材料和试剂

培养皿（6厘米和9厘米直径，ASONE）
镜头纸（Fisher Scientific）
滤纸（Whatman）
医用纱布（Angyang Medical）
吸水纸（Kimberly-Clark）
1.5毫升管（Eppendorf）
提示（10μl，200μl和1,000μl，Axygen）
刀片（Dexter Russell Cutlery，目录号：73-C）
玻璃载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-343）
Coverslips（Fisher Scientific，目录号：12-547）
壶（直径10厘米，高15厘米）
耕地土壤
Magnaporthe oryzae 菌株
注：米曲霉菌株在-80°C的干燥滤纸片上保存，以备长期保存。
大麦种子（ Hordeum vulgare ，cv E9）
无菌水（Milli-Q）
煮燕麦滤液
番茄汁
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：17209）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
燕麦番茄琼脂（OTA）固体培养基（见食谱）
0.025％吐温20（见食谱）

设备

剪刀，镊子，吊具
移液器（Eppendorf，产品目录号：3124000016 [0.5-10μl]，3124000032 [20-200μl]和3124000075 [100-1,000μl]）
用于真菌生长和大麦萌发的培养箱（28℃）（Biolab Scientific，型号：BIFG-101）
血细胞计数器（Marienfeld，目录号：0650030）
温室能够控制温度和湿度，用于种植大麦
光学显微镜（奥林巴斯，型号：CX23）
荧光显微镜（徕卡显微系统，型号：Leica DM2500）
榨汁机
高压灭菌器

程序

准备 M。 oryzae （图1）

图1.制备 M分生孢子的方法。 oryzae
1. 接种 M。 oryzae 菌株转化为固体OTA（配方1）平板（直径6厘米），并在28°C的光照培养箱中培养一周。
2. 加入含有0.025％吐温20（方案2）的2ml无菌蒸馏水至每个OTA平板并用撒布器刮取收获分生孢子。使用两层无菌镜头纸过滤和去除菌丝碎片。过滤后，通过移液短暂涡旋以重新悬浮分生孢子。
  注：吐温20将有助于增加水的疏水性，从而促进水滴的形成而不会塌陷。
3. 在光学显微镜下使用血细胞计数器测定分生孢子浓度，并将终浓度调节至每毫升0.025％吐温20无菌水中1×10 5个/毫升。
大麦叶片的制备
1. 将大麦种子（大约50粒种子）放入含有适量无菌水的培养皿中，并将培养皿置于28°C孵育室中12小时。
2. 取出水，用无菌水洗几次种子，然后挂在一层纱布上干燥6小时。
3. 将种子放入培养皿（9厘米直径），并用适量的无菌水浸种，然后覆盖几层湿纱布。
  将培养皿置于培养箱中28°C孵育12-18小时。
4. 种子发芽后，将其转移到含有80％体积耕地土壤（每盆20-30粒种子）的盆中（直径10厘米，高15厘米）。将盆放在室温下生长的温室中。每两天浇水一次，以保持土壤湿润。一周后，大麦叶片可用于接种（图2）。
图2.接种 M的程序。 oryzae 在大麦叶上
用大麦接种大麦。 oryzae （图2）
1. 用剪刀从基座上切下大麦叶片，然后将它们（背面朝上）放入已用两层水浸吸水纸覆盖的培养皿（直径9厘米）中。
  使用水浸式吸水纸固定叶片底部和吸头，并保持叶片平整（视频1）。
  注意：使用水浸式吸水纸固定叶片基座和吸头时，请保持叶片干燥，并且不要用手指或任何其他材料接触叶片。
2. 使用移液管（0.5-10μl范围）将分生孢子悬浮液滴在静脉旁的大麦叶上（视频2）。
  注意：如果滴剂过大或塌陷，保留每个滴剂的直径约2-3μm并且没有塌陷，这可能倾向于形成气生菌丝体，而不是附着体。保持提示远离表皮可以避免崩溃。每次吸收分生孢子悬浮液之前，通过摇动管子来重新悬浮分生孢子。
3. 盖上盖子，用湿润的吸水纸覆盖培养皿，并将它们放入密封的潮湿箱中。然后将盒子置于28°C的黑暗培养箱中。
感染过程观察（图3）
1. 接种后在不同时间点用镊子取出大麦叶片。使用刀片从顶部或底部横向切割叶片。保持下表皮连接，然后拆下下表皮（图3A，视频3）。
  注意：在这个过程中，尽量不要碰水滴，这可能会破坏感染结构。建议在18 hpi观察穿透钉和原发感染菌丝，并在24-30 hpi时观察继发感染菌丝。
2. 将下表皮放在载玻片上，加入一些水浸泡表皮，然后盖上盖玻片。
3. 观察 M的感染过程。 oryzae 在显微镜下的表皮细胞中，拍摄图像并计算不同感染结构的形成比例（图3A）。
  每次应计算超过50个分生孢子
4. 在荧光显微镜下观察感染结构中GFP标记蛋白的亚细胞定位（图3B）。
  注意：在观察过程中，记得在样品干燥时加水。
  
  图3.观察不同样品的程序 A.观察感染过程的程序。 B.蛋白质亚细胞定位的观察。 DIC，差分干涉对比;绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白。比例尺= 20μm。

数据分析

关于数据处理，统计检验，重复和独立实验的所有信息已经包含在最初的研究论文中（Chen等人，[2014]，通过α-1对效应蛋白进行N-糖基化，植物细胞“26（3）：1360-1376。doi：10.1105 / tpc.114.123588），稻瘟病菌需要3-甘露糖基转移酶来避免宿主先天免疫。

笔记

植物健康对感染检测的成功非常重要。大麦植物应在充足的阳光下生长，并避免土壤干旱。否则，大麦表皮不能很好地感染M。 oryzae 。
准确添加0.025％吐温20到无菌水中对于成功接种是重要的。在吸收试剂之前应该切断吸头。缓慢吸收吐温20，并将尖端上的附着剂去除。
为了防止接种阶段液滴塌陷，培养皿应尽可能慢地移动。

食谱

燕麦番茄琼脂（OTA）固体培养基（1升）
40克煮燕麦片过滤

150毫升番茄汁 20克琼脂
1. 将燕麦片在800毫升蒸馏水中煮30分钟，然后用双层纱布过滤混合物
2. 用提取器提取番茄汁，然后用双纱布过滤混合物。将150毫升番茄汁和煮沸的燕麦片滤液混合，然后加水至1升
3. 加入20克琼脂和高压灭菌器40分钟
0.025％吐温20

在800毫升无菌蒸馏水中加入250μlTween 20并将体积调至1 L

致谢

该协议改编自Chen等人（2014年）。这项工作得到了国家自然科学基金（31571952,31601585）的资助。作者声明不存在利益冲突。

参考

Chen，X.L.，Shi，T.，Yang，J.，Shi，W.，Gao，X.，Chen，D.，Xu，X.，Xu，J.R.，Talbot，N.J.和Peng，Y.L。（2014）。稻瘟病需要通过α-1,3-甘露糖基转移酶对效应蛋白进行N-糖基化真菌来逃避宿主先天免疫。植物细胞 26（3）：1360-1376。
Dean，R.，Van Kan，JA，Pretorius，ZA，Hammond-Kosack，KE，Di Pietro，A.，Spanu，PD，Rudd，JJ，Dickman，M.，Kahmann，R.，Ellis，J。和Foster ，GD（2012）。分子植物病理学中十大真菌病原体分子植物病理学< / em> 13（4）：414-430。
Kankanala，P.，Czymmek，K.和Valent，B。（2007）。在真菌侵袭性侵袭过程中水稻膜动力学和胞间连丝的作用植物细胞 19（2）：706-724。
Koga，H.，Dohi，K.，Nakayachia，O。和Moria，M（2004）。用于细胞学观察感染过程的 Magnaporthe grisea 的新颖接种方法使用完整的水稻植物叶鞘。 Physiol Mol Plant Pathol 64：67-72。
Kohli，M.M，Mehta，Y.R.，Guzman，E，De Viedma，L.和Cubilla，L.E。（2011）。 Pyricularia blast - 对小麦的种植构成威胁捷克J Genet Plant品种 47：130-134。
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