材料和试剂

CELLSTAR组织培养板96孔（Greiner Bio One International，目录号：655180）
无菌架式移液枪头（1毫升和200微升）（VWR，产品目录号：613-0738; 613-0742）
无菌盆（Corning，Costar ®，目录号：4870）
无菌试剂管（15和50毫升）（VWR，产品目录号：89039-668; 89039-662）
无菌血清移液管（5,10,25,50ml）（Fisher Scientific，目录号：13-678-11,13-678-11D，13-678-11E，13-678-11F）
玻璃瓶（500毫升）（Fisher Scientific，目录号：FB8001000）
HCT-116，SK-Mel-5和SK-Mel-28细胞（ATCC，目录号：CCL-247，HTB-70，HTB-72）
海马XF24 FluxPak（包括传感器滤芯，组织培养板，校准溶液和校准板）（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）
胰蛋白酶/ EDTA（0.25％/ 2.21mM）（Corning，目录号：25-053-C1）
1×Ca2 + / Mg2 + - 不含DPBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190250）
液体达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（Corning，目录号：10-013）
胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11150）
青霉素/链霉素溶液100倍（Corning，目录号：30-002-Cl）
不含HEPES（Corning，目录号：50-013）的不含Na 2 HCO 3的粉末Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）
氢氧化钠（NaOH）（VWR，目录号：97064-476）
Oligomycin（Merck，目录号：495455-10MG）
DMSO（VWR，目录号：BDH1115-1LP）
FCCP（Cayman Chemical，目录号：15218）
鱼藤酮（Cayman Chemical，目录号：13995）
抗霉素A（Enzo Life Sciences，目录号：ALX-380-075-M005）
培养基（10％（v / v）FBS）（见食谱）
检测介质（见食谱）
NaOH（1M）（见食谱）
Oligomycin（10μM）（见食谱）
FCCP（5μM）（见食谱）
鱼藤酮（5μM）/抗霉素A（5μM）（见食谱）

设备

血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1490）
生物安全柜II类，A2型（NuAire，型号：NU-425-400ES）
海马XF细胞外通量分析仪（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉）
Pipet-Lite移液器XLS STD 20 XLS（Mettler Toledo，Rainin，型号：SL-2XLS +）
Pipet-Lite移液器XLS STD 200（Mettler Toledo，Rainin，型号：SL-200XLS +）
Pipet-Lite移液器XLS 1000（梅特勒托利多，Rainin，型号：SL-1000XLS +）
多通道Pipet-Lite移液器XLS 8-CH 1200（梅特勒托利多，Rainin，型号：L8-1200XLS +）
多道移液器移液管XLS 8-CH 200（梅特勒托利多，Rainin，型号：L8-200XLS +）
吸气泵
加湿的非CO 2培养箱（XF Prep Station; Agilent Technologies，Santa Clara，CA）
浅水浴（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Precision 180）
移液器控制器（BrandTech Scientific，型号：Accu-Jet Pro，目录号：26330）
加湿的，37℃，5％CO 2培养箱（Eppendorf，型号：Galaxy 170R）
-20°C生物医学冷冻机（三洋，型号：MDF-U731M）
高压灭菌器（统一灭菌器系统，型号：SSR-3A，ADVPB）
倒置光学显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse TS100）
具有半微电极（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Orion Star TM A211，具有ROSS 8103BN电极的Thermo Fisher pH计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ，产品目录号：8103BN）

软件

海马生物科学XF24软件
Excel（微软）
GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA）

程序

播种密度的优化
在最初的实验中，每种细胞类型都需要最佳的接种密度。通常，细胞密度范围为每孔10,000至60,000个细胞，并且可以在细胞系中广泛变化。第一个取向点可以是约为约1的汇合点的单元格编号。在96孔细胞培养板中95％过夜，因为接种表面与海马培养板相当。在测定当天，播种数应该能够提供一个融合且健康且一致的单层。
1. 使用两步接种技术将HCT-116，SK-Mel-5和SK-Mel-28细胞接种在Seahorse XF24细胞培养板中，浓度范围为10,000至30,000个细胞/孔，如以下程序B图2）。
  推荐三次重复种植细胞
  
  图2.用于细胞密度评估的平板布局这里显示了SK-Mel-5和SK-Mel-28细胞系的示例性播种布局（对于HCT-116细胞的接种密度在第二个板;未显示）。
2. 然后按照程序E（无需将化合物装入端口）在XF24仪器中使用表1命令分析细胞。
  
  表1.用于细胞密度评估的协议命令
  
  如图3所示，在所有三种细胞系中都观察到随着细胞密度增加OCR值线性增加。对于SK-Mel-28和SK-Mel-5，ECAR值开始以20,000个细胞/孔平稳下降，而对于HCT-116而言，ECAR值以低得多且稳定增加。因此，选择SK-Mel-28和SK-Mel-5的20,000个细胞/孔的种子数目和HCT-116的35,000个细胞/孔的接种数目以确保在线性响应范围内，同时具有高读数值以观察增加以及OCR和ECAR的减少。
  
  图3.测定条件的优化：根据三种不同细胞系的接种密度评估OCR和ECAR
将细胞接种到Seahorse XF24组织培养板（第1天）
注意：使用良好的无菌细胞培养技术进行细胞接种和生长。使用两步接种方法获得一致的均匀单层，这对获得一致和准确的数据至关重要：
1. 预温培养基，胰蛋白酶溶液和DPBS至37°C。
2. 对于贴壁细胞，用DPBS洗涤细胞，并添加胰蛋白酶，并等待细胞开始分离。添加含血清的培养基使胰蛋白酶失活并上下移液以制造均匀的细胞悬液。使用血细胞计数器计数细胞，并将细胞重悬于生长培养基中至所需的最终浓度，以100μl种子。
3. 将100μl细胞悬液放入Seahorse XF24组织培养板中。
  仅在背景校正孔（A1，B4，C3，D6）中放置介质（无细胞）。
4. 让培养板在生物罩中放置1小时而不移动它（为了让细胞均匀地沉降）。
5. 将培养板置于培养箱（37℃，5％CO 2）中4小时。
6. 小心添加150μL生长培养基（最终体积250μL）。以一定角度握住移液器尖端并将其添加到井侧，以不破坏新连接的细胞层。
7. 让细胞在37℃，5％CO 2下过夜生长。
注意：以下步骤在无菌技术的情况下执行，但请注意尽可能保持电池和设备的清洁。＆nbsp;
水合物传感器（第1天）
1. 打开XF 24 FluxPak并取出传感器盒（绿色）和校准板（清除）（图4）。
  
  图4.海马XF 24传感器盒。 A.传感器盒位于校准板顶部并显示注射端口。 B.传感器板的底部显示嵌有荧光团的传感器。
2. 将传感器盒（传感器向上）放在校准板旁边（小心不要接触传感器）。
3. 用1毫升Seahorse XF校准剂填充校准板的每个孔。
4. 将传感器盒放到校准板上，将传感器浸入校准液中（小心不要用传感器接触墙壁）。
5. 置于非CO 2 37℃培养箱中过夜。为了防止XF Caldence的蒸发，请确认孵化器是否适当加湿。
仪器的稳定（第1天）
1. 打开XF24分析仪，打开Seahorse Bioscience软件并登录。
2. 写测定模板。在规划和编写化验协议时，请小心不要创建比无缓冲介质中的细胞可以在没有CO 2的情况下管理更长的协议。取决于细胞类型，这是2-3小时。如果有疑问，可以在海马测定后进行细胞活力测定。
3. 保持XF24分析仪在XF24软件运行过夜并登录，以确保平衡至37°C。
海马测定（第2天）
1. 检查细胞汇合。需要均匀的细胞间隔，没有大的细胞团或空白斑块，因为这可能会影响数据的准确性。
2. 预温分析培养基至37°C。
3. 预热化合物，必要时用NaOH（1M）调节至pH 7.4。
4. 在Seahorse XF24组织培养板中进行培养基交换：
  1. 使用多通道移液器移除150μl生长培养基。
  2. 使用多通道移液器加入1 ml检测介质
  3. 用多通道移液器取出1毫升
  4. 用多通道移液器（575μl终体积）添加475μl检测介质
  5. 将细胞培养板置于CO 2自由培养箱中培养约2小时。 60分钟。
5. 加载所需化合物的墨盒：
  1. 预热化合物至37°C。
  2. 将50-100μl化合物装入适当的药筒（用于线粒体压力测试：64μl进入A端口，71μlB端口，79μlC端口，88μlD端口）。（见注1）将等量的测定培养基装入背景孔的等效端口（见注2）。
  3. 放回培养箱（非CO 2）中10分钟以再次加热至37℃。小心操作，只能握住校准板进行搬运。尽可能少移动。
6. 校准和运行海马测定：
  1. 在Seahorse XF24软件中加载分析模板。
  2. 按绿色的“开始”按钮。
  3. 确保加载正确的协议，正确的保存目录并保存名称。
  4. 按'开始'。
  5. 将带有校准板的传感器盒装入仪器托盘（凹槽位于前方，左侧角落，确保平板在所有8个标签之间正确平放）
  6. 按照屏幕上的说明进行校准和平衡传感器。
  7. 一旦完成平衡步骤，取出校准板并更换为细胞培养板。
协议命令（线粒体压力测试，表2，图5）

表2.线粒体压力测试的协议命令

数据分析

结果最初使用海马XF数据查看器进行审查，该数据查看器将数据自动保存为MS Excel（.xls）文件。图形和统计分析使用GraphPad Prism进行。通过非参数Kruskal-Wallis检验以及随后的Dunn's多重比较事后检验来评估观察到的细胞系生物能量学差异的显着性。在所有情况下， P ＆lt; 0.05被认为是显着的。实验值以平均值±标准偏差（图5）或箱形图（图6）报告。

图5.线粒体压力测试在不同浓度注射甲磺卡西林（黑色箭头）后，测量SK-Mel-28细胞的OCR，然后连续注射寡霉素（1μM），FCCP（0.5μM ）和抗霉素A（0.5μM）/鱼藤酮（0.5μM）（n = 3）。

图6. SK-Mel-28，SK-Mel-5和HCT-116细胞的基础生物能状态通过分析OCR / ECAR比率评估每个细胞系的基础能量代谢。使用与上述相同的方案获得OCR和ECAR，但没有注射化合物。协议命令由8个测量的一个循环组成。进行了几次单独的测定（n = 25）。

笔记

以角度吸入端口，不要碰到底部，不要轻敲以防止泄漏。液体只能被毛细管力量保存。
使用含有与化合物相同浓度的DMSO的化验培养基加载背景孔的端口是强制性的，以说明任何DMSO对细胞的影响。
一旦注入孔中，化合物以1:10稀释。这将在细胞培养孔中分别得到1μM寡霉素和0.5μMFCCP，鱼藤酮和抗霉素A的终浓度。

食谱

培养基（10％（v / v）FBS）
注意：在无菌条件下在层流罩中工作
1. 开放式液体DMEM瓶
2. 用无菌血清吸管取出55毫升，并丢弃液体
3. 用无菌血清移液管加50 ml FBS
4. 加入5毫升青霉素/链霉素溶液
5. 在4°C储存
测定培养基（无菌，无缓冲，250毫升）
注意：在无菌条件下在层流罩中工作
1. 高压灭菌器250毫升超纯H 2 O在玻璃瓶中
2. 将不含NaHCO 3且不含HEPES的3,34g粉末DMEM溶解在250ml高压灭菌的H 2 O中。
3. 温暖至37°C
4. 用NaOH（1M）调节至pH 7.40
5. 在4°C储存
NaOH（1M）
将4g NaOH丸粒溶解在100ml高压灭菌的H 2 O中
寡霉素（10μM）
1. 在海马试验当天新鲜准备（第2天）（见注1）
2. 在1ml DMSO中制备1mM溶液：将0.7911mg寡霉素溶解在DMSO中
3. 在测定培养基（1％DMSO）中稀释至10μM：将20μl1 mM寡霉素吸入1,980μl测定培养基中
4. 温至37°C，如有必要，用NaOH（1M）调节至pH 7.4。
FCCP（5μM）
1. 在海马试验当天新鲜准备（第2天）（见注1）
2. 在DMSO中制备50mM溶液：将2.54mg FCCP溶解在200μlDMSO中
3. 稀释至500μM：将10μl50 mM FCCP吸入990μlDMSO中。
4. 在测定培养基（1％DMSO）中稀释至5μM：将20μl500μMFCCP吸入1,980μl测定培养基中
5. 温至37°C，必要时用NaOH（1M）调节至pH 7.4。
鱼藤酮（5μM）/抗霉素A（5μM）
1. 在海马测定当天新鲜准备（第2天）（见注1）。
2. 准备在DMSO中的50mM溶液：在200μlDMSO中溶解3.94mg鱼藤酮和5.49mg抗霉素A
3. 稀释至1mM：将10μl50mM鱼藤酮/抗霉素A吸入490μlDMSO中
4. 在测定培养基（0.5％DMSO）中稀释至5μM：将20μl1 mM鱼藤酮/抗霉素A吸入1,980μl测定培养基中
5. 温热至37°C，如有必要，用NaOH（1M）调节至pH 7.4。

致谢

这项工作主要由俄勒冈州立大学启动资金支持。 B.P.感谢DFG（Deutsche Forschungsgemeinschaft）博士后资助（PL 799 / 1-1）。我们希望感谢Napur Pande博士提供SK-Mel-28细胞，并感谢Bioviotica（Prof. Axel Zeeck博士和Hans-Peter Kroll）提供的mensacarcin。我们要感谢Elizabeth N. Kaweesa对本协议的帮助，并感谢Jeffrey D. Serrill博士和Jane E. Ishmael教授提供关于海马实验的信息和反馈。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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Plitzko，B.，Kaweesa，E.N.和Loesgen，S。（2017）。天然产物mensacarcin诱导黑色素瘤细胞的线粒体毒性和细胞凋亡。 J Biol Chem 292（51）：21102-21116。
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