材料和试剂

玻璃底细胞培养皿类型35毫米和尺寸20毫米（巢科学，目录号：801001）
盖玻片厚度1号圆形大小18毫米Ø（MARIENFELD，目录号：0111580）
培养皿，100毫米Polysterene无菌非组织培养物处理（SPL Life Sciences，目录号：10095）
15 ml锥形管（SPL Life Sciences，目录号：50015）
10毫升血清移液器（SPL Life Sciences，产品目录号：91010）
50毫升锥形管（SPL Life Sciences，目录号：50050）
细胞过滤器70微米（Corning，Falcon ，目录号：352350）
怀孕雌性Sprague Dawley大鼠（E17-E18天妊娠，东方朝鲜）
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P6407-5mg）
用于制备1L溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P3813）的磷酸盐缓冲盐水粉末，pH7.4。
CM-H 2 DCFDA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C6827）。
二甲基亚砜（DMSO）（Merck，目录号：317275）
用于活细胞成像的MitoSOX TM线粒体超氧化物指示剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：M36008）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）粉末，pH 7.4，用于制备适合细胞培养的1 L溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P3813）
胰蛋白酶（2.5％），无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15090046）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10082147）
Neurobasal Medium（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：21103049）
B-27 TM补充物（50x），无血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17504044）
DMEM高葡萄糖（4.5 g / L），含L-谷氨酰胺，丙酮酸钠（Capricorn Scientific，目录号：DMEM-HPA）
青霉素/链霉素（100x）（PS）（Capricorn Scientific，目录号：PS-B）
淀粉状蛋白β肽1-42人（ANYGEN，目录号：AGP-8338）
CM-H 2 DCFDA溶液（见食谱）
MitoSOX ^{TM Red解决方案（请参阅食谱）}
聚-D-赖氨酸氢溴化物溶液（见食谱）
准备培养基（见食谱）
培养基（见食谱）
保持培养基（见食谱）

设备

血细胞计数器（MARIENFELD，目录号：0630010）
原装便携式移液助流™移液器控制器（Drummond Scientific，目录号：4-000-100）
修整剪刀（Surgimax Instruments，目录号：85-112-12）（图1A 1）
解剖剪刀（Surgimax Instruments，目录号：85-127-10）（图1A 2）
解剖剪刀（Surgimax仪器，目录号：63-175-11）（图1A 3）
春季敷料钳Sharp（Surgimax Instruments，目录号：85-076-11）（图1A 4）
Spring Dressing Forceps Blunt（Surgimax Instruments，目录号：85-073-15）（图1A 5）
多用途镊子（Surgimax Instruments，目录号：05-177-11）（图1A 6）
洁净工作台（HANBAEK Scientific Technology，产品目录号：HB-402）
细胞培养CO 2培养箱（ARA，目录号：APR150）
水浴（Grant Instruments，JB Academy，产品目录号：JBA18）
离心机（Hanil Scientific，目录号：Combi 514R）
具有活细胞成像系统的共聚焦显微镜（Carl Zeiss，型号：LSM700）（图1B和1C）

图1.实验设备A.手术器械; B.具有活细胞成像系统的共聚焦显微镜（LSM700）; C.活细胞室。

软件

为了度量
1. ZEN黑色版（蔡司共焦显微镜LSM700软件）
  注：这是ZEISS共聚焦显微镜提供的默认程序。
用于分析
1. ZEN蓝色版（ZEISS共聚焦显微镜LSM700软件; SR-DIP软件ZEN蓝色版）
2. ImageJ（ ImageJ 是一个开源的图像处理程序）

程序

在这个协议中，我们介绍了在氧化应激下原代神经元细胞中两种类型的ROS测量。

事先，用于活细胞成像的35mm板在4℃下用2ml聚-D-赖氨酸溶液涂覆24小时。
可选：不使用35 mm培养皿进行ROS测量，可采用以下方法。将无菌玻璃盖平放在6孔板的每个孔中。向每个孔中加入2ml聚-D-赖氨酸溶液并在4℃下涂覆24小时。
取出聚-D-赖氨酸溶液并用冷PBS洗两次。
在E17大鼠胚胎正在准备时，在板凳上干燥涂层板。
使用敷料剪（设备3）和春季敷料钳Blunt（设备7）小心地从Sprague Dawley大鼠中取出E17〜E18胚胎。将它们放入装有冷的Prep培养基的培养皿中（图2A-2D）。
注意：在这个实验中，用CO 2 2 em麻醉孕妇Sprague Dawley大鼠，并使用CO em em 安乐死>胚胎提取后的 2 。所有实验程序均经成均馆大学机构动物护理和使用委员会批准后进行。
使用解剖剪刀（设备5）和春季修整镊子夏普（设备6），仔细从子宫和胚胎袋中取出单个胚胎（图2E-2F）。
使用解剖剪刀（设备4）和多用途镊子（设备8），切除E17-E18胚胎的头皮和颅骨并拔出整个大脑。将提取的大脑置于Prep培养基中（图2G-2I）。
注意：对于正确的细胞条件，此过程（步骤4-6）应在15-20分钟内完成。

图2.妊娠Sprague Dawley大鼠胚胎提取过程（E17-E18）（步骤4-6）
取出胚胎的大脑后，将其置于预备培养基中，如图3A所示。
如图3B所示，解剖整个大脑的大脑皮层。
注意：将胚胎脑部的皮层分开时，必须注意不要将其他部分分开。当您从步骤7进入步骤8（图3A至图3B）时，将微型镊子插入皮层内侧和纹状体外部之间，然后从胚胎脑切下皮层。正如您在图3A中看到的那样，皮层在包围大脑其他部分时在表面上。
在皮质下方的内侧有纹状体。
去除大脑皮质外的脑膜和血管（图3C）。
如图3D所示将大脑皮层置于Prep培养基中注意：
1. 去除如图3所示的脑膜和血管后，去除附着于皮质内侧的海马部分。您可以使用皮质部分进行皮质神经元细胞培养，或者您可以用海马部分进行海马神经元细胞培养。
2. 对于正确的细胞条件，这个过程（步骤7-9）应该在20-25分钟内完成
图3.从提取的全脑中提取皮层区域的过程（步骤7-9）
将大脑皮质转移到装有2ml Prep培养基的锥形管（15ml大小）中，并加入300μl胰蛋白酶溶液使最终浓度达到约10％（图4A）。
将锥形管置于37°C培养箱或水浴中，并定期轻轻敲击（图4B）。
约15分钟后，使用10毫升一次性吸管小心悬浮细胞（图4C）。
在管中加入400μlFBS至10％浓度并小心悬浮细胞。
过滤细胞通过一个70微米尼龙细胞滤网获得单细胞悬液（图4D）。
用2ml培养基稀释细胞后，在35mm培养皿中将细胞接种于1×10 6个细胞中，并将细胞在37℃培养箱中培养18小时（图4E和4F）。
用2毫升维持培养基替换培养皿中的培养基。
注意：如果细胞在培养基中维持时间过长，其他脑细胞类型包括小胶质细胞和星形胶质细胞很可能会长大。因此，细胞接种后12-18小时应将培养基替换为维持培养基。
将35毫米培养皿中的一半培养基换成新的1毫升维持培养基。

图4.制造脑组织单细胞并准备细胞接种的过程（步骤10-17）
在播种后进行实验至少7天使细胞生长（图5）。
注意：当您将细胞接种时，培养基中会出现各种脑细胞（神经元，小胶质细胞，星形胶质细胞）。然而，在用维持培养基置换后，只有神经元细胞保持特异性，因为除了神经元细胞以外的所有其他类型的细胞都被构成维持培养基的B-27除去。

图5.第1天（A）和第8天（B）后的细胞形态。比例尺，A =500μm; B = 200微米。
在ROS诱导条件下孵育细胞约24小时注意：在本方案中添加5μM低聚Aβ1-42 em / em是为了诱导ROS，但它可能因您的实验条件。 Aβ1-42已知可诱导ROS（Andrey等人，2004，Shelat等人，2008）。 >
然后用1μlCM-H 2 DCFDA溶液（5mM）或MitoSOX TM Red溶液（5mM）处理20分钟。
注意：MitoSOX ^{TM 是线粒体超氧化物和CM-H 2 2 than superoxide（O 2 ^{- < / SUP> ）。因此，即使两种化学品同时加工，它们也会被标记不同的ROS。然而，难以区分两种类型的ROS并分析共焦图像中的荧光。我们建议分开准备样品并进行每个实验。
可选：本部分提供了另一种准备样本以捕获活细胞图像的选项。如果您在盖玻片上培养细胞，请仔细将盖玻片放入新的35毫米活细胞成像皿中。将细胞贴在底面的盖玻片侧面}}
用新的2毫升维持培养基更换。
注意：预先设定活细胞成像的条件; 37°C和5％CO 2 是必需的，因为我们希望保持原代神经元细胞的生长条件。
使用共焦显微镜，测量由MitoSOX TM（510 / 580nm，参见图6）或CM-H 2 DCFDA（495 / 520nm，参见图7 ）。由于荧光不会持续很长时间，因此建议在30分钟内测量。

图6.用MitoSOX TM Red检测大鼠原代神经细胞线粒体中的超氧化物用超氧化物氧化MitoSOX TM Red试剂产生红色荧光。 A.明场大鼠原代细胞图像; B.超氧化物产生的红色荧光; C.合并图像。比例尺= 50微米。

图7.使用CM-H 2 DCFDA测量在大鼠原代细胞中由Aβ诱导的细胞内区室中的ROS。绿色荧光表示Aβ或媒介物处理的样品的细胞内ROS水平。 A.载体处理的样品; B.5μM的Aβ处理的样品。比例尺= 50微米。

共聚焦图像测量设置
您可以按照图8中的流程使用共聚焦显微镜测量ROS的水平：
1. 运行Zen黑版。
2. 点击'Acquisition'选项卡中的'Smart Setup'按钮，选择合适的激发/发射波长（MitoSOX TM或CM-H 2 DCFDA）（图8 A1）。
3. 设置染料的适当激发/发射波长，并在“搜索”选项卡中选择图像颜色（图8C 2）。
4. 点击“最佳信号”按钮。
5. 将样品放在活细胞成像室（图1C）。
6. 点击'定位'标签并调整共聚焦显微镜的焦点（图8B 3）。
7. 设置显微镜的焦点后，点击'采集'标签中的'设置曝光'按钮。
  注意：'设置曝光'会自动调整检测器的增益值（图8A）。
8. 点击“Live”按钮（图8A）。
  注意：'Live'会持续扫描实时图像。
9. 要在'实时'条件下获得更清晰和更准确的图像，请调整'增益'，'数字偏移'，'数字增益'，'针孔'和激光功率（图8D 5）的每个值。您还可以调整“速度”和“平均”以获得更好的图像。
  注意：在这个实验中，“速度”设置为7，“平均”数量设置为8.（图9）
10. 点击'Snap'按钮获取图像（图8A）。
  注：所有样品应在相同条件下测量。测量方法基于共焦设备的说明。
图8. ZEN黑色版图像测量程序的测量方法流程图

图9.用于在ZEN黑色版本中控制“速度”和“平均”的选项卡

数据分析

测量ROS的共焦图像可以通过量化荧光强度用于统计分析。该协议提供了两种方法。

使用基本共焦驱动程序的测量方法（见图10）。

图10. ZEN蓝色版本的分析流程图运行由Zeiss共焦设备提供的分析工具Zen Blue版本。打开要分析的图像，然后单击“分析”选项卡。按'Setup Image Analysis'按钮设置分析方法（见图10-1）。按顺序输入正确的分析条件。特别是，设置适当的阈值（当您点击CM-H <2> DCFDA发出荧光的区域时，将自动设置默认值）（必须设置分析设置值基于阳性对照设置，所有待分析图像的设置应同样适用）。确定要测量的区域，如图10-4所示。设置想要获得的结果（荧光平均值，标准偏差，荧光点数，等等），然后按'完成'按钮。最后，按'分析'按钮检查值。
使用ImageJ的测量方法（见图11）

图11. ImageJ的分析流程图要使用ImageJ测量荧光强度，需要执行几个预备步骤。打开要分析的图像后，必须分离要测量的荧光区域（在流程图3中，在调整阈值时设置要测量的范围，参见图11-2,11-3）。点击如图4所示的“设置测量”选项卡，设置您想要获得的结果。点击“测量”标签并获得结果。

笔记

在测量荧光之前20分钟，应用MitoSOX TM或CM-H 2 DCFDA处理每个实验组。您不应该在实验样品中同时处理MitoSOX TM和CM-H 2 DCFDA（步骤19）。
如果不维持细胞生长条件，则ROS测量值将不准确。所以，在拍摄共焦图像之前，至少要等待10分钟的稳定时间（步骤21）。
当培养原代神经元时，在细胞接种后延迟培养基更换导致培养细胞中神经元百分比的降低（步骤16）。

食谱

CM-H 2 DCFDA溶液（5mM）

在17μlDMSO中溶解50μgCM-H 2 DCFDA（50μg/ 1瓶）
MitoSOX TM Red溶液（5 mM）

在13μlDMSO中溶解50μgMitoSOX TM Red（50μg/ 1瓶）
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐溶液
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（5毫克/瓶）
50毫升无菌超纯水
准备培养基
PBS 45毫升
5毫升PS
培养基
500毫升DMEM
50毫升FBS
5毫升PS
维护培养基
50毫升Neurobasal媒体
1毫升B-27补充剂
500μlPS

致谢

这项研究得到了基础科学研究计划通过韩国国家研究基金会（NRF）资助的赠款（2012R1A5A2A28671860，2017M3C7A1048268）的支持，韩国教育，科学和技术部。作者声明他们没有利益冲突要申报。

参考

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