材料和试剂

聚丙烯容器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：193A）
铝箔
磁带
刻度玻璃移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-25E）
2毫升安全锁管（Eppendorf，目录号：0030120094）
注射器（Descarpack，目录号：0324501）
锥形管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：362694）
Axygen通用移液器吸头（Corning，Axygen <\ sup>，目录号：T-200-C-L-R）
屏障提示（Fisher Scientific，目录号：02-707-430）
注射器过滤器，0.22微米孔径（KASVI，目录号：K18-230）
比色杯（品牌，目录号：759115）
接种循环
硼硅酸盐管，16×100毫米（DWK Life Sciences，Kimble，目录号：73500-16100）
细菌培养（鼠伤寒沙门氏菌肠炎沙门氏菌SL1344）
HPLC级乙酸乙酯，纯度≥99.7％（Sigma-Aldrich，目录号：34858）
氮气
HPLC级甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
包含360mg吸附剂（WATERS，产品目录号：WAT051910）的C18子墨盒
蒸馏水
磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：P5493-1L）
RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN，目录号：74106）
琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：17850）
QuantiTect反转录试剂盒（QIAGEN，目录号：205311）
MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN，产品目录号：28204）
引物（整合DNA技术）
Power SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，产品目录号：4367659）
盐酸，36.5-38％（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
纯度≥98％的氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
Luria-Bertani（LB）肉汤（BD，目录号：244620）
细菌琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A5306）
链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S9137-25G）
1 N HCl（见食谱）
1 N NaOH（见食谱）
LB肉汤或琼脂（见食谱）
LB与链霉素（见食谱）

设备

数字秤（奥豪斯，型号：SP202）
玻璃瓶（Fisher Scientific，目录号：FB800500）
轨道摇床（BiomiXer，型号：TS-2000A）
刻度玻璃圆筒（Laborglas，目录号：91376）
玻璃烧瓶（Corning，PYREX®，目录号：4100-125）
电子移液管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：9501）
通风橱
旋转蒸发器（Heidolph，目录号：560-01300-00）
37°C培养箱
冰柜，-20°C
P20微量移液器（Gilson，目录号：F123600）
P200微量吸管（Gilson，目录号：F123601）
P1000微量吸管（Gilson，目录号：F123602）
Speed-Vac浓缩器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：SPD131DDA-115）
涡流（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）
pH计（Sigma-Aldrich，目录号：MT51302916）
制造商：梅特勒 - 托利多，产品目录号：51302916。
高压灭菌器
可见范围分光光度计
核酸（紫外）分光光度计
摇床（NOVATECNICA，型号：NT145）
用于96孔板的离心机（Eppendorf，型号：5810，目录号：5810000017）
实时PCR仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4376357）

软件

GraphPad Prism（GraphPad软件）
StepOne软件v2.3（赛默飞世尔科技）

程序

从粪便样品中提取小分子
1. 捐献者应该使用清洁的，不一定无菌的聚丙烯容器收集新鲜的粪便样本，将其存放在冰箱中，并在24小时内将其带到实验室。
2. 一旦粪便样品在实验室中，使用数字秤称重样品。
  注意：可以从任何重量的样品中制备提取物。但是，为了达到测试所需的浓度，我们建议最小样品重量为50克。
3. 将样品转移到干净的玻璃瓶中，而不是无菌。
4. 根据样品的重量，将1体积的乙酸乙酯加入含有样品的玻璃瓶中。
5. 紧紧关闭瓶子，用铝箔包裹，并将其水平放置在定轨摇床中。
6. 使用胶带将瓶子固定在摇床上。
7. 在室温下孵育过夜，将轨道振荡器设置为每分钟50转。
8. 孵化后，将瓶子从振动筛中取出，垂直放在工作台上静置5分钟，以使固体物质沉淀。
9. 使用玻璃吸管小心地将溶剂从瓶中取出并转移到新瓶中。
10. 测量并记录使用刻度玻璃量筒回收的溶剂量。
  注意：不可能回收用于进行该提取的整个体积的乙酸乙酯。这是因为一些溶剂会被粪便样品吸收。
11. 然后将提取物储存在-20°C的冷冻箱中（注1）。
干燥提取物
1. 使用玻璃吸管或Axygen移液器吸头和微量移液器将所需体积的提取物转移至玻璃烧瓶或2-ml Safe-Lock管中。
2. 使用旋转蒸发器或Speed-Vac浓缩器（注2）完全蒸发溶剂注意：由于乙酸乙酯的沸点较低，某些生物活性分子可能对温度敏感，因此建议不要将蒸发器或Speed-Vac的温度提高到37°C以上。 br />
3. 将干燥的提取物储存在-20°C的原瓶（玻璃烧瓶或2毫升塑料管）中（注1）。
纯化具有潜在生物活性的小分子
1. 在室温下解冻干燥的提取物。
  注意：解冻干燥的提取物可能会产生一些水分沉淀。如果是这种情况，可以通过将温和的氮气流施加到烧瓶或管中来干燥沉淀物。
2. 加入1体积的25％甲醇（水溶液）到装有干燥提取物的小瓶中。
3. 用玻璃吸管或移液器吸头刮擦小瓶壁，上下吸移并周期性地彻底振荡小瓶。
4. 取所需数量的C18子弹，并使用注射器在每个药筒中加入2ml甲醇。
5. 使用注射器，通过每个墨盒应用2毫升的水。
6. 每个色谱柱最多应用5毫升提取物。
7. 使用锥形管收集流通物
8. 用4 ml蒸馏水清洗每个色谱柱。
9. 使用2ml增加甲醇浓度的溶液洗脱与树脂结合的分子 - 浓度应由使用者确定，我们建议使用30,40,50,60,70,80,90和100％甲醇（在水中）。
10. 使用锥形或安全锁管收集每个部分
11. 使用Speed-Vac浓缩器完全蒸发溶剂。
12. 将馏分保存在-20°C冷冻箱中直至测试（注1）。
准备含有所需提取物的培养基
1. 应从冷冻机中取出上述所需的提取物或馏分，并将LB培养液加入管中 - 添加量会有所不同，但我们建议从与蒸发溶剂体积相同体积的培养基开始（1x浓度）。
2. 用玻璃吸管或移液管尖端刮擦管壁，上下吸移并周期性地彻底涡旋管。
  注意：有些样品不会完全溶解。由于所用溶剂的性质，一些提取物将具有高脂肪含量。在某些情况下，大量的物质会粘附在管壁上或在培养基中形成不溶性薄片。
3. 使用注射器和0.22微米孔径的过滤器过滤培养基以去除碎屑和任何不溶物质。
4. 测量溶液的pH值。
5. 使用HCl或NaOH将pH调节至约7.3。
6. 加入链霉素以达到100μg/ ml的最终浓度。
7. 使用注射器和0.22微米孔过滤器过滤消毒溶液
8. 将介质保存在室温下直至使用（存放时间超过48小时，我们建议将介质存放在4°C的冰箱中）（注1）。
检测粪便代谢组小分子对细菌生长的影响
1. 使用接种环，从沙门氏菌沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌SL1344的冷冻储液中取少量细菌培养物，并划出含有100μg/ ml链霉素的LB平板。
  注意：SL1344可以从英国公共卫生类型文化国家集合获得，其位于 https://www.phe-culturecollections.org.uk/collections/nctc.aspx 。
2. 在37°C孵育过夜。
3. 使用接种环，取一个沙门氏菌单菌落，并将其转移到大约2毫升含有100微克/毫升链霉素的LB肉汤中，在16×100毫米硼硅酸盐管中。
4. 在37°C振荡培养过夜（225 RPM）。
5. 用磷酸盐缓冲盐水稀释1:10的培养液
6. 测量悬浮液的光密度并乘以10得到的值以获得原始悬浮液的光密度。
7. 计算接种8ml培养基所需的培养物体积，并在0.05nm（OD 600）下达到0.05的起始光密度。
8. 接种所需数量的16×100mm硼硅酸盐试管，其中含有8ml添加了粪便提取物的LB肉汤培养基或LB肉汤培养基和100μg/ ml链霉素。
  注意：如果事先储存在4°C，培养基应在接种沙门氏菌前平衡至室温。
9. 在37°C振荡孵育（225 RPM）。
10. 每30分钟，从每种培养物中取出一小份，并用它来测量和记录培养物的OD 600。
  注意：在初始时间点之后，培养物需要在磷酸盐缓冲盐水中稀释后才能进行测量。应该这样做以确保获得的光密度值落在设备的线性范围内。请注意您的特定分光光度计的线性范围。
11. 使用GraphPad Prism绘制曲线中获得的值，其中y轴表示光密度值，x轴表示孵育时间。
12. 比较曲线以评估提取物是否对细菌生长有任何影响 - 统计分析可以在GraphPad Prism中进行。
检测提取物中存在的小分子对细菌基因表达的影响
1. 使用含有粪便提取物的LB或LB准备与上述完全相同的生长曲线实验 - 每种条件的重复次数可以变化，但我们建议每个条件至少重复4次。
2. 基于之前使用相同粪便提取物进行的生长曲线，将培养物培养至所需的生长阶段 - 我们建议用于RNA提取的培养物处于指数生长阶段。
3. 收集1-2ml的每种培养物并转移到含有2-4ml（2体积）RNAprotect Bacteria Reagent的锥形管中。
4. 手动翻转管5次混合。
5. 让它在室温下静置5分钟。
6. 在5,000 em x g离心5分钟。
7. 丢弃上清液。
  注意：在此阶段，沉淀可以储存在-80°C，并且在接下来的几天内可以继续提取。
8. 根据制造商的推荐，使用RNeasy Mini Kit提取RNA，使用 RNAprotect Bacteria Reagent Handbook（version 01/2015）。
9. 按照 RNAprotect Bacteria Reagent Handbook （01/2015版），包括柱上DNA酶处理。
10. 确定使用紫外分光光度计获得的RNA的量和浓度。
11. 通过聚合酶链式反应（PCR）测试样品中是否存在污染基因组DNA：
  1. 使用Taq聚合酶和靶向所需基因的引物进行常规PCR - 我们推荐使用看家基因gapA（正向：GGCGCTAACTTTGACAAATACGAAGG，反向：AGTCATCAGACCTTCGATGATGCCG; Peixoto等人，2017年））。
  2. 使用1 ng来自沙门氏菌的基因组DNA作为阳性对照，并提取100 ng用于检测的RNA。
  3. 在1.5％琼脂糖凝胶上运行PCR产物。
    注意：使用您首选的核酸染色方法对凝胶进行染色。
  4. 在紫外灯下观察条带 - 在阳性对照中存在预期大小的条带，并且在测试的RNA样品上不存在这样的条带表明没有显着的DNA污染存在。
    注意：在测试样品中存在DNA时，RNA应储存在-80°C。
12. 根据制造商的建议，使用500-1,000 ng的RNA和QuantiTect Reverse Transcription Kit合成互补DNA（cDNA）。
13. 根据制造商的建议，使用MinElute Reaction Cleanup Kit纯化cDNA。
14. 使用紫外分光光度计定量cDNA。
15. 稀释cDNA，使所有样品的浓度为5-10 ng /μl。
16. 使用1 ng cDNA作为模板，靶向所需基因的引物和Power SYBR Green PCR Master Mix进行Real-Time PCR。
17. 使用ΔΔCt方法确定在不存在或存在粪便提取物的情况下生长的样品之间的相对表达水平，并使用gapA基因作为家政对照。

数据分析

为了分析小分子提取物对细菌生长的影响，应将光密度值绘制在y轴代表光密度值并且x轴代表孵育时间的曲线中。这可以使用GraphPad Prism完成，平均值应与标准偏差或平均值的标准误差一起绘制。应该直观比较曲线，以评估小分子是否对细菌生长有任何影响。出于统计目的，我们建议每个条件至少重复4次，并使用双尾不成对的 t - 测试来评估统计显着性。如果一组样本中的数值差别很大，那么可以使用Grubbs的测试检测并移除异常值。（https://www.graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm ）。确定提取物是否对生长具有显着影响是有些主观的，但我们建议使用统计学显着的（<0.05），光密度的25％（或更高）的变化作为一个起点。
为了分析小分子提取物对细菌基因表达的影响，应使用ΔΔCt方法处理通过StepOne软件v2.3从实时PCR设备获得的阈值循环（Ct）值。首先，应从每个被测基因获得的Ct值中减去用管家控制基因获得的Ct值（这里使用 gapA 作为例子）。这应该以样本特定的方式完成，即，，应从相同样本的测试基因Ct中减去来自一个样本的gapA Ct，而不是其他样本。得到的ΔCt应该通过应用公式2 <-ΔCt从其对数形式转换而来。然后将得到的值标准化为对照组的平均值。因此，对照组的平均值应该归一化为1，并且应该相应地比较来自对照组或试验组的每一个值。结果可以绘制成每组平均值的条形图，条形图显示标准偏差或均值的标准误差。如上所述，为统计目的，我们建议每个条件至少重复4次，并使用双尾不成对的 t - 测试来评估统计显着性。如果某些值与同一组样本中的其他值存在很大差异，则可以使用Grubbs的测试（ https://www.graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm ）。如上所述，确定提取物是否具有显着效应可能是主观的，并且应该考虑到所使用的实验模型以及所测试的基因的性质来解释。尽管如此，我们建议使用基因表达的统计显着性（ <0.05），2倍变化作为起点。

笔记

提取物可以储存的时间取决于每种生物活性分子的性质。但是，为避免降解，我们建议将提取物储存最多一个月。
完全蒸发所需的时间取决于样品类型，尺寸和含水量。仅作为参考，我们预期分成1毫升等分试样的样品需要约1-2小时才能完全蒸发，温度设定在37°C。在旋转蒸发器中设置相同温度的50毫升样品需要2-4小时才能完全蒸发。

食谱

1 N HCl（100毫升）

加入3 ml盐酸36.5-38％（Sigma-Aldrich）至97 ml蒸馏水
1 N NaOH（100毫升）
称取4 g纯度≥98％的氢氧化钠（Sigma-Aldrich）并加入100 ml蒸馏水中
LB肉汤或琼脂
1. 称取25克LB粉末，并在玻璃瓶中加入1升蒸馏水。
2. 对于LB琼脂，将15克琼脂加入到溶液中。
3. 通过晃动瓶子来充分混合
4. 测量溶液的pH值并使用HCl或NaOH将其调整至7.3。
5. 使用高压灭菌器灭菌培养基
LB与链霉素
1. 称重100毫克链霉素
2. 加900μl水
3. 使用涡流彻底混合
4. 测量使用微量移液器和移液枪头获得的体积
5. 添加更多的蒸馏水，以获得1毫升的最终体积
6. 每1ml LB肉汤或琼脂加入1μl该溶液以获得100μg/ ml的终浓度

致谢

这项工作得到了国家科学和技术发展委员会（CNPq-巴西），里约热内卢州政府资助机构FAPERJ和巴西卫生部的资助。作者声明不存在利益冲突。

参考

Antunes，L.C.和Ferreira，R.B.（2009）。细菌间的细胞间通讯 Crit Rev Microbiol 35（ 2）：69-80。
Antunes，L. C.，Ferreira，R. B.，Buckner，M. M.和Finlay，B. B.（2010）。细菌毒力的群体感应微生物学 156（Pt 8）：2271-2282。
Antunes，L. C.，Davies，J. E.和Finlay，B. B.（2011a）。胃肠道中的化学信号传导 F1000 Biol Rep 3：4.
Antunes，L.C.，Han，J.，Ferreira，R.B.，Lolic，P.，Borchers，C.H。和Finlay，B.B.（2011b）。抗生素治疗对肠道代谢组的影响抗菌剂Chemother em> 55（4）：1494-1503。
Antunes，LC，McDonald，JA，Schroeter，K.，Carlucci，C.，Ferreira，RB，Wang，M.，Yurist-Doutsch，S.，Hira，G.，Jacobson，K.，Davies，J.，Allen -Vercoe，E.和Finlay，BB（2014）。人类肠道代谢组的抗微生物活性 MBio 5 （4）：e01183-01114。
Kashyap，P.C.，Chia，N.，Nelson，H.，Segal，E。和Elinav，E。（2017）。个性化医学前沿的微生物群。 Mayo Clin Proc 92（12）：1855-1864。
Kundu，P.，Blacher，E.，Elinav，E.和Pettersson，S.（2017）。我们的肠道微生物群：不断发展的内在自我 Cell 171（7）：1481-1493。
Peixoto，RJM，Alves，ES，Wang，M.，Ferreira，RBR，Granato，A.，Han，J.，Gill，H.，Jacobson，K.，Lobo，LA，Domingues，R.，Borchers，CH， Davies，JE，Finlay，BB和Antunes，LCM（2017）。抑制沙门氏菌宿主细胞侵入人类粪便中的芳香族小分子代谢组。 Appl Environ Microbiol 。
Sekirov，I.，Russell，S.L.，Antunes，L.C和Finlay，B.B.（2010）。健康与疾病中的肠道菌群 Physiol Rev 90 （3）：859-904。