材料和试剂

1.5 ml离心管（南京青科生物公司）
50毫升离心管（南京青科生物公司）
长盆（20厘米高x 5厘米直径），手工制作，PVC管带有一个带孔的底盖
Parafilm（Bemis，目录号：PM996）
压入式Saran Wrap（GLAD R ，Pressin Seal，21.6 m x 30 cm），一种可以压在表面上以密封物体的粘性saran包装
圆锥形瓶（200毫升）
纸巾（230 x 225毫米，永利郁投资有限公司，五月花，产品编号：A18250S）
用精梳棉制成的奶酪布（40S经纱×40S纬纱; 5米×1.2米）
土壤（南京首德公司，营养土：蛭石= 2：1）
注射器针头（Luer-Lok 20G，BD，目录号：309634）
塑料方盘（购自市场）（100厘米长×80厘米宽×10厘米高）
玉米种子（自交系：B73;选择发芽率> 90％的相似大小的种子）
真菌菌株：禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）（分离株：F0609）; F。 verticillioides （分离：7600）
无菌ddH <2>
甘油
PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）（青岛希望生物技术有限公司，产品目录号：HB0233）
Tween-20（SunShine Bio，目录号：T0014）
绿豆（从市场购买）
PDA媒体（见食谱）
绿豆汤（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf，Research Plus，产品目录号：3120000020,3120000046,3120000062）
血细胞计数器（0.100毫米，Hausser科学，目录号：3110）
水浴（常州诺基仪器，目录号：HHS-11-1）
洁净工作台（AIRTECH，型号：SW-CJ-1FD，目录号：A16116317）
恒温培养箱（宁波江南仪器厂，目录号：DNP-9162）
生长室（宁波江南仪器厂，型号：RXM-508C-3，产品编号：17091559）
离心机（Eppendorf，型号：5424，目录号：5424FL570190）
显微镜（奥林巴斯，目录号：BX41）
高压灭菌器

程序

越来越多的玉米幼苗
1. 在用PVC圆柱体（直径5厘米，深20厘米）制成的长盆中的土壤中播种不同玉米自交系的种子，每个圆柱4粒种子，覆盖一层2厘米厚的土壤。为了证明茎腐病表型，可以包括由杨等人（2010）描述的抗性品系1145和对赤霉病茎腐病的敏感品系Y331作为对照。
2. 将盆放置在受控的生长室（光周期和温度：26±2℃14光/ 10黑暗;光强度：600勒克斯）以允许幼苗生长。
3. 在大约12天到2周龄阶段选择相似大小的幼苗，并转移到培养室进行感染测定。
制备真菌孢子悬浮液
1. 真菌菌株培养
  真菌分离物（ F. graminearum 或 verticillioides ）最初储存在-80℃的20％甘油中。在PDA平板上接种真菌分离物，并在黑暗中孵育器（25°C）中孵育至少10天。
2. 刺激孢子形成
  无菌条件下切几块琼脂块（5×5毫米），并将它们放入灭菌的绿豆汤中，并在培养箱中以200rpm，28℃孵育2-3天（图1）。
  
  图1.绿豆汤与 F。 graminearum 培养2天
3. 孢子枚举和接种物的准备
  通过两层奶酪布过滤绿豆汤中的孢子悬浮液，然后在3,800gxg离心5分钟。丢弃上清液，用无菌水重新悬浮并洗涤浓缩的分生孢子两次，然后在0.001％Tween-20中稀释至浓度为1.0×10 6 / ml / ml。
用真菌孢子接种幼苗茎
1. 玉米苗的制备
  将塑料方形托盘（100 x 80 x 10厘米）放在受控的孵化室中（光周期和温度：24±2°C时14光/ 10暗;光强度：200勒克斯）。要在托盘内保持高湿度（〜75％），请在托盘底部的一层纸巾中加入250 ml无菌水，直至毛巾完全湿润。如果需要，丢弃额外的水。
  在托盘中水平放置幼苗盆（图2）。
  
  图2.预接种环境的布置将玉米种子种植并在控制室中的PVC圆筒中生长12-14天。带秧苗的花盆然后水平排列在一个托盘上，一层纸巾完全浸湿在托盘底部。
2. 人工接种过程
  为了促进真菌孢子的感染，使用注射器针头（图3，视频1）在苗茎的第一节间的中间位置打出约1mm深度的小孔，然后将20μl的孢子悬浮液以0.001％ Tween-20小心使用移液管（图4，视频2）到受伤部位。用压入式saran包装密封塑料方形托盘以保持湿度。为了进行换气，在包装上制作6-8个均匀的带孔（约2厘米长）。感染后，将幼苗保持在24±2℃下14小时光照/ 10小时黑暗条件下3天，而不移动（图5）。每天检查湿度以确保大约75％的高湿度。
  如有需要，请加水
  
  图3.在玉米幼苗茎上打孔
  
  图4.用孢子悬浮液接种玉米茎。将0.001％Tween-20中的20μl孢子悬浮液滴到苗茎上的受伤部位。
  
  图5.接种后幼苗的维护使用压入式saran包装将塑料方形托盘密封以保持湿度＆gt; 75％。盖表面上有几个均匀的孔。
  托盘在受控状态下保持稳定，14±2小时黑暗，24±2℃
  视频1
  
  视频2

数据分析

疾病严重程度评分等级
在人工接种后3天对茎秆腐烂症状进行评分，至少有三个评分（每个玉米品系每个评分15-20个秧苗）。基于从三个或更多评分中收集的数据，使用从1（最高抗性）到5（最高敏感性）（图6）的5分类尺度评估每个单株植物的疾病严重性。表1中描述了玉米秸秆腐烂症状的评级标准。

图6.通过5分类分级量表的幼苗的表型特征CK：未接种的对照; 1，最有抵抗力; 5，最易感染。

表1.玉米幼苗的赤霉病茎锈病的鳞片和评分标准
计算疾病严重程度指数（DSI）
根据Ma等人（2017年）描述的公式计算DSI并进行一些修改：
DSI（％）=Σ（排名值x具有该值的植物数量）×100 /（1×植物总数）。所有统计分析均使用SPSS（14.0）软件进行方差分析和Student's检验，其显着性水平设定为 P 0.05。

笔记

选择健康，无压力和均匀的幼苗进行感染测定。
接种后如果接种物立即从感染部位滴下，则重新感染。
维持适当的湿度和温度是成功开发和渗透真菌病原体的关键

食谱

PDA媒体（200毫升）
9.2克马铃薯葡萄糖琼脂粉溶于200毫升ddH2O中
用高压灭菌器在120°C灭菌15分钟
绿豆汤（1升）
1. 在85℃水浴中将40g绿豆在250ml ddH2O中煮沸1小时
2. 然后过滤一层纱布，并在高压灭菌的ddH 2 O中稀释至1L。
3. 在120°C下消毒15分钟

致谢

该协议部分适用于我们以前的工作（Gao等人，2007年），并进行了一些修改。这项工作得到了中国国家重点研究与发展计划（编号2016YFD0101002），国家自然科学基金委编号（编号31471508，编号31670702）的支持，并得到了中国人事部选定华侨华人科技基金会的支持（No G0101500090）和江苏省高校创新团队项目（2014）。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Gao，X。，Shim，W. B.，Gobel，C.，Kunze，S.，Feussner，I.，Meeley，R.，Balint-Kurti，P.和Kolomiets，M.（2007）。玉米9-脂氧合酶的破坏导致对真菌病原体的抗性增加和霉菌毒素污染水平降低伏马菌素。 Mol Plant Microbe Interact 20（8）：922-933。
Ma，C.，Ma，X.，Yao，L.，Liu，Y.，Du，F.，Yang，X.和Xu，M.（2017）。 qRfg3，一种新的抗玉米赤霉病茎锈病的定量抗性基因座。 Theor Appl Genet 130（8）：1723-1734。
Mesterhazy，A.，Lemmens，M.和Reid，L.M。（2012）。抗镰刀菌引起的穗腐病育种 spp。在玉米 - 评论。植物育种 131：1-19。
Oerke，E.C。（2006）。作物对害虫的损失。农业科学杂志 144：31-43。
Presello，D.A.，Botta，G.，Iglesias，J.，Eytherabide，G.H。（2008）。疾病严重度对产量和谷物591伏马菌素浓度的影响的玉米杂交种接种'Fusarium verticillioides 。“作物保护 27：（3-5）：572-576。
Walter，S.，Nicholson，P。和Doohan，F.M。（2010）。镰刀菌病疫病期间宿主和病原体的作用和反应< / a> New Phytol 185（1）：54-66。
Yang，Q.，Yin，G.，Guo，Y.，Zhang，D.，Chen，S.and Xu，M。（2010）。抗玉米赤霉病茎腐病的主要QTL。 Theor Appl Genet 121：673-687。