材料和试剂

细胞培养瓶（Greiner Bio One International，目录号：658175）
50 ml离心管（VWR，目录号：89039-658）
超清晰超速离心管（Beckman Coulter，目录号：344061）
四个5毫升血清移液器（VWR，目录号：89130-896）
一个9英寸的火石玻璃巴斯德吸管（VWR，目录号：14672-380）
15 ml离心管（VWR，目录号：89039-666）
1.5毫升管
葡萄酒软木塞
剃须刀刀片（VWR，目录号：55411-050）
两个冰桶（VWR，目录号：10146-202）
HEK293T细胞（Sigma-Aldrich，目录号：85120602-1VL）
去离子水
PBS缓冲液（VWR，目录号：97062-948）
Versene解决方案（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15040066）
氮气
OptiPrep（60％溶液，Sigma-Aldrich，目录号：D1556-250ML）
抗calnexin（Abcam，目录号：ab92573）
抗钠钾ATP酶（Abcam，目录号：ab76020）
小鼠抗兔二抗（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2357）
Clarity TM Western ECL底物（Bio-Rad Laboratories，目录号：1705060）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10812846001）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：BP358-1）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：BP214-500）
氯化钙（CaCl 2 2）（Fisher Scientific，目录号：C614-500）
蛋白酶抑制剂迷你片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：A32955）
蔗糖（VWR，目录号：97063-788）
HEPES（Fisher Scientific，目录号：BP310-500）
低渗蛋白酶抑制剂溶液（见食谱）
蔗糖缓冲液（见食谱）

设备

一个1毫升移液器（吉尔森，目录号：F123602）
一个移液器控制器（VWR，目录号：613-4442）
一把剪刀
一套立场（立场和夹子）
孵化器
生物安全柜（Class II，Type A2）
离心机（Beckman Coulter，型号：Allergra X-22R;转子：Beckman Coulter，型号：SX4250）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：L-60）
摆臂式转子（Beckman Coulter，型号：SW 28）
固定角转子（Beckman Coulter，型号：70 Ti）
肚皮舞者或轨道摇床
氮空化室/容器（帕尔仪器公司，目录号：4639）
变流量蠕动泵（Fisherbrand，Thermo Fisher）

程序

取两个表达荧光标记膜蛋白的融合HEK293T细胞（每个瓶约1200万个细胞）的两个烧瓶（250ml，75cm2）。
从细胞中吸出培养基并用5ml 1x PBS缓冲液冲洗细胞。
加入5 ml Versene溶液并在37°C孵育5分钟以从培养瓶中分离细胞。
将细胞浆收集在15ml离心管中。
在室温下将浆液在300×g下离心5分钟。
小心吸出后弃去试管中的上清液（Versene溶液），并在离心管中加入3 ml低渗蛋白酶抑制剂溶液（配方1）。
使用移液器进出或旋转重新悬浮细胞。
将试管置于冰桶中，摇动摇床上的桶10分钟以促进细胞膨胀。
将细胞浆从离心管转移到预冷的（冰上的）氮空化室/容器中。连接容器头，并在氮气中流动至600 psi。在冰上压力下孵育空化室20分钟。缓慢打开阀门同时释放压力，并将细胞裂解液收集到15 ml离心管中（图1）。将试管置于冰上，直至细胞裂解液加入OptiPrep梯度液上。

图1.用于氮空化的仪器设置A.取预冷的氮空化室，关闭阀（红圈）并将细胞浆加入室中。 B.连接容器头部并打开阀门B1，使氮气在腔室内流动，并在压力达到600psi时关闭阀门B1。放入冰箱5分钟。从冰中取出腔室并缓慢打开阀门B2，同时释放压力并将细胞裂解液收集到15ml离心管中。
在Ultra-Clear超速离心管中制备OptiPrep梯度，如下所示：
1. 用刀片将葡萄酒瓶塞切成厚约2毫米的圆形切片（图2A）。用一把剪刀沿着软木切片的周边切割，以便它可以很容易地装入超清晰的超速离心管中。用水清洗软木切片以除去碎片。将其放入无菌水中，直至将其加入超速离心管。
  
  图2. ER和质膜囊泡收集步骤的图片展示A.将葡萄酒软木塞（A1）切成约2mm厚的切片（A2）。该切片（A3）沿圆周切割以丢弃外部区域（A4）并保持可容易地装入Ultra-Clear超速离心管中的小圆片（A5）。比例尺（A6）放置在图像上进行尺寸比较。 B.将小软木塞插入管中并漂浮在溶液上。 C.随着附加解决方案（20％和10％OptiPrep）的添加，软木塞升至顶部。在添加所有层之后，软木浮在溶液顶上。 D.使用镊子去除软木切片而不干扰梯度。 E.将巴斯德移液管破碎以获得插入蠕动泵入口管中的窄管。 F.泵的最终入口管插入含有梯度溶液的Ultra-Clear管的底部中心。
2. 准备30％，20％和10％的OptiPrep解决方案，通过用蔗糖缓冲液（配方2）将最初的60％OptiPrep溶液稀释到三个50 ml试管中。
  计算与制备30毫升每种溶液相关的参数见表1
  表1.用60％OptiPrep溶液和蔗糖缓冲液制备30％，20％和10％OptiPrep溶液从供应商处获得的原始OptiPrep溶液含有60％OptiPrep。
3. 在Ultra-Clear超速离心管中，使用5ml血清移液管和移液管控制器，加入3ml 30％OptiPrep溶液，然后使用镊子在溶液顶部添加软木切片（图2B）。现在滴加3毫升20％OptiPrep，然后3毫升10％OptiPrep，最后3毫升细胞裂解物顶部的软木切片。随着溶液滴入管中，软木切片保持漂浮在溶液顶部，从而有助于避免添加的溶液与管中已经存在的溶液混合（图2C）。
  注意：应该可见三个不同的接口，指示不同密度的4层解决方案。当管子靠着光源放置时，接口清晰可见。
4. 使用镊子小心地取出葡萄酒软木塞而不干扰梯度（图2D）。
在25,000 rpm（112,000×g g）下，在4°C下将装有OptiPrep梯度的超速离心管在摇摆转子转子中离心90分钟。
离心后，应观察到三层囊泡：细胞裂解物与10％OptiPrep，10％和20％OptiPrep，以及20％和30％OptiPrep之间（如图3所示）。

图3. OptiPrep解决方案界面之间囊泡的存在与收集的不同馏分的相对位置A.三层囊泡可见：0％和10％OptiPrep界面，10％和20％OptiPrep和20％和30％OptiPrep。这张照片是用手机拍摄的。 B.通过将蠕动泵的入口管插入管底部中心，收集串联的馏分1和2，每个1.0ml，然后收集串联的3-8个馏分，每个1.5ml。
使用蠕动泵收集ER和PM部分如下：
1. 使用支架和夹子垂直放置Ultra-Clear离心管。
2. 将玻璃巴斯德吸管分离到小直径管和大直径管的连接处，然后将小直径管插入蠕动泵的进样管内（图2E）。
3. 小心地将蠕动泵的入口管插入超速离心管（用夹子和支架固定），直到其接触离心管的底部中心（图2F）。有必要确保梯度不受插入过程的干扰。
4. 启动蠕动泵收集不同的馏分，保持界面处于相同的分数（图3B）。为此，收集馏分1和2，每个1毫升，馏分3至8，每个1.5毫升。
5. 根据我们用抗钙联接蛋白作为ER标记和抗钠钾ATP酶作为质膜标记的Western印迹结果，组分3和组分4仅含有ER，组分7和组分8仅包含质膜囊泡（图4）。然而，我们已经选择分数3和7作为ER和质膜囊泡分别用于我们的实验。
图4.从OptiPrep梯度收集的不同级分的蛋白质印迹，以将单个受体分离成ER和质膜特异性囊泡。使用抗钠钾ATP酶抗体（1：200稀释度）与在OptiPrep梯度（上图）中的质膜标记，钠钾ATP酶。采用抗钙联接蛋白抗体（1：200稀释）与梯度物质中的ER标记calnexin结合（下图）。利用ChemiDoc成像系统（Bio-Rad）上的HRP缀合的小鼠抗兔二级抗体（1：5,000稀释）和Clarity TM Western ECL底物以将ER和质膜标记定位于凝胶。在细胞裂解物中发现质膜标记，并且部分5-8和ER标记位于细胞裂解物中并且部分3-6。因此，部分3和4仅包含ER囊泡;级分7和8只含有质膜囊泡。我们选择了第3部分的ER囊泡和第7部分的质膜囊泡。
用1x PBS缓冲液稀释ER和质膜部分至1：3，并在4°C用固定角转子以30,000rpm（100,000×g g）离心1小时。
用600μl1x PBS缓冲液或蔗糖缓冲液重悬沉淀，以获得ER和质膜衍生的囊泡。我们通常将囊泡溶液等分到两个或三个1.5-ml管中，并储存在-80°C。我们在7天内使用囊泡。
注意：如果一个部分不包含囊泡或非常少量的囊泡，离心后管道表面没有可见的沉淀。在这种情况下，我们从囊泡可能存在的区域收集样品。可以注意到，在离转子中心最远的管的表面上形成颗粒，并且可以基于其他管中可见颗粒的位置容易地评估颗粒的可能位置。
此时，一部分ER和质膜衍生的囊泡将含有感兴趣的蛋白质。对于单分子荧光研究，有必要从表达与荧光蛋白结合的靶蛋白的细胞开始。可以使用含有单个受体的囊泡通过逐步光漂白技术来研究受体的化学计量组装，使用荧光相关光谱学来探测配体 - 受体相互作用，并且使用单分子Forster共振能量转移来理解受体的动力学和构象变化（ smFRET）。

食谱

低渗蛋白酶抑制剂溶液
10 mM Tris-HCl
10 mM NaCl
1.5mM MgCl 2 2/2 0.2mM CaCl 2 2/2 调整pH值到7.4
每10ml缓冲液一种蛋白酶抑制剂片剂
蔗糖缓冲液
250 mM蔗糖
10 mM HEPES
调整pH值到7.4

致谢

这项工作部分得到了NIDA培训资助DA016176（AMF）和NIDA DA038817的支持。这项工作改编自Fox-Loe等人，2017，J Biol Chem 292（51）：21159-21169。我们声明与本出版物无关的利益冲突或竞争利益。

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