材料和试剂

移液器吸头（MidSci，Avant低结合吸头）
35-mm细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：153066）
6孔板（Corning，Falcon ，目录号：353934）
100mm细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：150464）
NIH-3T3细胞（ATCC，目录号：CRL-1658）
3-5周龄K12 rtTA / rtTA / TetO-Cre / Rosa mTmG（见注）
氯胺酮/盐酸100毫克/毫升（KetaJect;亨利沙因动物保健，目录号：010177）
Xylazine AnaSed 100mg / ml（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-362949Rx）
胶原酶A（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10103578001）
Dispase II（Sigma-Aldrich，目录号：4942078001）
制造商：Roche Diagnostics，目录号：04942078001。
丝裂霉素C（Sigma-Aldrich，目录号：M7949-2MG）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
胰蛋白酶（2.5％）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15090046）
Versene（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15040066）
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）不含钙和镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：21068028）
Ham's F12营养物混合物（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11765047）
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10082147）
人重组表皮生长因子（Merck，目录号：GF144）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
氯化钙溶液1M（Sigma-Aldrich，目录号：21115）
人角膜生长补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：S0095）
青霉素 - 链霉素（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140148）
两性霉素B（Thermo Fisher Scientific，目录号：15290026）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11960044）
干细胞培养基（见食谱）
3T3媒体（见食谱）

设备

移液器
显微切割剪刀（Fine Science Tools，目录编号：15000-00）
镊子（精细科学工具，目录号：11252-23）
剪刀（精细科学工具，目录号：14060-09）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：3200）
解剖镜（蔡司，型号：Stemi DV4）
BSL2层流罩（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：1300系列A2，目录号：1387）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientic TM，型号：NAPCO 8000WJ系列）。
离心机（Hettich，型号：Rotina 35）
倒置荧光显微镜（蔡司观察员Z1与apotome附件）（蔡司，型号：AxioObserver Z1）

软件

AxioVison 4.7
ImageJ

程序

去除触须（图1）
1. 牺牲3-5周龄K12 rtTA / rtTA / TetO-Cre / Rosa mTmG小鼠注射氯胺酮/甲苯噻嗪，然后颈椎脱臼。
2. 用剪刀取出装有触须的唇垫并置于干细胞培养基中。
3. 在解剖显微镜下，用镊子和剪刀去除皮下脂肪和结缔组织，暴露出一排排触须。
4. 使用细镊子从垫子上拉下去除个别触须。
  
  图1.从K12 rtTA / rtTA / TetO-Cre / Rosa mTmG报告小鼠中分离毛囊凸起区域A.图该三重转基因小鼠模型显示该系统的可诱导的组织特异性质。 B.显示分离毛囊隆起区域的方案。 bg-bulge区域。部件转载于2009年Blazejewska等人的许可，2009年。
分离毛囊来源的干细胞
1. 通过切割胶原蛋白胶囊暴露出触须的上皮核心，将其从核心上松开并沿着毛干拉下来。
2. 将上皮核心切成三部分（图2）。将包含毛囊膨大区域的中间部分放入含有2ml胶原酶（2mg / ml）的35-mm培养皿中，并且在37℃下用5％CO 2孵育1小时依次去除胶囊的任何残余间充质残余物。
3. 将部分消化的毛囊膨胀区域转移到另一个含有5ml分散酶/胰蛋白酶（2.4U / 0.05％）溶液的35-mm培养皿中，并且在37℃下用5％CO 2 2消化1.5小时一个潮湿的房间，以获得上皮细胞的单细胞悬液。
  
  图2.用于克隆生长测定的方案通过机械分离和酶分解将毛囊的凸起区域分开。将细胞铺在3T3饲养层上并使其形成holoclone（2周时为白色圆圈）。红色通道描绘了膜结合的番茄红色荧光，因为这些细胞来自图1中描述的报告小鼠。
准备饲养层
1. 将丝裂霉素C（40μg/ ml）加入到70％铺满的NIH3T3细胞培养皿中，并在37℃，5％CO 2下潮湿的室中孵育2小时。
2. 用3T3培养基替换丝裂霉素C.
3. 胰蛋白酶消化并以每孔2×10 5个细胞接种于6孔培养板中。
扩增/克隆生长测定
1. 通过在6孔培养皿中以1×10 3细胞/ cm 2接种到丝裂霉素C灭活的NIH 3T3饲养层上来富集干细胞和祖细胞（见上文）。
2. 在37℃和5％CO 2下在潮湿的室中培养14-21天以获得holoclone（图2）。每2天更换一次介质。培养直至获得holoclone。这些将是包含紧密排列的细胞的大型菌落。
毛囊干细胞的传代培养
1. 在室温下用Versene去除3T3饲养层60秒。
2. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗2次
3. 使用胰蛋白酶（0.25％胰蛋白酶-EDTA）在37°C和5％CO 2下除去连接的holoclones 15分钟。
4. 170 g x g离心5分钟
5. 细胞已准备好应用选择（注6）。

数据分析

本协议中提供的条件已经优化以获得holoclone，其基于菌落大小和菌落形成效率进行评估。对毛囊干细胞的分离和克隆扩增的详细分析可以在Blazejewska等人，2009.，Stem Cells 27（3）：642-652中找到。（干细胞2009 27（3）：642-652 ）

笔记

在二级生物安全柜中进行所有细胞培养工作
所有动物方案均由辛辛那提大学的动物管理和使用委员会批准。转基因小鼠系 Krt12rtTA （Chikama 等人，2005年）， TetO-cre （Perl 等人，2002）和Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-tdTomato，-EGFP）Luo / J（ROSAmTmG）（Muzumdar等，<2007>）。通过培养单独的小鼠系来产生化合物转基因小鼠以产生K12 rtTA / rtTA / TetO-Cre / Rosa mTmG。这种双报告小鼠模型使用角蛋白12启动子（角膜上皮特异性）来驱动Tet-on系统的表达。与多西环素和cre联合使用时，膜番茄红毛囊干细胞如果分化为角膜上皮细胞就会变绿。
去除毛囊和暴露上皮核心时不要用镊子损坏凸起区域干细胞时要小心。
所有细胞计数均使用血细胞计数器进行。
通过检查Krt15的表达，可以在平行实验中评估毛囊干细胞培养物的纯度。
生物协议标题“使用纤维蛋白载体将鼠毛囊衍生的干细胞移植到角膜上”（Call等人，2018）证明了使用凸起衍生的毛囊干细胞来治疗小鼠模型的角膜缘干细胞缺乏。

食谱

干细胞培养基
3份DMEM /不含Ca 2 +或Mg 2+ 2+的高葡萄糖 1部分Ham's F12
10％FBS
10 ng / ml EGF
500毫克/升L-谷氨酰胺
0.4 mM氯化钙
1x人体角膜生长补充剂
10,000 U / ml青霉素
10,000μg/ ml链霉素
25μg/ ml两性霉素B
3T3媒体
DMEM-高葡萄糖
10％FBS
10,000 U / ml青霉素
10,000 U / ml链霉素
25μg/ ml两性霉素B

致谢

这项研究部分得到了NIH / NEI EY011845，俄亥俄狮子眼科研究基金会和W.W.K的资助。这项工作是从Blazejewska等人改编的，2009年在Stem Cells上发表。作者没有任何利益冲突。

参考

Blazejewska，E.A.，Schlotzer-Schrehardt，U.，Zenkel，M.，Bachmann，B.，Chankiewitz，E.，Jacobi，C.和Kruse，F.E。（2009）。角膜缘微环境可诱导毛囊干细胞转分化为角膜上皮样细胞。干细胞 27（3）：642-652。
Call，M.，Meyer，A.E。，Kao，W。，Kruse，F。和Schlӧtzer-Schrehardt，U。（2018）。鼠毛囊衍生的干细胞使用纤维蛋白载体移植到角膜上。 Bio-protocol 8（10）e2849。
Chikama，T.，Hayashi，Y.，Liu，CY，Terai，N.，Terai，K.，Kao，CW，Wang，L.，Hayashi，M.，Nishida，T.，Sanford，P.，Doestchman， T.和Kao，WW（2005）。四环素诱导双转基因Krt12 rtTA / +的表征 / tet-O-LacZ 小鼠。 Invest Ophthalmol Vis Sci 46（6）：1966-1972。
Cotsarelis，G。（2006）。上皮干细胞：以毛囊为中心的观点。 Invest Dermatol > 126（7）：1459-1468。
Cotsarelis，G.，Sun，T.T和Lavker，R.M。（1990）。标记保留细胞位于毛囊皮脂腺单位的凸起区域：对毛囊干细胞，毛发周期的影响，以及皮肤癌变。 Cell 61（7）：1329-1337。
Inatomi，T.，Nakamura，T.，Koizumi，N.，Sotozono，C.，Yokoi，N.和Kinoshita，S。（2006）。使用培养的自体口腔粘膜上皮移植进行眼部表面重建的中期结果 Am J Ophthalmol 141（2）：267-275。
Jahoda，C.A.，Whitehouse，J.，Reynolds，A.J。和Hole，N。（2003）。毛囊真皮细胞分化为成脂和成骨谱系。 Dermatol 12（6）：849-859。
Kloepper，J.E.，Tiede，S.，Brinckmann，J.，Reinhardt，D.P.，Meyer，W.，Faessler，R。和Paus，R。（2008）。人类隆起区域的免疫分型：寻求为人类上皮毛囊干定义有用的原位标记细胞和它们的利基。 Dermatol 17（7）：592-609。
Lako，M.，Armstrong，L.，Cairns，P.M.，Harris，S.，Hole，N。和Jahoda，C.A。（2002）。毛囊真皮细胞重建小鼠造血系统 J Cell Sci < / 115>（Pt 20）：3967-3974。
Larouche，D.，Tong，X.，Fradette，J.，Coulombe，P.A。和Germain，L。（2008）。 Vibrissa毛发隆起物容纳两个皮肤上皮干细胞群，其角蛋白分布不同。 FASEB J 22（5）：1404-1415。
Ma，D.H.，Kuo，M.T.，Tsai，Y.J.，Chen，H.C.，Chen，X.L.，Wang，S.F.，Li，L.，Hsiao，C.H.和Lin，K.K。（2009）。培养的口腔黏膜上皮细胞移植用于严重角膜烧伤眼睛（ Lond） 23（6）：1442-1450。
Meyer-Blazejewska，E.A.，Call，M.K.，Yamanaka，O.，Liu，H.，Schlotzer-Schrehardt，U.，Kruse，F.E。和Kao，W.W。（2011）。从头发到角膜：治疗使用毛囊干细胞治疗角膜缘干细胞缺陷。干细胞 29（1）：57-66。
Muzumdar，M. D.，Tasic，B.，Miyamichi，K.，Li，L。和Luo，L。（2007）。全球双荧光的Cre记者鼠标 Genesis 45（9）：593-605。
Nakamura，T.，Inatomi，T.，Sotozono，C.，Amemiya，T.，Kanamura，N.和Kinoshita，S。（2004）。培养的自体口腔黏膜上皮细胞移植治疗严重眼表疾病 < （Br J Ophthalmol）88（10）：1280-1284。
Nishida，K.，Yamato，M.，Hayashida，Y.，Watanabe，K.，Yamamoto，K.，Adachi，E.，Nagai，S.，Kikuchi，A.，Maeda，N.，Watanabe，H.， Okano，T。和Tano，Y。（2004）。使用由自体口腔粘膜上皮组成的组织工程细胞片进行角膜重建 N Engl J Med 351（12）：1187-1196。
Pellegrini，G.，Traverso，C.E.，Franzi，A.T。，Zingirian，M.，Cancedda，R.和De Luca，M。（1997）。用自体培养角膜上皮长期修复受损角膜表面柳叶刀 349（9057）：990-993。
Perl，A.K.，Wert，S.E.，Nagy，A.，Lobe，C.G。和Whitsett，J.A。（2002）。早期限制肺形成期间的外周和近端细胞谱系 Proc Natl Acad Sci USA 99（16）：10482-10487。
Purba，T. S.，Haslam，I. S.，Poblet，E.，Jimenez，F.，Gandarillas，A.，Izeta，A。和Paus，R。（2014）。人类上皮毛囊干细胞及其后代：目前的知识状况，在转化研究方面的差距日益扩大和未来的挑战。 Bioessays 36（5）：513-525。
Richardson，G.D.，Arnott，E.C.，Whitehouse，C.J.，Lawrence，C.M.，Reynolds，A.J.，Hole，N。和Jahoda，C.A。（2005）。啮齿动物和人类毛囊真皮细胞的可塑性：对细胞治疗和组织工程的意义。 J Investig Dermatol Symp Proc 10（3）：180-183。
Shortt，A.J.，Secker，G.A.，Notara，M.D.，Limb，G.A.，Khaw，P.T.，Tuft，S.J。和Daniels，J.T。（2007）。体外移植培养的角膜缘上皮干细胞：技术综述和临床结果。 Surv Ophthalmol 52（5）：483-502。
Taylor，G.，Lehrer，M.S.，Jensen，P.J.，Sun，T.T。和Lavker，R.M。（2000）。卵泡干细胞不仅参与形成卵泡而且参与表皮形成 Cell 102（4）：451-461。
Tiede，S.，Kloepper，J. E.，Bodo，E.，Tiwari，S.，Kruse，C。和Paus，R。（2007）。毛囊干细胞：走迷宫。 Eur J Cell Biol 86（7）：355-376。