材料和试剂

一般实验室材料，包括：
尼龙网（Solarbio，目录号：YA0964）
培养皿（9厘米）
方形培养皿（10×10厘米）
漏斗（传统型，上部直径：8厘米）
1.5 ml微量离心管（USA Scientific，目录号：4036-3204）
制造商：Eppendorf，产品目录号：022363204。

15 ml离心管（Corning，目录号：430790）
50 ml离心管（上海柯尔根公司，产品编号：KG2821）
移液器吸头
微孔带（3M，Micropore TM TM，目录号：1530S-1）
营养土（用于蔬菜的Miracle-Gro 花园土，总N为0.68％，P 2 O 5：0.27％和K 2
O 0.36％）
番茄（ Solanum lycopersicum ）cv M82
B中。灰霉病 B05.10
V8果汁（坎贝尔，100％原汁原味的蔬菜汁）
碳酸钙（CaCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：V900138）
细菌琼脂（BD，Bacto TM，目录号：214010）
真菌蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：77199）
磷酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：342483）
麦芽糖（Sigma-Aldrich，目录号：M5885）
2x V8琼脂培养基（见食谱）
SMB介质（请参阅食谱）
0.8％琼脂培养基（见食谱）

设备

移液器（Gilson，Pipetman®） G）
水浴（益恒，型号：DK-80）
高压灭菌器（松下医疗，型号：MLS-3781L）
定制的透明塑料盒（材料：聚甲基丙烯酸甲酯，L / W / H：50/50/50厘米，顶部开口，图1A）或任何可替代使用的培养箱
离心机（Eppendorf，型号：5810 R和5424）
显微镜（ZEISS，型号：Axio Imager Z2; 20x物镜规划-APOCHROMAT; 10倍物镜EC计划-NEOFLUAR）或其他光学显微镜
计数室（QIUJING ® KB-K-25,0.1 mm，1/400 mm 2 ）

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）< br />
Microsoft Excel

程序

制备感染的秧苗
1. 种子处理和发芽
  1. 将番茄种子放入干酪布或尼龙袋中，然后在50°C水浴中孵育25分钟。将种子简短地浸入自来水中冷却至室温。
    之后，将种子转移到10％磷酸三钠（TSP）溶液中15分钟，并在高压灭菌蒸馏水中室温冲洗（至少5次）5分钟以除去残留的消毒剂。
  2. 在室温下在黑暗中在湿滤纸上发芽番茄种子48小时（图1B）。将萌发的种子播种在土壤中，并在25℃16小时光照和18℃黑暗8小时的循环下在生长室中培养。（在我们的生长室中光循环的光强度为200μM光子m-2秒-1）。对于疾病测定，番茄幼苗生长4周（图1C）。
    注意：在我们的实验室中，我们使用Miracle-Gro ® 用于植物培育的Garden Soil（用于蔬菜）无菌且劳动力成本较低。由于植物在这片土壤中生长得更快，因此我们使用4周植物进行疾病分析。
图1.用于感染的番茄幼苗的制备A.用于植物接种的定制透明塑料盒（用黑线突出的边缘），具有50×50×50厘米（cm）。 B.在湿滤纸上的番茄种子在处理后发芽。比例尺= 1厘米。 C.用于接种测定的4周龄番茄植物。
真菌菌株和生长条件
1. B中。在孢子收集之前，在本研究中使用的B05.10在20℃下在12-h光周期下常规维持在2x V8琼脂上21天（图2A）。
2. 通过用移液管端部擦洗板来收获孢子，直到尖端具有约2ml量的组织，然后悬浮在5ml 1％SMB中。通过漏斗上的尼龙网过滤悬浮液以去除菌丝体（图2B，视频1）。
  
  视频1.如何收集孢子
3. 用计数室测量孢子浓度。图2B显示了我们在20倍物镜下使用的计数室的小方格。计数室的样本深度为0.1毫米。如图2B所示，小方形是1/400mm 2。它使每个小方块的体积为2.5×10 -7毫升/平方。小方块中的每个孢子等于4×10 6孢子/ ml。
  调整浓度至1×10 6孢子/毫升接种。
4. 设置1％SMB无孢子溶液作为对照处理。
植物感染分析
选择4周龄的植物用于感染测定（图1C）。
对离体叶片进行致病性测试：
1. 单独收获4周龄植物的第三片真叶的小叶，并轻轻地置于含有25ml 0.8％琼脂的培养皿中，并将叶柄嵌入培养基中（视频1）。
2. 在主中脉的右侧或左侧接种单个5μl孢子悬浮液小滴（视频2）。盖上盖子，然后用Micropore胶带密封。
  
  视频2.如何在媒体
  上放置已分离的宣传单
3. 将板放置在与植物生长相同的条件下（图2C）。感染后3天通过扫描板来监测疾病发展。使用ImageJ测量感染区域的大小。
对活体植物进行致病性测试
1. 将4周龄的植物置于透明的盒子中（图1A），使湿度保持在100％。用B接种第三片真叶。孢。每个小叶感染主中脉右侧或左侧的单个5μl孢子悬浮液滴（视频3）。将盖子盖上盖子，并保持在与植物生长相同的条件下（图2D，视频3）。
  
  视频3.用一滴孢子悬液感染小叶
2. 在感染后（HAI）的不同时间点（0,3,6,9,12,18,24,30,36 h）收集感染的小叶以用于分析抗性基因表达或在感染后3天（DAI）监测疾病通过对传单成像进行发展。
3. 然后按照imageJ用户指南（ https://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html ）。
图2. B。灰霉病接种试验。：一种。 3周龄的 B。在2×V8培养基上的灰霉病菌株，比例尺为1cm。 B.乙的孢子。 Cinerea 放在计数室中，比例尺为50μm。 C.对离体叶片进行致病性试验，右小叶接种单个5μl孢子悬浮液（10 6孢子/ ml）滴在主中脉的右侧或左侧，而左侧小叶被设定作为控制。比例尺代表1厘米。 D.对活植物的致病性测试，每个小叶在主中脉的右侧或左侧接种单个5μl孢子悬浮液（10 6孢子/ ml）液滴。由 B感染的区域。开发3天的cinerea 用红色圆圈突出显示。

数据分析

患病传单的图像被导入ImageJ软件。使用“多边形选择”来选择图像上的病变区域。然后从软件imageJ的“分析”菜单中选择“测量”功能来计算病变面积。数据分析在Microsoft Excel软件中进行。
进行了三次独立实验，每个实验至少包括六次重复。分析来自独立实验的所有数据。统计学测试包括平均值，STDEV和excel中的Student's t 测试计算。 0.05的测试值被认为是显着性差异，而0.01是非常显着的差异。在实验中，叶表面上的一滴孢子悬浮液应该发展成圆形的病变病灶。在某些情况下，液滴会随着叶脉扩散并发展为不规则形状的病变，应避免进行分析。否则，收集所有样品进行数据分析。

笔记

新感染的孢子应该用于感染。
孢子悬浮液应该轻轻地放在叶面上，以防止液体与微小的叶脉扩散。
对于分离的叶子感染，小叶应贴在琼脂培养基上以保持湿度。感染后，带感染叶片的培养基板应用透气胶带密封，以防止叶片无氧呼吸并保持水分。

食谱

2x V8琼脂培养基
360毫升V8果汁
2.00克CaCO3
20克细菌琼脂
将ddH <2> O加入1,000 ml

在121°C高压灭菌15分钟
SMB媒体
10.00克Mycological蛋白胨
40.00克麦芽糖
将ddH <2> O加入1,000 ml
最终pH（在25℃）：5.6±0.2

在121°C高压灭菌15分钟
0.8％琼脂培养基

8.00克琼脂将ddH <2> O加入1,000 ml

在121°C高压灭菌15分钟

致谢

这项工作得到了山东省泰山学者项目中国国家重点研究发展计划（2016YFD0100603-10）的支持。该协议根据以前的工作进行了适当调整（Du等人，2017年）。作者声明他们没有竞争利益。

参考

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