材料和试剂

移液器吸头（Denville Scientific，产品目录号：P1096-FR，P1121，P1122，P1126）
1.5ml微量离心管（Denville Scientific，目录号：C2170）
手套和实验室外套（Denville Scientific，目录号：G4162; Medline Industries，目录号：83044QHW）
蛋白酶K，RNA级（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：25530049）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4509-1KG）
苯酚溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4557）
氯仿（Fisher Scientific，目录号：BP1145-1）
乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2889-1KG）
乙醇（EtOH）（AmericanBio，目录号：AB00515-00100）
UltraPure TM DNase / RNase-Free蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10977015）
琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15510027）
TNT 偶联的兔网织红细胞裂解液（RRL）（Promega，目录号：L4610）
EasyTag TM L - [35 S] - 甲硫氨酸（PerkinElmer，目录号：NEG709A001MC）
RNasin Plus Plus核糖核酸酶抑制剂（Promega，目录号：N2611）
RNaseZap TM RNase去污溶液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9780）
RNase A，DNase和无蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EN0531）
NEBuffer 3（New England Biolabs，目录号：B7003S）
碱性磷酸酶，小牛肠（CIAP）（New England Biolabs，目录号：M0290S）
Tris基地（Fisher Scientific，目录号：BP152-10）
乙二胺四乙酸，EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
氟化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7920）
焦磷酸四钠十水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S6422）
β-甘油磷酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：G6251）
原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
cOmplete TM TM，不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：04693132001）
TE缓冲液（见食谱）
10倍磷酸酶抑制剂（PPI）（见食谱）
25倍蛋白酶抑制剂（见食谱）

设备

移液器（Gilson，P1000，P200，P20，P2）
通风橱（如，Protector Xstream Laboratory Hood，Labconco）
30°C / 37°C烤箱（SciGene，Robbins Scientific，型号：400型）
微量离心机（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，型号：accuSpinTM Micro 17）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 1000）

程序

在兔网织红细胞裂解液中进行无RNA酶的体外翻译质粒
1. 用蛋白酶K和SDS处理质粒DNA以去除质粒DNA中的任何污染性RNA。如下表所示，在50℃下用SDS（终浓度为0.6％w / v）和蛋白酶K（终浓度为0.4μg/μl）孵育HBc表达质粒30分钟。
  
  注意：
  1. 在加入蛋白酶K之前，首先将TE缓冲液中的20％SDS稀释。
  2. 任何含有可用于使用同源噬菌体RNA聚合酶进行体外转录的噬菌体启动子（以下实例中为T7）的质粒载体可用于在该系统中进行偶联转录和翻译。 br />
2. 在消化反应中加入等量（200μl）的苯酚，充分混合并在室温下以最大速度（17,000×g克）旋转5分钟。将含水层（顶层）转移到新管中并重复此步骤。
3. 如步骤A2所述，加入等体积的氯仿并萃取一次
4. 测量水溶液并加入适量的3M乙酸钠（终浓度为0.3M）和100％乙醇（终浓度为70％），充分混合并在-20℃下孵育30分钟。在4℃下以最大速度（17,000×gg）离心20分钟，并用1ml 70％乙醇分别洗涤沉淀3次，以最大速度在4°下旋转10分钟C.
5. 用30μl无RNase的水重悬DNA。用分光光度计（NanoDrop TM TM 1000）测量DNA浓度并将DNA浓度调节至1μg/μl，然后通过琼脂糖凝胶电泳验证DNA完整性。
体外翻译兔网织红细胞裂解物
使用TNT 偶联的兔网织红细胞裂解物（RRL）体外翻译系统（Promega）按制造商推荐的方法表达HBc蛋白。
1. 翻译工具包的准备
  1. 将TNT RNA聚合酶（T7）置于冰上。
  2. 通过手工加热迅速融化TNT 兔网织红细胞裂解液并立即置于冰上。
  3. 在RT（25°C）下解冻其他组分并置于冰上。
  注意：
  1. TNT ® 反应缓冲液可能在解冻后放置在冰上。通过在室温下涡旋30秒来重新溶解沉淀。
  2. 不要将裂解物冻融两次以上。
  3. 任何未使用的裂解物应在解冻后尽快在干冰/乙醇浴中重新冷冻，以尽量减少翻译活性的损失。
2. 按照下表将反应组分装入1.5 ml离心管中。
  
  注意：小规模反应可以通过按比例减少所有组分来进行。
3. 在30°C孵育反应90分钟
4. 将反应置于冰上并进行组装步骤或将反应保存在-80°C以备将来使用。
  注意：
  1. 除了实际的翻译孵育之外，所有处理裂解物组分的操作都应在4°C或冰上进行。
  2. 在所有操作中都需要无核糖核酸酶的环境：
    1. 向所有TNT添加RNasin ® 核糖核酸酶抑制剂 ® 裂解反应以防止RNA降解。
    2. 微量离心管和移液管吸头应该不含RNase。
    3. 使用清洁剂（如RNaseZAPTM）清洁工作台和手套以去除RNase。
RRL
体外衣壳装配我们最近的研究表明HBc NTD和CTD都是HBV R衣壳装配所需的生理学低HBc浓度翻译成RRL（Ludgate等人，2016）。 CTD可能通过RNA结合和蛋白质 - 蛋白质相互作用在这些条件下促进装配。此外，CTD受RRL中内源性宿主激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化作用，其进一步调节衣壳组装。
为了证实CTD在RRL中的衣壳组装中的作用，特别是其RNA结合活性和通过磷酸化状态对组装的调节，如图1所示的以下处理应用于HBc体外组装在RRL中检测。

图1. RRL中体外衣壳装配的条件模拟，将反应物在37℃孵育16小时而不进行任何处理。 CIAP，CIAP（10 U /μl）在组装培养过程中加入到反应中。加入CIAP + RNase，RNA酶A（0.1mg / ml）并在CIAP温育后再温育1小时。 RNase + CIAP，反应在CIAP孵育前用RNA酶A处理。 PPI，PPI（1x）在组装孵化过程中添加。 PPI，磷酸酶抑制剂的混合物（见下面的食谱），CIAP，小牛肠碱性磷酸酶。
1. 模拟孵化
  1. 按照下表将反应组分装入1.5 ml离心管中。
    
    注意：PI，蛋白酶抑制剂的混合物（见下面的食谱）。
  2. 在37°C孵育反应16小时。
  3. 将反应置于冰上并进行分析步骤或将反应保存在-80°C以备将来使用。
2. CIAP孵化
  1. 按照下表将反应组分装入1.5 ml离心管中。
  2. 在37°C孵育反应16小时。
  3. 将反应置于冰上并进行分析步骤或将反应保存在-80°C以备将来使用。
3. CIAP之后是RNase孵化
  1. 按照下表将反应组分装入1.5 ml离心管中。
  2. 在37°C孵育反应16小时。
  3. 向装配反应中加入0.1μlRNA酶A（10 mg / ml），并在37°C下再孵育1 h。
  4. 将反应置于冰上并进行分析步骤或将反应保存在-80°C以备将来使用。
4. RNase随后进行CIAP培养
  1. 按照下表将反应组分装入1.5 ml离心管中。
  2. 在37°C孵育反应1小时。
  3. 向装配反应中加入1μlCIAP（10 U /μl），并在37°C下再孵育16 h。
  4. 将反应置于冰上并进行分析步骤或将反应保存在-80°C以备将来使用。
5. PPI孵化
  1. 按照下表将反应组分装入1.5 ml离心管中。
  2. 在37°C孵育反应1小时。
  3. 将反应置于冰上并进行分析步骤或将反应保存在-80°C以备将来使用。

笔记

所有使用[35S]甲硫氨酸的工作应在所有操作过程中采取适当的预防措施和个人防护装备，如手套和实验室涂层。建议在通风橱中打开库存，因为[35S]甲硫氨酸是挥发性的。在使用[35S]甲硫氨酸后，应检查工具和设备，如PIPETMAN，离心机和培养箱的污染情况。

数据分析

如图2和Ludgate等人2016所示，可以使用SDS-PAGE，琼脂糖凝胶电泳和Western印迹检查HBc和衣壳组装体在该无细胞系统中的表达。 br />

图2.在不同条件下RRL中的HBV衣壳装配。 WT HBc蛋白质在RRL中翻译，并且翻译反应混合物通过琼脂糖凝胶（1％）电泳（A）或SDS-PAGE（12.5％）（B）解析而无需任何进一步处理（输入）（（第1泳道）或用NEBuffer 3在37℃过夜（模拟）（泳道2），NEBuffer 3加CIAP在37℃过夜（泳道3），NEBuffer 3加CIAP在37°过夜（RNase + RNAP）（第4道），RNase处理1小时，然后用NEBuffer 3加CIAP在37°C过夜（RNase + CIAP）（泳道5），或用磷酸酶抑制剂在37°C过夜（PPI）（泳道6）。所有泳道都含有2μl翻译产物。通过放射自显影检测35 S标记的HBc蛋白。 C，HBc亚基; C-deP，去磷酸化的HBc亚基;钙，衣壳。（改编自Ludgate等人，2016年）

食谱

TE缓冲区
10 mM Tris-HCl pH 8.0
1 mM EDTA
10倍磷酸酶抑制剂（PPI）
100 mM氟化钠
500 mMβ-甘油磷酸酯
100 mM焦磷酸钠
20 mM原钒酸钠
25倍蛋白酶抑制剂
1片cOmplete TM不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物溶于2ml不含DNase / RNase的dH 2 O 2中。

致谢

该协议改编自Ludgate等人，2016年。这项工作得到了国立卫生研究院的公共卫生服务资助（R01 AI043453致J.H.）的支持。 K. L.由浙江理工大学科学研究基金会（15042169-Y）资助。作者宣称没有利益冲突。

参考

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