材料和试剂

在我们使用的当前协议中：

移液器吸头（Thermo Fisher ART Barrier tips）（VWR，产品目录号：732-2223（0.5-20μl），732-2207（1-200μl）和732-2355（100-1,000μl））
75cm 2组织培养瓶（Corning，Falcon，目录号：353136）。
24孔组织培养板（Corning，Falcon ，目录号：353047）
微量离心管（VWR，目录号：211-2130）
闪烁瓶（PerkinElmer，目录号：6000292）
丁腈手套（VWR，产品目录号：112-2372）
50毫升管（VWR，目录号：525-0402）
0.45μm过滤器（VWR，目录号：514-0075）
LNCaP细胞（ATCC，目录号：CRL-1740）
U2OS细胞（ATCC，目录号：HTB-96）
VCaP细胞（ATCC，目录号：CRL-2876）
Huh7细胞（Nakabayashi等人，1982）（由挪威奥斯陆的Line M.Grønning-Wang博士提供）
PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：20012019）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21875091）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
[1 -14 C] L-缬氨酸，45mCi / mmol，0.1mCi / ml（Vitrax，目录号：VC308）
聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P6407-10X5MG）
对于RNAi逆转录：
Lipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：13778150）
Ambion Silencer TM选择siRNA（阴性对照'siCtrl'，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：4390843; siULK1，s15964; siULK2，s18706） Opti-MEM减少血清培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11058021）
Earle平衡盐溶液（EBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：24010043）
闪烁液体（PerkinElmer，目录号：6013199）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
巴弗洛霉素A1（Enzo Life Sciences，目录号：BML-CM110-0100）
氯化铵（NH4Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A4514）
SAR-405（Magento，ApexBio，目录号：A8883）
Torin1（Tocris Bioscience，目录号：4247）
非放射性L-缬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：V0513）
牛血清白蛋白（BSA）（VWR，目录号：422361V）
三氯乙酸（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：T0699）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：60377）
200 mM冷L-缬氨酸（见食谱）
RPMI 1640/10％FBS（见食谱）
1毫克/毫升聚-D-赖氨酸（见食谱）
1 mM Torin1（见食谱）
PBS / 2％BSA（见食谱）
25％TCA（见食谱）
0.2 M KOH（见食谱）
0.2 mM Bafilomycin A1（见食谱）
160mM NH 4 Cl（参见食谱）

设备

移液器（Finnpipette TM F2 GLP试剂盒）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：4701070）
加湿孵化器
管旋转器（VWR，目录号：444-0502）
平板摇床（Grant Instruments，型号：PMS-1000i）
磁力搅拌器（IKA，目录号：0003810001）
自动流动IR直接加热CO 2培养箱（NuAire，型号：NU-5510E）
Vortexer（Denville Scientific，目录号：S7030）
带冷却台式离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：75002430）
闪烁计数器（液体闪烁分析仪）（Packard，型号：1600 TR）

程序

放射性标签（标准2-3天）
1. 在37℃下在具有5％CO 2的潮湿培养箱中的75cm 2组织培养瓶中培养贴壁细胞直至获得接近汇合的细胞层。用3 ml 37°C PBS洗涤一次，并在37°C用3 ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA孵育细胞，直到细胞脱落（通常3-5分钟）。
2. 将分离的细胞收集在补充有FBS的10ml 37℃RPMI 1640中至终浓度为10％（=完全培养基，CM）。
  注：本方案中放射性和冷缬氨酸的浓度已根据缬氨酸在该培养基中的浓度以及基于所用放射性缬氨酸量的成本效率而专门用于RPMI 1640中。当遵循这个协议时，细胞因此应该在胰蛋白酶消化后重新悬浮在RPMI 1640中，即使它们通常不在RPMI 1640中培养。出于同样的原因，RPMI 1640应该用于该方案的其余部分。我们已经在＆gt; 20细胞系，并且在通常不培养RPMI 1640的细胞中从未观察到毒性或改变的表型迹象，只要细胞不需要任何特殊的补充。可以使用其他培养基代替RPMI 1640，但用户应该在整个实验过程中调整缬氨酸浓度，以考虑RPMI 1640缬氨酸浓度与所用替代培养基的差异。
3. 种子细胞在0.5ml CM中的24孔板中补充14 C缬氨酸至最终浓度为0.1μCi/ ml。在实验处理时将种子细胞编号导致期望的单层汇合。一般而言，我们在37℃下在含有5％CO 2的湿润培养箱中温育2-3天后使种子细胞达到50-80％融合。
  备注：
  1. 此处介绍的协议与24孔板格式兼容。由于操作简便且重现性高，我们每个实验常规处理两个24孔板（48个孔），每个处理条件有两个重复或三个重复的孔。这使得可以在单个实验中测试相对较多的条件。
  2. 对于LNCaP细胞，我们每孔接种1×10 5个细胞。对于U2OS，VCaP和Huh7，我们分别接种每孔3×10 4个，2.5×10 5个和1.2×10 4个细胞。
  3. 当使用粘附不良的细胞类型时（例如，LNCaP细胞，HEK293细胞和其他细胞），建议使用已涂布的组织培养板以改善细胞粘附（由于方案中的多次洗涤步骤）。我们更喜欢使用聚-D-赖氨酸（PDL），因为它相对便宜并且易于使用，并且不干扰氨基酸饥饿（因为它不像细胞聚L-赖氨酸那样不被细胞代谢）。在24孔组织培养板中每孔加入300μl无菌PDL（2.5μg/ ml）。在无菌环境中室温孵育30分钟。之后，使用抽吸去除PDL，并用0.5ml无菌H 2 O短暂冲洗每个孔。干燥后即可使用。当在室温下储存时，PDL包被的平板可稳定长达数周。值得注意的是，对于大多数细胞类型涂层是没有必要的。
  4. 在进行siRNA转染时，我们建议使用反转染，以便可以同时转染和放射性标记细胞。这既实用又具有非常高的转染效率。根据制造商的方案将Opti-MEM，siRNA和Lipofectamine RNAiMAX合并，并将转染混合物等分到24孔板（每孔50μl）中。在室温下孵育20-45分钟，并在含有siRNA-Lipofectamine混合物的孔中接种含有14 C- C-缬氨酸的CM中的0.5ml细胞悬液。仔细搅拌培养板并将其放入培养箱。
  5. 遵照贵机构关于放射性工作的规定。为了保护自己，请佩戴厚度≥0.25毫米的手套。
4. 在37℃和5％CO 2下在潮湿的培养箱中孵育细胞2-3天，以允许将14 C缬氨酸充分掺入长寿命蛋白质中。
追逐（标准18小时）
1. 吸取培养基去除未掺入的放射性物质。
2. 用0.5毫升补充有10毫克冷缬氨酸（CM-V）的37℃CM清洗细胞一次注：由于RPMI 1640含有0.17 mM L-缬氨酸，因此CM-V中L-缬氨酸的终浓度为10.17 mM。使用10mM冷的L-缬氨酸阻断释放的14 C-缬氨酸的重新掺入对于这种类型的测定是标准的（Bauvy等，2009; Mizushima等，2001; Fuertes等，2003a）。目前还不知道是否有一个可以使用的高浓度冷L-缬氨酸的上限，但是在分离的大鼠肝细胞中已经显示高达20mM的冷L-缬氨酸不影响蛋白质降解活性（Seglen等1979）。
3. 吸入培养基并用0.5 ml 37°C CM-V代替。
4. 在37°C和5％CO 2的潮湿培养箱中孵育细胞18小时。
  注意：＆NBSP;
  1. 追逐不需要18小时。然而，改变追踪的持续时间将改变采样期间的蛋白质降解速率（图2A）以及液体闪烁计数过程中的信号强度（参见注释部分关于闪烁计数和测定变异性的注释中的注释2测量），并且还会更改分析的蛋白质库（请参阅注释部分的注释3）。在比较不同追逐持续时间获得的结果时，应该牢记这一点。
  2. 如果进行实验性治疗时间超过6小时，请在追踪之前或期间添加治疗。此外，还有机会在治疗开始后的不同时间段对LLPD进行治疗效果取样。
取样（标准2-6小时）
1. 通过吸取培养基去除释放的14 C缬氨酸（由短寿命蛋白质降解产生）。
2. 用0.5ml 37℃的适当培养基洗涤细胞一次。如果后续治疗处于完全中度（例如，Torin1），则用CM-V清洗。如果随后的处理将在氨基酸饥饿培养基（例如EBSS）中，用补充有10mM冷缬氨酸（EBSS-V）的EBSS洗涤。
3. 吸出培养基，并添加0.25毫升37°C CM-V或EBSS-V中的治疗。
4. 在37℃和5％CO 2下在潮湿的培养箱中孵育细胞2-6小时。
收获
第1天
1. 从培养箱中取出细胞板，并在冰上冷却约2分钟。
2. 每孔加入50μl冰冷的PBS / 2％BSA 注：BSA作为蛋白质载体加入，以促进TCA蛋白沉淀。
3. 每孔加入200μl冰冷的25％TCA以沉淀蛋白质。
4. 将培养板置于4°C摇床上，让其以600 rpm的速度摇晃过夜。
  注意：过夜TCA沉淀足够，降水可能会延长几天而不会影响结果。
  
  第2天
5. 将每孔沉淀的蛋白质（〜500μl）转移到1.5 ml微量离心管中。
  注意：将溶液转移到微量离心管中，不要刮擦。保留在孔中的蛋白质沉淀物将溶解并收集在方案步骤D10-D12中。
6. 通过在4℃下5,000gxg离心10分钟使沉淀物沉淀。离心后，上清液（TCA可溶部分）含有氨基酸和小肽（包括在采样期间由于降解而从蛋白质释放的14 C缬氨酸），并且沉淀（TCA不溶部分）含有完整的蛋白质。
7. 离心后，将试管置于冰上。
8. 将每管中的上清液（〜500μl）转移到6 ml闪烁瓶中。
9. 通过每管加入250μl0.2M KOH溶解沉淀并在室温下旋转管至少1小时。
  注意：在将溶液溶解于KOH之前，没有必要清洗沉淀。
10. 通过每孔加入250μl0.2M KOH溶解24孔板中剩余的蛋白质沉淀。
11. 在室温下以600转/分的速度在振动筛上旋转1小时
12. 合并来自各孔和管的溶解蛋白（〜500μl）并转移至6ml闪烁瓶中。
13. 将步骤D8和D12中的每个小瓶用4ml闪烁液体填充。盖住管子，并狠狠地旋转。
  注：闪烁液是一种有机和有毒物质。为了您自己的保护，请添加闪烁液体，盖帽管，并在流动柜中旋转，戴上防护手套和实验室涂层。
14. 通过液体闪烁计数来测量所有管中的放射性数量（关于闪烁计数和化验测量变化的评论，请参见备注部分的注释2）。

数据分析

数据的代表性例子
如上述方案中详述的，我们通常在2-3天内标记蛋白质，然后追踪18小时以富集放射性标记的长寿命蛋白质。追逐可以减少或延长以适应其他实验设置，如此处所示。然而，重要的是要意识到这将丰富具有不同半衰期的蛋白质，这又可以改变采样期间的整体蛋白质降解速率以及实验处理的结果（参见进一步解释在注释部分的注3中）。因此，我们建议保持标签和追逐期限尽可能一致。例如，将追踪时间从18小时减少到1小时，LNCaP细胞中的整体蛋白质降解率从≈1.05％/ h增加到≈1.3％/ h（图2A）。
为了鉴定在所研究的实验条件下发生的溶酶体蛋白质降解的比例，我们推荐包括溶酶体降解抑制剂，如空泡型H + -ATP酶抑制剂Bafilomycin A1（Baf）。 Baf以剂量依赖性方式使溶酶体脱酸并且最终抑制溶酶体降解活性。在LNCaP细胞中，完全培养基中Baf介导的长寿命蛋白降解抑制在25-50nM饱和（图2B）。 Baf敏感部分代表溶酶体降解，而Baf敏感部分代表非溶酶体降解，主要是蛋白酶体蛋白降解。证实这一点，溶酶体促渗剂化合物NH 4 Cl将LLPD减少至与Baf相同的程度（图2C）。溶酶体LLPD是由自噬引起的。在LNCaP细胞中，我们发现用磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基3型（PIK3C3）抑制剂SAR-405或自噬相关蛋白Unc-51如自噬激活激酶1（ULK1）和ULK2的敲低抑制LLPD至与Baf或NH 4 Cl的程度相同（图2C）。因此，在LNCaP细胞中，基底溶酶体LLPD归因于PIK3C3 / ULK依赖性自体吞噬，即典型自噬体介导的自噬（巨自噬），而来自微自噬，内涵体微自噬的推定贡献，或分子伴侣介导的自噬（所有这些都是PIK3C3 / ULK-独立的）都可以忽略不计。蛋白酶体对LLPD的贡献可以通过应用蛋白酶体抑制剂如MG132来确定（Fuertes等人，2003a; Engedal等人，2013）。溶酶体和蛋白酶体抑制剂可用于推断对LLPD的治疗效果是否由溶酶体和蛋白酶体活性的改变引起。例如，当将自噬抑制性钙调节剂（A23187和thapsigargin）与Baf或MG132结合时，我们发现用MG132对LLPD具有添加剂减少作用，但与Baf无关（Engedal et al。，2013），表明钙调节剂抑制自噬 - 溶酶体LLPD而不是蛋白酶体LLPD。值得注意的是，应该意识到可能发生蛋白酶体和自噬 - 溶酶体途径之间的串扰（Dikic，2017）。然而，在我们测试的时间范围（2-6小时）和条件（基础条件，或氨基酸饥饿条件，哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）抑制或内质网应激）中，我们没有观察到迹象的LLPD级别的这种串扰。在LNCaP和U2OS细胞中，我们发现Baf和MG132的作用是完全相加的（Engedal et al。，2013），因此表明自噬 - 蛋白酶体串扰对LLPD没有任何可测量的影响。 /> mTOR以对氨基酸和生长因子的存在敏感的方式抑制自噬（Meijer et al。，2015）。因此，从培养基中除去氨基酸和血清后，mTOR活性受到抑制，并诱导自噬。图2D显示了LNCaP细胞用mTOR抑制剂Torin1或急性氨基酸和血清饥饿治疗的典型响应;总LLPD增加约两倍，其方式是在两种情况下都对Baf强烈敏感，即依赖于溶酶体活性。急性饥饿后观察到的LLPD增加不同于细胞系与细胞系。例如，与U2OS（图2E）和LNCaP细胞（图2D）相比，VCaP和Huh7细胞的效应较弱。重要的是，饥饿诱导的LLPD对所有细胞系中的Baf都敏感，表明它主要诱导溶酶体LLPD。值得注意的是，然而，Baf并没有完全消除mTOR抑制或饥饿的影响（图2D-2E），可能是因为这些条件稍微提高了蛋白酶体活性以及自噬（Fuertes等人， 2003a;赵等人，2015年和我们未发表的结果）。还要注意，在完全培养基和饥饿培养基中细胞类型之间的降解速率和Baf敏感性降解程度基本不同（图2D-2E）。这反映了不同程度的基底细胞自噬（完全培养基中Baf敏感性降解）和自噬能力（EBSS中Baf敏感降解）。

2.使用长效蛋白质降解测定法定量测量内源蛋白质的自噬通量。A-D。将LNCaP和（E）U2OS，VCaP和Huh7细胞系用14 C缬氨酸标记2-3天，追踪（A，左柱）1小时或（A，右柱，BE ）18 h，并在追踪培养基中进行指定处理（“采样期”）。随后测量长寿命蛋白质降解（LLPD）。 A.LLPD在6小时的采样期间进行测量，随后1小时或18小时追踪。 B.LLPD以剂量依赖性方式被Baf抑制。红色虚线显示Baf介导的LLPD抑制是饱和的。蛋白质降解的剩余水平主要由蛋白酶体引起。 C.细胞用10nM非靶向siRNA（'siCtrl'）或5nM siULK1与5nM siULK2组合，并用DMSO（0.1％），Baf（50nM），NH 4 （10mM）或3μMSAR-405处理4小时。红线表示LLPD抑制是饱和的。蛋白质降解的剩余水平主要由蛋白酶体引起。 D.细胞进行指定的处理4小时。 Baf和Torin1以50nM使用。 E. U2OS（左），VCaP（中）和Huh7（右）经过指定的处理4小时。 Baf在所有细胞系中以50nM使用。 A-E。显示了两个独立实验的一个代表（3个生物学重复的平均值±SD）。 Baf，Bafilomycin A1; CM，完全中等; EBSS，厄尔的平衡盐解决方案。
数据分析
闪烁计数器生成一个文本文件，其中样本编号以相应的“每分钟计数”（CPM）列出。 CPM值反映了各个样品中14 C的数量。通过将TCA可溶部分中的放射性量除以放射性总量（TCA可溶部分和不溶性部分中的放射性总和）除以采样周期的持续时间来计算降解速率。降解率表示为“长寿命蛋白质降解（％/ h）”。

笔记

一般来说，我们在每个处理条件下进行重复或三重孔实验（每个实验中两次或三次生物重复实验），而闪烁计数则在整个样品上进行（ ie ，没有技术上的重复测量放射性）。遵循此协议时，生物重复之间的偏差通常非常低。从6个不同细胞系的23个独立实验并覆盖总共292个实验条件一式三份，我们已经计算出治疗重复的LLPD率的变异系数（CV）为2.3％±1.5％（平均CV±标准偏差）。更具体地说，CV值分别为0.1-8.9％，分别为0.4％，1.2％，2.0％，3.2％和5.1％的5％，25％，50％，75％和95％百分点值。
液体闪烁计数器可以设置为在特定时间段内记录计数，或者直到累计了特定数量的计数。测量中的不确定度与计数总数成反比。我们建议设置计数器累计至少10,000次计数，其中标准偏差将≤1.0％。按照目前的方案，用0.1μCi/ ml 14 C缬氨酸标记2-3天，这些设置通常需要少于1分钟的TCA不溶部分计数和数分钟计数TCA可溶部分。背景水平在标准<14> C校准期间设置，非常低（≤22 CPM）。在标准测量方案中，从每个样品中自动减去此背景。因此不需要包括额外的背景样本测量（这将需要许多小时的采样时间用于精确测量）。作为一般说明，我们建议您联系您当地的服务工程师进行维护，校准和服务问题。
可以使用不同的标签，追逐和采样周期持续时间。例如，一些先前的方案使用18-24小时标记期，接着1小时追踪期（Mizushima et al。，2001; Bauvy et al。，2009年）。将标记时间增加至2-3天（如本文所述）的优点是可以方便地将其与2-3天的转染组合，例如，以及此处描述的反向siRNA转染。而且，标记时间越长，将会标记更长寿命的蛋白质（其被缓慢合成并缓慢降解）。应该指出的是，在人成纤维细胞中，已经描述了主要由蛋白酶体降解而不是由大自噬引起的短寿命蛋白质库（Fuertes等人，2003b）。这个蛋白质库的半衰期约为1.1-1.3小时，需要约8小时才能完全消除它们（Fuertes et al。，2003b）。发现在追踪1-4小时期间，短标记蛋白质的初始TCA不溶性放射性的5-7.5％反映了非降解的TCA不溶性蛋白质向培养基的细胞释放。追逐8小时后，该释放减少至上述值的大约十分之一（Fuertes et al。，2003b）。总之，我们建议追逐时间段＆gt; 8小时，以使短命蛋白质的降解和/或分泌的影响最小化。为了安全起见，我们经常使用18小时的追逐期。如此漫长的追逐时期还有另外一个优点，即当希望分析长期实验性治疗对LLPD的影响时，治疗可以在追逐期开始（参见步骤B4b）。此外，由于追逐期通常在2-6小时的采样期后进行，因此18小时追逐期比8小时追逐期更方便。如果需要，取样时间可以超过6小时，但如果将测定与对照处理如溶酶体和蛋白酶体抑制剂结合（如我们推荐的那样），建议保持时间少于6小时以使抑制剂的继发效应最小化。如果希望在治疗超过18小时后分析实验性治疗对LLPD的影响，可以增加追踪期的持续时间，或者甚至在标签期开始治疗，作为延长采样期的替代方案。最后，测定也可以采用比2小时更短的采样时间来完成，但是必须非常小心地确保每个实验样品的均匀时间点，并且可能必须增加放射性14 C-缬氨酸以实现更高程度的标记，从而在闪烁计数器中获得足够的计数水平（参见上面的注2）。

食谱

200mM冷的L-缬氨酸（Mw 117.15）
1. 使用磁力搅拌器将1.172g冷（即，非放射性）L-缬氨酸溶解于45ml RPMI 1640（无血清）或EBSS中。
2. 用RPMI 1640或EBSS分别调节体积至50 ml
3. 通过一个0.45微米的过滤器过滤到一个无菌的50毫升管
4. 这种解决方案在4°C储存时可以稳定长达数月。使用前不要预热
补充有10mM冷L-缬氨酸（CM-V）的RPMI 1640/10％FBS（完全培养基; CM）
1. 将200毫升冷的L-缬氨酸溶液（上面的配方1）的一部分加入到CM
  19份中
2. 为每个实验制作一个新的解决方案
1毫克/毫升聚-D-赖氨酸
1. 将5mg聚-D-赖氨酸（PDL）溶解于5ml无菌H 2 O中。
2. 分装在Eppendorf管中并储存在-20°C。
3. 当储存在-20°C时，储备液可以稳定多年，可以解冻并重新冻结几次。
1mM Torin1（Mw607.62）
1. 将10毫克Torin1溶解在16.46毫升DMSO中
2. 分装于微量离心管中并储存于-20°C。
3. 当储存在-20°C时，储备液可以稳定多年，可以解冻并重新冻结几次。
PBS / 2％BSA
1. 将5克BSA +溶解在200毫升PBS中
2. 添加PBS至总量为250 ml
3. 通过0.45μm过滤器过滤到无菌玻璃烧瓶中
4. 储存在4℃条件下可稳定储存数月
25％TCA
1. 对于10ml，将2.5ml 100％TCA与7.5ml Milli-Q（MQ）H 2 O混合注意：将酸加入水中，反之亦然。
2. 在收获之前将溶液新鲜
0.2M KOH（Mw 56.11）
1. 将1.12g KOH溶解于90ml MQ H 2 O中
2. 将MQ H 2 O添加到总量为100 ml的
0.2mM Bafilomycin A1（分子量622.84）
1. 在803μlDMSO中溶解0.1 mg Bafilomycin A1
2. 分装于微量离心管中并储存于-20°C。
3. 当储存在-20°C时，储备液可以稳定多年，可以解冻并重新冻结几次。
160mM NH 4 Cl（Mw 53.49）
1. 将256.8mg NH 4 Cl溶于25ml MQ H 2 O中。
2. 在室温下调节至pH7.74（= 37°C时pH = 7.4）
3. 使用MQ H 2 O
  将最终体积调整至30 ml
4. 通过一个0.45微米的过滤器过滤到一个无菌的50毫升管
5. 这种解决方案在-20°C储存时稳定多年

致谢

挪威研究委员会，奥斯陆大学，Anders Jahre基金会，Nansen基金会和Legacy在纪念Henrik Homan的资助下完成了这项工作。该协议是2013年Engedal et al。的方法部分描述的修改版本，该修订版本又改编自2009年的Bauvy 等人，我们也想要承认Per O. Seglen的原创性工作，其中很多方法都是基于此（Seglen和Solheim，1978; Ronning等人，1979; Seglen等人， 1979年）。作者声明他们没有利益冲突。

参考

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Dikic，I.（2017）。蛋白酶体和自噬降解系统
Engedal N. Torgersen ML Guldvik IJ Barfeld SJ Bakula D.SætreF. Hagen LK Patterson JB Proikas-Cezanne T. Seglen PO P. Simonsen A.和米尔斯，IG（2013）。调节细胞内钙稳态阻断自噬体形成自噬 9（10）：1475-1490。
Fuertes，G.，Martin De Llano，J. J.，Villarroya，A.，Rivett，A. J.和Knecht，E。（2003a）。血清戒断产生的人成纤维细胞中蛋白酶体和溶酶体的蛋白水解活性的变化，氨基酸缺失以及融合条件。生物化学杂志375（Pt 1）：75-86。
Fuertes，G.，Villarroya，A.和Knecht。 E.（2003b）。蛋白酶体在各种生长条件下在人成纤维细胞中降解短寿命蛋白质的作用 a> Int J Biochem Cell Biol 35：651-664。
Meijer，A.J.，Lorin，S.，Blommaart，E.F和Codogno，P。（2015）。通过氨基酸和MTOR依赖性信号转导调节自噬氨基酸 47（10）：2037-2063。
Mizushima，N.，Yamamoto，A.，Hatano，M.，Kobayashi，Y.，Kabeya，Y.，Suzuki，K.，Tokuhisa，T.，Ohsumi，Y.和Yoshimori，T。（2001）。使用Apg5缺陷小鼠胚胎干细胞解剖自噬体形成 J Cell Biol 152（4）：657-668。
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