.，Dey，N.and Adak，M.K。（2013）。 Salvinia（Salvenia natans Linn。）对铝胁迫的抗氧化反应和它被多胺调节。 Physiol Mol Biol Plants 19（1）：91-103。
Pompella，A.，Maellaro，E.，Casini，A.F和Comporti，M。（1987）。溴苯中毒小鼠肝脏脂质过氧化的组织化学检测 Am J Pathol 129（2）：295-301。
Saha，B.，Mishra，S.，Awasthi，J. P.，Sahoo，L.和Panda，S. K.（2016）。转基因芥菜中耐旱性和耐盐性的增强[ Brassica juncea （L. ）Czern＆amp; Coss。]过表达拟南芥组4晚期胚胎发生丰富基因（AtLEA4-1）。
Yamamoto，Y.，Kobayashi，Y。和Matsumoto，H。（2001）。脂质过氧化是铝引发的早期症状，但不是豌豆根部延长抑制的主要原因。植物生理学 125（1）：199-208。