材料和试剂

用于呼吸道基底细胞扩张
1. 6孔组织培养板（Corning，Falcon ，产品目录号：353046）
2. 150mm组织培养处理的培养皿（Corning，目录号：430599）
3. T175培养瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：159910）
4. 500毫升过滤装置（Merck，产品目录号：SCGPU05RE）
5. 804G电池
  注：804G是一种大鼠膀胱上皮细胞系。它分泌富含层粘连蛋白和胶原蛋白的基质蛋白。 804G条件培养基可以用作具有成本效益的涂层培养基。
6. 上皮基底细胞培养基（Lonza，目录号：CC-3118或PromoCell，目录号：C-21170）
7. 气道培养基LHC-9（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12680013）
8. A8301（TGF / SMAD信号传导的拮抗剂，Tocris Bioscience，目录号：2939）
9. DMH-1（BMP4 / SMAD信号传导的拮抗剂，Tocris Bioscience，目录号：4126）
10. CHIR99021（WNT信号传导的激动剂，Tocris Bioscience，目录号：4423）
11. Y27632（ROCK抑制剂，Tocris Bioscience，目录号：1254）
12. 胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
13. 青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
14. Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190144）
15. RPMI 1640培养基，GlutaMAX TM补充物（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：61870036）
16. 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：16000-044）
17. 完整的气道基底细胞培养基（见食谱）
用于气道液体界面分化
1. 0.22微米过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGP033RS）
2. 带有0.4μm孔径聚酯膜插入物，无菌（Corning，目录号：3470）的6.5mm 2 Transwell TM，将12个插入物包装在24孔板中。
3. 带有0.4μm孔聚酯膜插入物，无菌（Corning，目录号：3460）的12mm 2 Transwell TM，将12个插入物包装在12孔板中。
4. PneumaCult TM -ALI培养基（STEMCELL Technologies，目录号：05001）
5. 氢化可的松（STEMCELL Technologies，目录号：07904）
6. 肝素溶液（STEMCELL Technologies，目录号：07980）
7. 氯化钠（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9759）
8. 100％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
9. 完整的ALI中（见食谱）
10. 氢化可的松溶液（见食谱）
用于免疫荧光

幻灯片Thermofrost（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，产品目录号：12-550-15）
Fisherbrand TM覆盖眼镜：矩形（Fisher Scientific，Fisherbrand TM TM，目录号：12-544-E）
2毫升Eppendorf管（Eppendorf，目录号：022431048）
ImmEdge疏水屏障PAP笔（Vector Laboratories，目录号：H-4000）
Fluoromount-G（SouthernBiotech，目录号：0100-01）
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：62247）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-500ML）
4％多聚甲醛（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-281692）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A2153-100G）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903）
OCT化合物（Fisher Scientific，目录号：23730571）
一抗和二抗（见下表1）

表1.用于免疫荧光的一级和二级抗体

设备

250毫升瓶（Corning，PYREX®，产品目录号：1395-250）
在37℃下用5％CO 2（CO 2水夹套培养箱，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：3111 ）
移液器（PIPETMAN L入门套件，Gilson，产品目录号：F167350）
用15毫升和50毫升离心管（Beckman Coulter，型号：CS-6）用摆动斗转子离心
真空泵
无菌层流罩（The Baker Company，Sterilgard II）
止血钳或镊子
手术刀
37°C水浴（VWR，目录号：89501-468）
4°C冷藏室
倒置光学显微镜（尼康，diaphot TMD）
奥林巴斯Fluoview FV10i共聚焦显微镜
奥林巴斯IX81倒置荧光显微镜（奥林巴斯，型号：IX81）

软件

ImageJ软件（从 https://imagej.nih.gov/ij/ 下载）

程序

第一部分：人类呼吸道基底干细胞的系列扩张

“完整的气道基底细胞培养基”的制备（见配方1）
制备804G条件培养基
1. 在RPMI + 10％FBS + 1：100青霉素/链霉素（任选）的15平方米培养皿或T175培养瓶中培养804G细胞直至达到汇合。每天更换媒体。
2. 一旦细胞达到融合状态，向每个培养皿或烧瓶中加入大量的培养基（60-100 ml）。
3. 从这一点开始，将收集培养基制成804G条件培养基。每隔一天更换一次。收集富含基质蛋白的上清液。该收藏最多可以进行4次。将所有收集的上清液合并，通过0.4μm过滤器单元过滤并分装在250ml瓶中。 804G条件培养基可以在4°C下保存2个月，-20°C保存1年。
人类呼吸道基底细胞的培养和系列扩张（图1A和1B）
1. 使用先前报道的方案（Fulcher等人，2005）从新鲜的废弃肺组织中分离人气道基底细胞。确保您已获得机构审查委员会的适当授权，以获取人体样本进行实验。
2. 用于所有气道基底细胞培养的预涂层培养板。为了涂布平板，添加足够的804G条件培养基以覆盖可培养区域（参见表2），在37℃孵育平板过夜或至少2小时。尽可能多地吸取804G条件培养基或用PBS短暂冲洗。这是我们的经验，人类原代呼吸道基底细胞更喜欢804G涂层胶原蛋白，纤连蛋白，基质胶和其他涂层介质的组合。在804G包被的平板上培养的人气道基底细胞的形态优于在胶原包被的平板上培养的那些。然而，如果您要培养小鼠细胞而不是人类细胞，胶原蛋白涂层的平板或未涂层的平板是首选。
  培养气道基底细胞在804G涂层板上的'完全气道基底细胞培养基'中，直至它们达到80-90％汇合。每天更换媒体。根据我们的经验，初始细胞密度对细胞形态和细胞增殖速率的影响最小。您可以在3％至30％的汇合点启动细胞培养。对于常规的细胞维持，我们启动10-20％汇合的细胞;
  4天后细胞会达到80-90％的融合。
  
  表2.涂覆培养板所需的804G条件培养基的大致体积
  
  图1.人气道基底细胞的连续扩增和免疫荧光表征A.人气道基底细胞连续扩增的示意图。 B.细胞接种后不同天数的人类基底细胞的相差图像（初始接种密度为10-15％）。比例尺= 50微米。 C.基底干细胞标记物（CK5和p63）和气道特异性转录因子（NKX2.1和FOXA2）在培养的气道基底细胞（第6代）上的免疫荧光。比例尺= 20微米。
3. 为了分裂细胞，用PBS洗涤细胞，然后加入足够量的0.5％胰蛋白酶以覆盖细胞并在37℃孵育。 3分钟后在显微镜下监测细胞解离。当细胞松动时，加入DMEM（或RPMI）+ 10％FBS停止胰蛋白酶消化。将细胞悬液轻轻转移到离心管中。
4. 在室温下300×g离心细胞5分钟。
5. 吸取上清液，并在适当体积的“完整的气道基底细胞培养基”中重悬细胞沉淀。以期望的密度（从5-20％汇合）播种气道基底细胞。
6. 每天更换培养基以保持良好的细胞形态及其指数增殖率。对于6孔板，每孔加入1.5 ml至2 ml。
7. 当细胞达到80-90％汇合时，按照与上述相同的程序以1:10再次分裂它们。人类呼吸道基底细胞的人口倍增时间约为30-35小时（Mou等人，2016年），因此如果细胞按1:10分开。
培养的气道基底细胞的免疫荧光表征。（图1C）
1. 在连续扩张的过程中，每3-4次评估气道基底细胞的干度。（a）干细胞标志物（p63和CK5）和气道特异性标志物（NKX2.1和FOXA2）的表达; （b）具有强大的增殖潜力，这意味着细胞可以以指数速率自我更新; （c）具有分化潜能，这意味着细胞可以分化为主要类型的气道上皮，包括基底细胞，纤毛细胞，球状细胞和黏蛋白分泌杯状细胞（参见第II部分和图2）。
  注：给定气道基底细胞系的最大传代次数，直到它的增殖潜力完全耗尽，是可变的，并且是单个细胞系依赖性的。气道基底细胞可以在本文所述的建立条件下长时间扩张。我们通常能够使细胞通过25代或更长时间，同时基于粘液产生杯状细胞和具有纤毛的纤毛细胞的染色来保持总体分化效率。但是，这一潜力可能会随着每一段文字而下降。我们已经报道，延长的培养会影响一些生理功能，如CFTR表达和氯化物电导（Mou et al。，2016）。通道功能在细胞通道中的偏角速度比在增殖和产生气道上皮能力方面的偏角速度快。因此，“工作最大通过次数”的建议取决于要进行的细胞分析。例如，如果有意研究CFTR通道生物学，我们建议以1:10的分裂比例使用比“6-8”更“年轻”的细胞。然而，如果一个人的目标是产生气道上皮细胞或研究气道上皮对细胞因子和病原体的反应，他/她可以扩大细胞的更多传代。基于我们的数据，即使在第20代时也从气道基底细胞分化的气道上皮仍然强烈响应IL-13以诱导杯状细胞增生。
  
  图2.在气道 - 液体界面上在transwell膜上培养的人呼吸道基底细胞的粘液分化A.用于分化气道基底细胞的Transwell®可渗透支持物的示意图描述 ; B.气液界面分化的示意策略; C.在不同时间点的ALI培养物的主要气道上皮培养物的相差图像。
2. 将细胞用4％多聚甲醛（PFA）在室温下固定5分钟。
3. 用PBS + 0.2％Triton X-100清洗细胞三次。每次洗涤间隔在室温下用洗涤缓冲液孵育细胞30秒。
4. 用在PBS + 1％BSA中稀释的初级抗体覆盖细胞并在室温下孵育2小时或在4℃下过夜。例如，加入100μl抗体溶液到48孔板的每个孔中，或者将500μl抗体溶液加到12孔板的每个孔中。
5. 用PBS + 0.2％Triton X-100清洗细胞四次。每次洗涤间隔在室温下用洗涤缓冲液孵育细胞30秒。
6. 用在PBS + 1％BSA中稀释的荧光缀合的二抗覆盖细胞并在室温下孵育1小时（避光）。例如，加入100μl抗体溶液到48孔板的每个孔中，或者将500μl抗体溶液加到12孔板的每个孔中。
7. 用PBS + 0.2％Triton X-100清洗细胞四次。对于表1中列出的大多数标记，孵育清洗缓冲液10-30秒。
8. 用（Milli-Q ）-H 2 O中足够的1μg/ ml DAPI溶液覆盖细胞。孵育1分钟，然后用Olympus IX81倒置荧光显微镜对细胞进行成像。

第二部分：气 - 液界面上气道基底干细胞的粘液分化

准备'完整的ALI培养基'（见配方2）
人气道基底细胞在气 - 液界面上的粘液分化（图2）
1. 细胞接种（最多1天）
  1. 在播种前一天，用804G条件培养基预先涂布transwell膜（对于24孔transwell，我们加入150μl涂布培养基/孔;对于12孔transwell，我们加入400μl涂布培养基/孔）。将培养皿中的细胞分开，并在'Complete Airway Basal Cell Culturing Medium'中以〜5×10 3 / mm 2的密度接种细胞（参见第I部分）。
  2. 向上室和下室添加足够的“完全气道基底细胞培养基”（例如，对于12孔transwell板，将300-500μl培养基添加到上室和500-1,000μl培养基至下室）。在这种接种密度下，细胞在附着后立即达到100％汇合。一般不推荐transwell膜上的细胞扩增，因为它会导致分化的异质性并导致分化效率降低。如果细胞数量不够，只需简单地扩大细胞直至达到100％融合（我们建议不超过2天的细胞扩增）。
2. 预先ALI治疗（最多1天）
  从上室和下室取出'完整的气道基底细胞培养基'，替换为'完整的ALI培养基'，在37°C孵育细胞过夜或至少2小时。
3. ALI的分泌纤维分化（> 15天）
  从上腔取下'完整的ALI培养基'以启动气液界面。仅将相同的ALI培养基添加到底部室。每2天更换培养基，直到分化完全确定。
4. 可通过反相显微镜监测纤毛生成（视频1）。取决于细胞传代，11-14天后可观察到纤毛细胞的出现。我们通常将ALI培养16-20天作为标准方案。对于晚期传代的细胞，可能需要较长时间的ALI分化。为了促进细胞分层（基底细胞需要从单细胞层分层到更多层来分化）和粘膜纤毛分化效率，尤其是老年气道基底细胞，我们建议将1μMA8301 + 5μMROCKi添加到'完整ALI培养基'用于分化的第一周。
  
  视频1
整体免疫荧光鉴定气道上皮分化。（图3A）
1. 吸入下腔室的ALI介质。
2. 通过向上腔室和下腔室添加4％的PFA，将细胞固定在transwell膜上。将板放置在4°C 10分钟。
3. 吸出PFA，用PBS清洗膜3次。此时，Transwell膜可以在4°C下保存在PBS中达1周，直到进行免疫荧光染色。
4. 用尖锐的手术刀从transwell切下膜。
5. 将膜切成4块（如果使用12mm 2膜）或将膜切成2块（如果使用6.5mm 2 /膜）。
6. 将每个膜片置于2ml Eppendorf管中并添加PBS + 0.2％Triton以透化细胞。孵育5分钟。
7. 吸取PBS + 0.1％Triton溶液。用150μl稀释于PBS + 1％BSA中的初级抗体覆盖膜片并在室温下孵育2小时或在4℃下孵育过夜。
8. 用PBS + 0.2％Triton X-100清洗膜片四次
9. 在PBS + 1％BSA中稀释150μl荧光标记的二抗，并在室温下孵育1 h（避光），以覆盖膜片。
10. 用PBS + 0.2％Triton X-100清洗细胞四次。
11. 用（Milli-Q ）-H 2 O中的150μl1μg/ ml DAPI溶液覆盖膜片。孵育1分钟。
12. 在显微镜载玻片上添加一滴Fluoromount-G。取出膜片并将其（细胞侧面朝上）放入Fluromount-G液滴中。轻轻地添加盖玻片，避免任何气泡形成。
13. 使用Olympus Fluoview FV10i共聚焦显微镜或尼康A1共聚焦激光显微镜观察免疫荧光。
横切膜切片上分化的气道上皮的免疫荧光表征（图3B）
1. 如上所述固定并切除transwell膜。
2. 将切下的膜转移到任何容器中以处理用于冷冻切片的膜。我们通常为此使用12孔板。
  在PBS中用含30％蔗糖的切下的膜过夜孵育。
3. 将膜转移至30％蔗糖：OCT（1：1）并在室温下孵育1-2小时。
4. 将膜转移至100％OCT并在室温下孵育15分钟。
5. 将膜切成2-4块，然后在干冰上的冷金属平台上，将膜置于100％OCT的垂直位置。
6. 使用标准冷冻切片方案切割4-7μm冷冻切片。
  在-20°C保存长达1年，或在-80°C保存更长时间
7. 为了对横切片上的气道上皮细胞进行染色，用自来水短暂冲洗载玻片以除去OCT。用ImmEdge疏水屏障PAP笔圈住组织。
8. 使用上述类似的方案，用一级和二级抗体依次染色载玻片。
9. 使用Olympus Fluoview FV10i共聚焦显微镜或尼康A1共聚焦激光显微镜观察免疫荧光。
  
  图3.在气道 - 液体界面上培养的人气道基底细胞的免疫荧光表征A.使用分化标记物（纤毛细胞的乙酰化微管蛋白，球杆细胞的CC10和杯状细胞的MUC5AC）的免疫荧光使用wholemount染色。比例尺= 50微米。 B.气管上皮细胞标记物（纤毛细胞的乙酰化微管蛋白和FOXJ1，球杆细胞的CC10和杯状细胞的MUC5AC和基底干细胞的p63）的免疫荧光在横向ALI膜部分上。比例尺= 20μm。

笔记

可将ALI培养物分离成单细胞群进行进一步的细胞分析。为了解离细胞，从下室吸出ALI培养基，用PBS轻轻冲洗细胞，然后向上部和下部室添加足够的解离培养基（0.25％胰蛋白酶+0.5mg / ml DNA酶I）以使细胞从膜。例如，对于12孔板，向上室添加0.5ml解离培养基，并向底室添加1ml解离培养基。 DNase I的目标是消化从死细胞释放的DNA片段以降低细胞悬液的粘度。 3-5分钟后，在显微镜下监测细胞解离。当细胞松动时，加入DMEM（或RPMI）+ 10％FBS停止胰蛋白酶消化。将细胞悬液转移到离心管中并轻轻吸移几次以产生单细胞悬液。将细胞悬浮液在400×g下离心5分钟，并将细胞沉淀重新悬浮在所需的溶液中用于分析。例如，细胞在细胞纺丝后可以在4％PFA中固定5分钟用于单细胞免疫荧光测定。或者，可将细胞悬浮于PBS + 1％FBS中用于基于流式细胞术的定量测定。流式细胞术的成功取决于适合分选的表面抗体的可用性。作者建议读者独立地优化他们的分类协议以分离他们感兴趣的特定细胞。

数据分析

图像文件和数据分析：
使用Olympus Fluoview FV10i共焦显微镜或Olympus IX81倒置荧光显微镜观察载玻片上的染色。用Olympus IX81倒置荧光显微镜观察培养皿上的细胞染色和ALI transwell膜上的整体着色染色。使用MicroSuite FIVE（奥林巴斯软成像解决方案）和扩展焦点成像（EFI）模块组合多个焦平面捕捉图像，以创建单个焦点图像，捕捉更厚的ALI培养物的细胞复杂性。
可以使用ImageJ软件处理从荧光显微镜获取的图像。量化将通过用20x或60x目标计算至少5个随机视野并计算平均值和标准偏差来进行。

食谱

完整的气道基底细胞培养基
气道基底细胞培养基，500毫升*
1.0μMA-83-01（50μl的10mM储备液）-TGFβ拮抗剂**
0.2μMDMH-1（5μl10mM储备液） - BMP4拮抗剂**
0.5μMCHIR99021（25μl10mM储备液）-WNT激动剂**
5μMY27632（250μl10mM储备液） - ROCK抑制剂**
1：100青霉素 - 链霉素（Pen / Strep） - 可选
备注：
1. 可以预先在500ml中制备培养基，而不是为每种培养基新鲜添加化合物。为了保持完整培养基中化合物，生长因子和其他成分的活性，我们建议将所需量的培养基移入50 ml离心管中，而不是为每种培养基使用整个瓶子。完整培养基的瓶子应储存在4°C。预先制备的完全培养基在4°C下保存至少可保存1个月。
2. 为方便起见，我们常规使用商业性气道基底细胞培养基，如来自Lonza或Promocell的培养基。但是，您可以使用实验室培养基，如hTEC培养基（Fulcher等，2005; You and Brody，2013）或其他市售培养基，如LHC-9（Thermo Fisher）。
3. **完全培养基含有化学化合物（TGFβ拮抗剂A-83-01，BMP4拮抗剂DMH-1，WNT激动剂CHIR99021和ROCK抑制剂Y-27632）的组合。可以使用其他TGFβ拮抗剂，BMP4拮抗剂，WNT激动剂和ROCK抑制剂来代替A8301，DMH-1，CHIR99021和Y-27632。如果使用其他化合物，化合物的剂量需要分别优化。为了确定化合物的最佳剂量，可以滴定化合物并测量不同浓度下的细胞增殖速率（参见Mou等，2016，图S2A）。最佳剂量或剂量范围是可以促进细胞增殖，同时引起最小细胞毒性的剂量或剂量范围。此外，所得到的细胞应该与干细胞所期望的一样均匀，小而紧密地包装。
完整的ALI中等
500毫升PneumaCult TM -ALI培养基（干细胞）
1毫升肝素钠盐
0.5毫升氢化可的松（见下文）
氢化可的松溶液
200微升氢化可的松原液（溶解10毫升中的120毫克氢化可的松（Milli-Q -H2O）
150μl5N NaCl
10μl100％乙醇
4620μl（Milli-Q ） - H 2 O 共5毫升
通过0.22μm过滤器进行过滤以消毒
分装并储存在-20°C

加500毫升ALI培养基，每等份0.5毫升 ALI的最终氢化可的松为：0.48μg/ ml

致谢

该协议是根据以前发表的作品改编的（Mou等人，2016年）。作者感谢整个Rajagopal实验室在最初的培养方法开发中提供的建设性帮助。作者希望感谢囊性纤维化基金会（Cystic Fibrosis Foundation）提供研究经费（MOU16G0）和（HURLEY16G0），支持本手稿的工作。我们还要感谢赫尔利实验室和莫实验室的成员们阅读案文，提出建设性的批评和意见，并提供宝贵的讨论和支持。所有作者声明他们没有利益冲突或利益冲突。

参考

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Mou，H.，Vinarsky，V.，Tata，PR，Brazauskas，K.，Choi，SH，Crooke，AK，Zhang，B.，Solomon，GM，Turner，B.，Bihler，H.，Harrington，J. ，Lapey，A.，Channick，C.，Keyes，C.，Freund，A.，Artandi，S.，Mense，M.，Rowe，S.，Engelhardt，JF，Hsu，YC和Rajagopal，）。双重SMAD信号传导抑制使各种上皮细胞基底细胞长期扩增。细胞干细胞 19（2）：217-231。
Rheinwald，J.G。和Green，H。（1975）。连续培养人类表皮角质形成细胞株：由单细胞形成角化集落。 Cell 6（3）：331-343。
Yonker，L.，Cigana，C.，Hurley，B。和Bragonzi，A。（2015）。囊性纤维化呼吸环境中的宿主 - 病原体相互作用 Cyst Fibros 14：431-439。
Yonker，LM，Mou，H.，Chu，KK，Pazos，MA，Leung，H.，Cui，D.，Ryu，J.，Hibbler，RM，Eaton，AD，Ford，TN，Falck，JR，Kinane， TB，Tearney，GJ，Rajagopal，J.和Hurley，BP（2017a）。发展一种主要的人类共培养气道黏膜炎模型。 Sci Rep 7（1）：8182。
Yonker，L.M.，Pazos，M.A.，Lanter，B.B.，Mou，H.，Chu，K.K.，Eaton，A.D.，Bonventre，J.V.，Tearney，G.J.，Rajagopal，J.and Hurley，B.P.（2017b）。嗜中性粒细胞衍生的胞质PLA2α促成细菌诱导的嗜中性粒细胞跨上皮迁移。 J Immunol 199（8）：2873-2884。
你，Y.和Brody，S.L。（2013）。小鼠气管上皮细胞的培养和分化方法Mol Biol 945：123-143。