材料和试剂

0.5-10 L移液器吸头（Corning，Axygen ®，目录号：T-300）
10-200 ml移液枪头（Greiner Bio One International，目录号：739290）
100-1,000毫升枪头（Greiner Bio One International，目录号：686290）
T 175细胞培养瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：159910）
T75细胞培养瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：156499）
150mm圆形组织培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：168381）
50 ml Falcon管（Greiner Bio One International，目录号：227261）
5毫升平头注射器（5毫升/立方厘米，鲁尔滑，Cellotron，https://dcellotron.en.ec21.com/）
15 ml Falcon管（Greiner Bio One International，目录号：188271）
Nalgene Oak Ridge高速离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：3114-0030）
常规1.5ml微量离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
低粘附微量离心管（Eppendorf，目录号：022431081）
12毫米玻璃盖玻片（电子显微镜科学，目录号：72231-10）
玻璃载玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：6776215）
50毫升注射器（Terumo，目录号：SS * 50LE）
0.22μm过滤器（Merck，目录号：SLGP033RS）
HeLa S3人宫颈癌细胞（ATCC，目录号：CCL-2）
胰蛋白酶溶液（0.05％w / v，摩羯座科学，目录号：TRY-1B10）
0.5％胰蛋白酶（胰蛋白酶-EDTA，10×储备，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15400054）
蛋白酶抑制剂PMSF（BDH，目录号：442172C）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
5 M NaCl
1％（w / v）多聚甲醛
小鼠抗核磷蛋白-1（NPM1）抗体（Sigma-Aldrich，目录号：B0556）
兔抗纤维蛋白B1（LB1）抗体（Abcam，目录号：ab16048）
兔抗组蛋白H1.2（Abcam，目录号：ab17677）
（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-7292）
兔抗H1.x抗体（Abcam，目录号：ab31972）
山羊抗小鼠IgG（Cy3-缀合的）（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：115-165-003）
山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 488-结合的）（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：115-545-003）
安装介质（Vector实验室，目录号：H-1200）
任何透明指甲油（我们使用Daiso日本指甲油透明，10毫升瓶，台湾制造）
12.5％（w / v）凝胶
氯化钠（NaCl）（Merck）
氯化钾GR（KCl）（默克）
磷酸氢二钠（Merck）
蔗糖（第一BASE实验室，目录号：BIO-1090-1kg）
蔗糖（默克）
Tris（默克）
Tris碱（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：4109-02）
氯化镁六水合物（Merck，目录号：1058331000）
氯化镁六水合物（MgCl 2·2H 2 O）（Merck）
DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12430054）
胎牛血清（FBS，GE Healthcare，HyClone，目录号：SV30160.03）
注：我们购买了FBS，并通过在56℃孵育30分钟产生热灭活的FBS。
青霉素 - 链霉素（100x原液，PAN Biotech，目录号：P06-07100）
L-谷氨酰胺（200mM，100x储备液，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）。
PBS，pH 7.4（见食谱）
0.25M蔗糖缓冲液，pH7.4（见食谱）
2.2 M蔗糖缓冲液，pH 7.4（见食谱）
DMEM培养基（见食谱）

设备

1000升移液器（Eppendorf，型号：Research plus，产品目录号：3120000062）
200升移液器（Eppendorf，型号：Research ®plus，产品目录号：3120000054）
加湿的细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma TM Steri-Cycle TM CO 2，培养箱，目录编号：371）
均质机（Isobiotec Precision Engineering，德国海德堡）
台式微量离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge 22R离心机，目录号：368831）
台式摆动桶式离心机（Eppendorf，型号：5810 R，目录号：5811000320）
具有JA-20转子的Beckman Coulter离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-25，目录号：363102）
BSL-2细胞培养箱（Gelman，型号：Bioessential Class II系列A2型层流BSC，http://gelmansingapore.com/product/bioessential-class-ii-type-a2-series-laminar-flow-biological-safety -cabinets /）
FluoView FV1000共聚焦显微镜
酷/ SNAP HQ2图像采集相机（奥林巴斯）

软件

FV-ASW 1.6b软件
Imaris软件（Bitplane AG）

程序

细胞匀浆的产生
1. 培养HeLa细胞在T-75烧瓶中，在37℃潮湿的BSL-2培养箱中，含有25ml DMEM培养基进行融合。
2. 将细胞等分为5个150mm圆形培养皿，并在DMEM培养基（25ml /平板）中培养至汇合。
3. 取出培养基并用10 ml PBS清洗每个培养板。
4. 加入2ml 1x胰蛋白酶溶液以覆盖每个平板的表面，并在37℃下在湿润细胞培养箱中孵育平板2分钟。
5. 水平轻敲平板以悬浮细胞，并向每个平板添加6毫升培养基。
6. 从每个板收获细胞，并结合在50ml Falcon管中。
7. 在400×g离心5分钟收获细胞。
8. 将细胞重新悬浮在50ml PBS中并通过在400×g下离心5分钟进行洗涤。重复此步骤一次。
9. 将细胞重悬于4ml含有蛋白酶抑制剂PMSF（0.25mM）的0.25M蔗糖缓冲液中并移液以获得单细胞悬液。
10. 使用10μm金属球组装一个isobiotec细胞匀浆器，并在冰上预冷细胞匀浆器（图1）。
  
  图1. Isobiotec细胞匀浆器的组装A. A.包括金属球（10μm间隙）的均化器的部分在白色管中; B.侧视图; C.金属球被放置在中央通道中。 D.完成均质器的组装。 E.每个出口配有5毫升注射器。 F.将2ml细胞悬液加入到一个注射器中（在此示例中使用水）。 G.按压将细胞悬液通过装有金属球的中央通道送入另一个注射器。
  在收集细胞匀浆前再重复11次
11. 在匀浆器上安装两个出口，每个用5毫升注射器。
12. 从一个注射器上卸下柱塞以添加2毫升细胞悬液。
13. 通过细胞悬液12次通过均质器
14. 将匀浆的细胞裂解物转移到15ml Falcon管中并用剩余的细胞悬液重复均质化。
15. 用1ml的0.25M蔗糖缓冲液将均质器各洗涤2次，并与裂解物混合。
核的分离
1. 在600×g和4℃下离心细胞匀浆10分钟以沉淀细胞核。
2. 将沉淀重新悬浮在Nalgene Oak Ridge高速离心管中的5 ml 2.2 M蔗糖缓冲液中。
3. 在50,000×g和4℃下离心30分钟。
4. 去除上清液并加入2ml 0.25M蔗糖缓冲液以冲洗沉淀物附近的管道区域。
5. 除去蔗糖缓冲液而不影响颗粒。
6. 将沉淀重新悬浮于4ml 0.25M蔗糖缓冲液中并转移至15ml Falcon管中。
7. 在600×g和4℃下离心5分钟。
核信封（NE）的消耗
1. 制备含Triton的蔗糖缓冲液。
  1. 在15毫升管中沿管壁添加0.1毫升Triton X-100。
  2. 加入10毫升0.25M蔗糖缓冲液至管中，涡旋至Triton与蔗糖缓冲液充分混合。
2. 重悬于4毫升含Triton的蔗糖缓冲液中的核沉淀，并在冰上孵育1小时。
3. 在600×g和4℃下离心5分钟。
4. 在另一个5毫升含有Triton的蔗糖缓冲液中重悬沉淀。
5. 在600×g和4℃下离心5分钟。
6. 用0.25M蔗糖缓冲液洗涤这些Triton提取的细胞核（TxN）2次
7. 然后将沉淀重悬于0.9ml 0.25M蔗糖缓冲液中。
核支架的提取（图2）
1. 添加0.1毫升5 M NaCl溶液到核悬浮液中（立即在界面处形成胶体凝胶）。
2. 使用1,000 L Eppendorf移液管强力吸取20-30次，直到整个悬浮液变成均匀的胶体凝胶。
3. 加0.5 ml含0.5 M NaCl的0.25 M蔗糖缓冲液和移液管使其均匀
4. 如果清楚地观察到的话，以2000μgxg离心10分钟并回收少量上清液。
5. 加入0.5 ml 0.25 M蔗糖缓冲液，胶体凝胶应立即收缩。
6. 。使用0.2毫升移液管吸头强力打凝胶，使凝胶继续收缩。
7. 在2000gxg和4℃下离心10分钟并回收澄清的上清液。
8. 再加入0.5 ml的0.25 M蔗糖缓冲液，继续捅碎，直至其停止收缩（它应该看起来像一个棕色和不透明的碎片）。
9. 再次离心并将所有上清液合并为提取物。
10. 测量组合的TxN提取物或TxNE的A 280吸收。它应该在1.0-2.0范围内。
11. 将TxNE分装在无粘性1.5-ml微管中，并保存在-80°C。
  
  图2.从细胞核中提取TxNE A.由6×10 8个HeLa细胞在1.35ml 2.5M蔗糖缓冲液中产生的单细胞悬液。 B.加入0.15ml 5M NaCl后，界面快速向上移动，在30秒内得到透明的较低相。 C.在不到1分钟的时间内剧烈吹打约30次后，整个细胞悬液变成单胶体凝胶。 D.将0.75ml含有0.5M NaCl的0.25M蔗糖缓冲液加入到凝胶中并通过轻敲约20次进行混合。 E.在2,000×g下离心10分钟，从顶部回收〜0.2ml上清液。 F.加入0.75ml的0.25蔗糖缓冲液（不含额外的NaCl）并剧烈混合1-2分钟以观察凝胶收缩。用吸管上的10-200μL吸头将凝胶打出20-50次，直到凝胶停止收缩。在2,000×g下离心10分钟并收集上清液。 G.将0.75ml的0.25M蔗糖缓冲液加入到沉淀中。 H.继续〜50次，直到颗粒收缩成不规则碎片。一些较小的碎片也是可见的。 I.在1,000×g下离心10分钟以回收上清液。 J.上清液合并为TxNE，沉淀通常是提取的染色质，保留细胞DNA和核心组蛋白。
  注意：为了更清楚地显示每个步骤中的样品状态，我们已经将方案主体文本中描述的溶液体积扩大了1.5倍以用于照片。 br />

数据分析

TxNE的通常蛋白质谱高度一致（Chen等人，2018）。在TxNE隔离期间，可以监视某些步骤的一致性。首先，通过2.2 M蔗糖离心后分离的细胞核可以通过共聚焦显微镜检查免疫染色特征性NL蛋白lamin B1和特征性核仁蛋白核磷蛋白-1（NPM1）（图3）。尽管核仁有时可能变大，但分离的细胞核在LB1定义的NL中大部分保持连续。细胞核在形态上大部分保持椭圆形。这些细胞核应该没有波形蛋白，尽管如果细胞核未通过2.2M蔗糖缓冲液离心，它通常与核表面显着关联。尽管这些NE耗尽的核倾向于形成簇，但TxN应保持个体。 LB1定义的NL应该大部分是连续的，尽管TxN的形状在形态上可以不是椭圆形（图3）。

图3.分离的和Triton提取的细胞核的完整性将HeLa细胞匀浆并通过2.2-M蔗糖缓冲液离心分离细胞核。将核用12-mm玻璃盖玻片在冰上孵育5分钟，然后在1％（w / v）多聚甲醛中固定30分钟。然后将细胞核在PBS中的1％（v / v）Triton X-100中温育30分钟。将细胞核再悬浮于含有1％（v / v）Triton X-100的0.25M蔗糖缓冲液中并在冰上温育1小时以产生Triton提取的细胞核（TxN）（右图）。 TxN在0.25M蔗糖缓冲液中洗涤，然后在冰上用12-mm玻璃盖玻片孵育5分钟。将盖玻片在1％（w / v）多聚甲醛中固定30分钟。首先将所有盖玻片与小鼠抗NPM1和兔抗LB1抗体孵育30分钟，洗涤后用山羊抗兔（Alexa Fluor 488，绿色）和抗小鼠（Cy3，红色）孵育30分钟， IgG抗体。洗涤后，使用含DAPI的VectorShield培养基安装盖玻片，并使用配备100x油物镜（孔径1.45）和Cool / SNAP HQ2图像采集相机（Olympus）的FluoView FV1000共焦显微镜观察。使用FV-ASW 1.6b软件捕获图像，并使用Imaris软件（Bitplane AG）进行分析。比例尺= 5微米。
TxNE不包含显着水平的核心组蛋白（Chen等，<2018年）。然而，连接子H1组蛋白包含在此提取物中（图4）。小的LB1在TxNE中被提取（图4）。尽管LB1作为片段分散在扩展的染色质中，但它仍与提取的染色质相关（Chen等人，2018）。相反，lamin A / C用TxNE有效提取（图4）。

图4.核染色质网络中核蛋白的选择性洗脱使用Triton X-100分离核并去除NE。用含有100,200,300,400或500mM NaCl的0.25M蔗糖缓冲液提取这些去除NE的细胞核（TxN）。等体积的上清液在12.5％（w / v）凝胶上进行SDS-PAGE并通过Western印迹分析。还包括用于提取的胞质溶胶部分和TxN作为对照。使用的所有抗体都是从Abcam获得的亲和纯化的多克隆兔抗体。

笔记

如上所述，该协议具有高度的可重复性。然而，如果单细胞悬液未达到，研究人员在细胞匀浆过程中可能会遇到困难。
该协议针对HeLa细胞进行了优化。对于其他细胞类型，需要优化金属球直径。通过对LB1，染色质和NPM1的简单免疫染色可以评估由此产生的细胞核的质量。
应通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色检查TxNE以评估蛋白质谱中的一致性（Chen等人，2018）。

食谱

PBS（pH 7.4）
137mM NaCl
2.7 mM KCl
10 mM磷酸氢二钠
0.25 M蔗糖缓冲液（pH 7.4）
0.25 M蔗糖
10 mM Tris
5.0mM MgCl 2

通过0.22μm过滤器进行过滤并保存在4°C
2.2 M蔗糖缓冲液（pH 7.4）
2.2 M蔗糖
10 mM Tris
5.0mM MgCl 2

通过0.22μm过滤器进行过滤并保存在4°C
DMEM培养基

450毫升的DMEM培养基 50毫升胎牛血清（FBS）
5毫升的青霉素 - 链霉素（100倍股票）
5毫升的L-谷氨酰胺（200毫米，100倍股票）

致谢

作者感谢Shu Ying Lee在共聚焦显微镜中的帮助。该项目得到了新加坡国立大学卫生系统基础研究基金（NUHSRO / 2011/005 / STB / B2B-01）和国家医学研究委员会拨款（NMRC / OFIRG / 0013/2016）的支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Chen，J.，Teo，B.H.D.，Cai，Y.，Wee，S.Y.K。和Lu，J。（2018）。连接组蛋白H1.2是核仁组织区域的一个新组分。 < J Biol Chem 293（7）：2358-2369。
Fischer，R.S。和Fowler，V.M。（2015）。主题minireview系列：2015年细胞骨架的状态。 J Biol Chem 290（28）：17133-17136。
Gasser，S.M。（2002）。可视化间期细胞核中的染色质动力学 Science 296（ 5572）：1412-1416。
Gruenbaum，Y.和Foisner，R.（2015）。 Lamins：在核力学和基因组调控中具有基本功能的核中间丝蛋白 Annu Rev Biochem 84：131-164。
Hernandez-Verdun，D.（2011）。细胞周期中核仁的装配和拆卸 Nucleus 2（3）：189-194。
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Laemmli，U.K。，Kas，E.，Poljak，L。和Adachi，Y。（1992）。支架相关区域：染色质结构环和功能区的顺式作用决定簇。 Curr Opin Genet Dev 2（2）：275-285。
Pederson，T。（2011）。核仁。 Cold Spring Harb Perspect Biol 3（ 3）。
Shaw，P.J。和Jordan，E.G。（1995）。核仁。
Trimbur，G.M。和Walsh，C.J。（1993）。核仁组分在体外重新缔合过程中产生的类核仁形态 J细胞生物学 122（4）：753-766。