材料和试剂

TISSEEL [Fibrin Sealant]（Baxter，目录号：1501261）
胰岛素注射器（Fisher Scientific，目录号：14-829-1A）
制造商：BD，目录号：329420。
6孔板（Corning，Falcon ，目录号：353934）
移液器吸头（MidSci，Avant低结合吸头）
移液管
HFSC光盘
Ethilon 10-0尼龙缝线（Ethicon，目录号：9006G）
显微镜幻灯片（Fisher Scientific，目录号：12-552-3）
Coverglass 22 x 50（Fisher Scientific，目录号：12-548-5E）
凝血酶
C57BL / 6小鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：000664）
K12 rtTA / rtTA / tetO-cre / ROSA mTmG转基因小鼠（见注）
0.9％盐水（Fisher Scientific，目录号：23-535435）
BioGlo荧光素钠眼科条（Hub Pharmaceuticals，NDC 17238-900-11）
强力霉素食物（定制动物饮食，目录号：AD3008）
阿瓦斯丁（贝伐单抗，Genentech，Inc.）
抗炎滴剂 - Inflanefran forte（Allergan，NDC 11980-180）
16％多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
硼氢化钠（Sigma-Aldrich，目录号：71320）
DAPI（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：D3571）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：BP358-1）
氯化钙（CaCl 2 2）（Acros Organics，目录号：349610025）
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）不含钙和镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：21068028）
Ham's F12营养物混合物（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11765047）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10082147）
人重组表皮生长因子（Merck，目录号：GF144）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
人角膜生长补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：S0095）
青霉素 - 链霉素（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140148）
Gibco TM两性霉素B（Thermo Fisher Scientific，目录号：15290026）
磷酸二氢钠，无水（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
磷酸二氢钠，无水（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S8282）
分析级甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G6279）
Mowiol 4-88（Merck，目录号：475904）
Tris（Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
氯胺酮/盐酸100毫克/毫升（KetaJect;亨利沙因动物保健，目录号：010177）
Xylazine AnaSed 100mg / ml（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-362949Rx）
纤维蛋白原溶液（见食谱）
凝血酶溶液（见食谱）
干细胞培养基（见食谱）
0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4（见食谱）
Mowiol安装介质（见食谱）
氯胺酮/赛拉嗪溶液（见食谱）

设备

Algerbrush II角膜除锈环（MicroSurgical Technology，目录号：AM0100）
倒置荧光显微镜（蔡司观察员Z1与apotome附件）（蔡司，型号：AxioObserver Z1）
缝合绑镊子（精细科学工具，目录号：18025-10）
显微切割剪刀（Fine Science Tools，目录编号：15000-00）
Epi-fluorescent立体显微镜（ZEISS，型号：Stemi SVII）
BSL2层流罩（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：1300系列A2，目录号：1387）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：3200）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientic TM，型号：NAPCO Series 8000 WJ）。
解剖镜（蔡司，型号：Stemi DV4）
离心机（Hettich，型号：Rotina 35）

软件

AxioVison 4.7

程序

纤维蛋白载体的制备
1. 在37°C解冻TISSEEL纤维蛋白密封胶（2毫升预装注射器）。
2. 通过将1ml Sealer蛋白（纤维蛋白原）全部内容物注射到1.16ml纤维蛋白原溶液（配方1）中来制备稀释的纤维蛋白。
3. 加入1毫升凝血酶（注射器的全部内容物）至9毫升凝血酶溶液（方案2），制备凝血酶混合物。
4. 通过将1.5ml凝血酶混合物（来自步骤A3）加入到25ml凝血酶溶液中来制备稀释的凝血酶。
5. 向6孔板的一个孔中加入0.75ml稀释的凝血酶（来自步骤A3）。确保稀释的凝血酶溶液均匀覆盖整个孔。
6. 在相同的孔中加入0.75ml稀释的纤维蛋白。逐滴添加到井中，快速与移液器吸头混合。
7. 让凝胶在室温下凝固。纤维蛋白原和凝血酶的最终浓度分别为〜10mg / ml和3IU / ml。凝胶将在约5分钟内凝固。一旦凝胶已经开始进行细胞的培养。
在纤维蛋白载体上培养
1. 将来自双报告小鼠的1×10 5细胞/ ml的毛囊干细胞种到纤维蛋白载体上并在干细胞培养基（方案3）中在37℃，5％ CO <子> 2 。每个孔使用2ml的总体积。使用相差显微镜可以显现细胞（图1）
  
  图1.移植含有来自毛囊的毛囊干细胞的纤维蛋白载体的方案从纤毛蛋白片上培养3天的双报告小鼠的毛囊干细胞（HFSC）制备圆盘使用移液器尖端的背面作为“切割器”。然后将圆盘缝合到角膜缘干细胞缺陷小鼠的眼睛上。放置四根缝合线（红色星号）。细胞荧光红色但不是绿色，因为它们尚未表达角膜上皮分化标志物Krt12。
总的角膜缘干细胞缺乏症（图2）
1. 使用28-G胰岛素注射器通过腹膜内注射麻醉具有氯胺酮（90mg / kg）和甲苯噻嗪（13mg / kg）的6-8周龄C57BL / 6小鼠（配方6）。
2. 使用Alderbrush II角膜除锈器（0.5 mm毛刺）去除角膜和角膜缘上皮，产生全角膜缘干细胞缺陷（注6）。毛囊干细胞移植（见下文）应该立即去除上皮细胞。
3. 使用荧光素染色验证角膜和角膜缘上皮的完全去除
  1. 将0.9％盐水中的荧光素钠眼科胶条尖端浸泡20次。
  2. 使用移液管，将一滴荧光素染剂滴在眼睛上。让我们坐30秒。
  3. 在0.9％盐水中广泛清洗
  4. 使用荧光立体显微镜的图像。
图2.角膜缘干细胞缺乏的方案 algerbrush用于去除角膜和角膜缘上皮。红色圆圈表示部分清创。荧光素染色可用于验证上皮完全去除。注意部分去除（星号）中没有荧光素染色。
毛囊干细胞移植
1. 使用P1000移液枪头的背部准备含有HFSC圆盘的〜7 mm纤维蛋白凝胶（见图1）。
  使用镊子（图1）将光盘放入PBS（注5）。
2. 将含有HFSC的约7mm纤维蛋白载体缝合到角膜缘干细胞缺陷小鼠眼睛的表面上，其中干细胞面对受体的基膜。
  缝线优越，下方，鼻腔和暂时放置（图1）。
3. 手术恢复后，前5天给予抗炎眼药水，接下来7天使用阿瓦斯丁滴眼液。眼药水应该每天给药一次。
转化为角膜上皮细胞
1. 小鼠在3天，1周，2周，3周和5周后进行多西环素饲料（1 g / kg）自由采食。
2. 安乐死小鼠并在样品收集时间点将眼睛摘除，并在4℃下在0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4（方案4）中的4％多聚甲醛中固定过夜，然后进行PBS洗涤。
3. 使用显微切割剪刀解剖角膜
4. 用0.2％硼氢化钠（注7）在室温下处理角膜30分钟，然后用0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤。
5. 用4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1μg/ ml）染色角膜，用盖玻片和Mowiol培养基（配方5）固定在显微镜载玻片上，并用具有apotome附件的Zeiss Observer Z1显微镜观察。

数据分析

AxioVison 4.7。在每个收集时间点采集红色（膜番茄红），绿色（膜EGFP）和蓝色（DAPI）通道的Z-堆叠图像。
在每个时间点都记录了从红色到绿色的转换（图3）。

图3.毛囊隆起源干细胞在角膜上皮细胞中的植入和分化从Z-stack获得的单色图像描绘了膜番茄红和膜EGFP在3天的细胞定位和移植后5周。放大倍率x200。经Meyer-Blazejewska et al。许可重印。2011年。

笔记

制备纤维蛋白凝胶和培养HFSC应在II级生物安全柜中进行。
只要稀释的凝血酶和稀释的纤维蛋白的比例保持1：1，就可以制备纤维蛋白载体的各种尺寸。
所有细胞计数均使用血细胞计数器进行。
所有动物方案均由辛辛那提大学的动物管理和使用委员会批准。转基因小鼠系 Krt12rtTA （Chikama 等人，2005年）， TetO-cre （Perl 等人，2002）和Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-tdTomato，-EGFP）Luo / J（ROSAmTmG）（Muzumdar等，<2007>）。通过培养单独的小鼠系来产生化合物转基因小鼠以产生K12 rtTA / rtTA / tetO-cre / ROSA mTmG 。这种双报告小鼠模型使用角蛋白12启动子（角膜上皮特异性）来驱动Tet-on系统的表达。与多西环素和cre联合使用时，膜番茄红毛囊干细胞如果分化为角膜上皮细胞就会变绿。
当创建并转移纤维蛋白凝胶盘时，务必小心操作，以免损坏细胞。另外，确保光盘放置在PBS中，HFSC朝上。
当用Algerbrush去除上皮时，应注意避免损伤基底膜。这可以通过将Algerbrush按45°角移动并以圆形扫动来移动。
。只用轻微的压力，因为上皮比较容易去除。
处理硼氢化钠时应小心，因为它会对身体和健康造成危害。

食谱

纤维蛋白原溶液
10％NaCl
100 mM CaCl 2 2/2 0.9％NaCl
ddH <2>
凝血酶溶液
10％NaCl
100 mM CaCl 2 2/2 ddH <2>
干细胞培养基
3份DMEM /不含Ca 2 +或Mg 2+ +的高葡萄糖 1份Ham's F12
10％FBS
10 ng / ml EGF
500毫克/升L-谷氨酰胺
0.4 mM氯化钙
1x人体角膜生长补充剂
10,000 U / ml青霉素
10,000μg/ ml链霉素
25μg/ ml两性霉素B
0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4
76 mM Na 2 HPO 4（无水）
27 mM NaH 2 PO 4（无水）
Mowiol安装介质
24克分析级甘油
9.6克Mowiol 4-88
24毫升ddH 2 O
48ml 0.2M Tris-HCl缓冲液，pH8.5
氯胺酮/甲苯噻嗪溶液
2毫升氯胺酮（100毫克/毫升）
0.25毫升赛拉嗪（100毫克/毫升）
7.75毫升PBS

致谢

这项研究部分得到了NIH / NEI EY011845，俄亥俄狮子眼科研究基金会和W.W.K的资助。作者没有任何利益冲突。

参考

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