材料和试剂

在我们使用的当前协议中：

96孔组织培养板（Corning，Falcon ，目录号：353072）
无菌50毫升管（VWR，目录号：525-0402）
带PES膜的0.2μm过滤器（VWR，目录号：514-0073）
50毫升注射器（VWR，目录号：613-2053）
LNCaP细胞（ATCC，目录号：CRL-1740）
PC3细胞（ATCC，目录号：CRL-1435）
RPMI1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21875）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F7524;在RPMI 1640培养基中以10％终浓度使用以制备完全培养基）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（1x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：20012）
碘化丙锭（Merck，Calbiochem，目录号：537059）
Thapsigargin（Sigma-Aldrich，目录号：T9033）
碘化丙啶，1毫克/毫升PBS储备液（见食谱）
Thapsigargin（Tg），5mM DMSO储备液（见食谱）

设备

多通道移液器，8通道，30-300μl（Eppendorf，产品目录号：3122000051）
自动红外直接加热CO 2培养箱（NuAire，型号：NU-5510E）
IncuCyte ZOOM活细胞分析系统（Essen Bioscience，型号：IncuCyte ZOOM）
FACSCanto II流式细胞仪（BD，BD Bioscience，型号：FACSCanto II）

软件

IncuCyte ZOOM软件（Essen Bioscience）
流式细胞仪软件（Perttu Terho）

程序

使用多通道移液管在96孔板中的100μl完全生长培养基中培养种子细胞，细胞密度在1-3天后达到40-80％汇合（图1）。
注：我们种植了大约2×10 4个LNCaP细胞和2×10 3个细胞。每孔PC3细胞在2天后获得适当的汇合。该分析可以适应其他平板格式，如384孔平板以包括更多条件。

图1.使用碘化丙啶和IncuCyte ZOOM仪器实时监测细胞死亡的程序概述
在含有5％CO 2的潮湿培养箱中于37℃培养细胞1-3天。
将含有5μg/ ml PI（来自1mg / ml储备溶液的200x稀释液）的100μl完全生长培养基中的实验处理添加至孔中。包括适当的控制。例如，用与实验试剂相同量的载体处理细胞溶解。两种处理和PI都应该浓缩2倍，因为它们将被添加到100μl孔中的细胞培养基中（即< / em，PI的最终浓度将是2.5μg/ ml）。在96孔板中，由于蒸发效应，将实验中的外部孔排除在实验室之外是可取的。为了抵消其余孔中的蒸发效应，用培养基或更方便地将所有孔中的种子细胞（步骤1中）填充到外部孔中。一般来说，我们在三个重复井中执行每个处理条件。
注：我们经常使用2.5μg/ ml的PI。然而，为新细胞系测试PI的稀释行以确定最佳浓度可能是明智的。
使用IncuCyte ZOOM仪器进行自动化相位对比和红色荧光成像，放置在正常湿度培养箱中，37℃，5％CO2分压。扫描可以在任何需要的时间间隔进行。我们通常每10h放大3次（图像分辨率：1.22μm/像素），每3小时记录3个图像，以监测细胞增殖和死亡的期望时间范围（例如3天，或只要对特定实验处理有意义/使用的条件和细胞类型）。
在红色通道（800毫秒）中使用图像采集时间的默认设置。
注意：仪器对红色通道使用以下激发/发射波长：565-605 nm / 625-705 nm。 IncuCyte ZOOM还具有4x和20x物镜（分辨率分别为3.05和0.61μm/像素）。但是，我们仅使用10x物镜测试了该协议，可以在96孔井中的固定位置（从井的中心向外）开始捕获1-4个图像。我们还没有经历过井的任何特定部分应该优先成像和/或避免。应该完全有可能使用其他活细胞成像系统来捕获和分析PI信号。但是，我们只使用IncuCyte ZOOM仪器对协议进行了测试。

数据分析

数据的代表性例子
当应用上述方案并且在一定药物浓度和时间点范围内实时记录红色荧光和相位对比图像时，同时获得细胞死亡和细胞生长曲线。这在图2中说明，其中我们已经用增加浓度的毒胡萝卜素（Tg）处理LNCaP或PC3前列腺癌细胞达70小时。从相同孔获得的数据可以分析绝对细胞汇合（图2A），相对细胞汇合（标准化至0小时时间 - 即，在图2B中处理启动时间），和细胞死亡动力学（图2C）。这种联合输出使我们能够确定抑制细胞增殖的实验条件，但没有发生细胞死亡（Sehgal等人，2017）。当比较生长曲线（图2A和2B）和在LNCaP细胞中用6或12nM Tg获得的细胞死亡曲线（图2C）时，可以观察到这种细胞抑制条件。可以导出IncuCyte ZOOM拍摄的照片，以直观显示细胞皱缩和红色荧光PI染色（图3）。

图2.使用IncuCyte ZOOM系统分析细胞汇合和细胞死亡如所示，在存在以下情况下，用DMSO或增加浓度的毒胡萝卜素处理LNCaP（左）或PC3（右）细胞： 2.5μg/ ml PI。 A和B.LNCaP和PC3细胞随时间作为绝对百分比（A）或相对于开始汇合（B）绘制的细胞汇合度（由相位对比图像确定的细胞覆盖的表面的比例）。 C.红色荧光（PI-阳性）与总细胞汇合随时间的比率。 3（LNCaP）或6（PC3）独立实验的平均值±SEM。

图3.使用IncuCyte ZOOM系统的活细胞图像的实例在0小时24小时后覆盖LNCaP（A）和PC3（B）细胞的相差和荧光图像（10倍放大率），48小时和72小时的用DMSO或thapsigargin（Tg）处理，在PI存在下处理。比例尺代表300微米。

在单独的IncuCyte ZOOM实验中，我们验证了PI本身不会影响LNCaP，PC3，MCF7和HCT116细胞中的细胞增殖（数据未显示），从而进一步验证了使用活死斑的适合性，如PI用于实时监测细胞死亡（Wlodkowic等人，2009; Zhao等人，2010）。
最后，我们使用此处描述的方案与基于流式细胞术的终点PI染色测量进行了并行细胞死亡评估比较。为此，我们用一定范围的Tg浓度处理PC3细胞。处理42小时后，我们使用目前的方案定量细胞死亡，并且随后根据先前描述的方案（Crowley等人，2016），通过流式细胞术收获细胞以定量细胞死亡。如图4所示，我们获得了两种方法的可比结果，具有相似的剂量反应曲线和几乎相同的EC50值。
总之，本文提出的方案允许以可靠，简单，低成本和高通量的方式同时评估细胞死亡和细胞生长。

图4.使用IncuCyte ZOOM或流式细胞术的基于PI的细胞死亡分析的直接比较如所示，在PI存在下，用DMSO或增加浓度的毒胡萝卜素处理PC3细胞42小时。首先使用IncuCyte ZOOM（A）通过活细胞成像分析细胞死亡，然后通过流式细胞术（使用BD Bioscience FACSCanto II和Perttu Terho的流动软件）从相同孔（B）分析细胞死亡。对于流式细胞术，用0.25％胰蛋白酶-EDTA（1x）收获细胞，并如先前所述获取并分析10,000个事件（Crowley等人，2016）。如所述（Crowley等人，2016），通过选通正向/侧向散点图排除细胞碎片，并基于前向散射/ PI荧光曲线门控PI阳性细胞。显示的是红色荧光与总细胞汇合的比率（A）和门控PI阳性细胞的百分比（B）。指3次独立实验的平均值±SEM。显示了最大毒胡萝卜素效应的EC50值（95％置信区间）。
数据分析
对于数据分析，我们使用IncuCyte ZOOM软件的集成算法来计算PI阳性细胞汇合（基于红色荧光图像）和总细胞汇合（基于相位对比图像）。 IncuCyte ZOOM软件允许调整分析工作的处理定义，以优化荧光和相位对比图像的合流模板，参见图5.默认设置已经非常准确，但对于大多数细胞系，分割调整设置（a IncuCyte软件中用于调整细胞半透明度的工具）必须在相位对比图像（朝向背景或细胞，取决于细胞半透明性）有所改变。此外，排除小碎片也是有用的（例如滤除小于500μm2的物体适用于LNCaP和PC3电池）。一旦确定了特定细胞系的适当设置，应该在随后的所有实验中使用相同的设置。将汇合值（细胞覆盖的面积或红色荧光占总表面积的百分比）输出用于进一步处理，例如计算红色荧光至总细胞汇合率，总细胞汇合的标准化值，以及从重复孔获得的值的平均值。当仅绘制细胞汇合数据（未显示红色汇合数据）以检查细胞密度随时间的发展（如图2A和2B中所示）时，将0小时时间点的细胞汇合度设置为1可能是有用的，在播种密度上有差异（如图2B所示的数据，如图2A所示）。
应该指出，这里介绍的方法不会产生细胞计数，并且由于死/死细胞往往小于活细胞，并且由于PI仅染色细胞核，所以红色荧光与总细胞汇合比可能轻微低估培养物中细胞死亡的真实百分比。这在图4中可见于PC3细胞。因此，此处描述的方案可用于可靠地比较细胞死亡的相对范围和动力学，但不是死细胞的实际百分比。这些优点是获得的高吞吐量和一致的实时数据。

图5.使用IncuCyte ZOOM系统进行合流蒙版调整的示例。用于合流蒙版的IncuCyte ZOOM软件分析工具的屏幕截图（黄色轮廓）。 A.适当调整PC3细胞，对细胞（红色矩形）进行1.8的分割调整，对小于500μm2（蓝色矩形）的区域进行滤波。 B.对背景（红色矩形）和无过滤器（蓝色矩形）的分段调整为0.2的PC3单元进行不适当调整的示例。箭头标记的是细胞/部分细胞的例子，这些细胞不包括在合流面罩（红色箭头）和没有过滤掉的碎片（蓝色箭头）中。由于分段调整不正确，计算出来的汇合度太低（9％而不是39％）。

食谱

碘化丙啶，1mg / ml PBS储备溶液
1. 称出40毫克PI在无菌50毫升管中，并添加40毫升37°C预热，无菌PBS
2. 旋转管直到PI溶解。这可能需要一段时间（超过1小时）
3. 无菌过滤器通过一个0.2微米的过滤器进入一个新的无菌50毫升管
4. 储存在4°C的环境中，保存稳定多年
Thapsigargin（Tg），5mM在DMSO中的储备溶液
1. 通过移液将5mg Tg溶解在1.54ml无菌DMSO中（Tg非常容易溶解）
2. 储存在-20°C的储存液可以保持稳定多年

致谢

这项工作得到挪威研究理事会，奥斯陆大学，Anders Jahre基金会，Nansen基金会，纪念Henrik Homan的遗产和Lundbeck基金会的资助。该协议首先在Sehgal et al。，2017的方法部分进行了描述。作者宣称他们没有利益冲突。

参考

Crowley，L.C.，Scott，A.P.，Marfell，B.J.，Boughaba，J.A。，Chojnowski，G。和Waterhouse，N.J。（2016）。通过碘化丙啶摄取和流式细胞术测量细胞死亡 Cold Spring Harb Protoc 7：pdb.prot087163。
Sehgal，P.，Szalai，P.，Olesen，C.，Praetorius，H.A.，Nissen，P.，Christensen，S.B。，Engedal，N.and Moller，J.V.（2017）。抑制肌肉/内质网（ER）Ca 2 + - 毒胡萝卜素类似物的ATP酶通过ER Ca2 +消耗和未折叠的蛋白质应答诱导细胞死亡。 J Biol Chem 292（48）：19656-19673。
Wlodkowic，D.，Skommer，J.，McGuinness，D.，Faley，S.，Kolch，W.，Darzynkiewicz，Z。和Cooper，J.M。（2009）。基于芯片的动态实时定量分析人类肿瘤细胞中药物诱导的细胞毒性 Anal Chem 81（16）：6952-6959。
Zhao，H.，Oczos，J.，Janowski，P.，Trembecka，D.，Dobrucki，J.，Darzynkiewicz，Z。和Wlodkowic，D。（2010）。使用碘化丙啶进行实时和动态细胞死亡检测的基本原理 Cytometry A 77（4）：399-405。