材料和试剂

物料
1. 土壤混合物或基质如Compo Sana Universal Ligera（COMPO，TSUSTPROF25L）
2. 植物盆如Desch vol 11（Desch Plantpak，目录号：1055278）
3. 种子托盘40腔
4. 植物托盘
5. 保鲜膜
6. 注射器1毫升或2毫升
7. 纸巾
8. 培养皿
9. 猎鹰管
10. Eppendorf管
11. 移液器吸头
12. 无菌牙签
13. 注射器过滤器0.22μm
生物材料
1. 拟南芥NahG种子（Lawton等，1995）
2. 携带具有感兴趣基因的双元载体的根癌土壤杆菌菌株（LBA4404，GV3101或C58C1）
试剂
1. 无菌去离子水
2. 甘油（CARLO ERBA试剂，目录号：453752）
3. NaCl（AppliChem，目录号：121659.1210）
4. 胰蛋白胨（Biolife，目录号：412290）
5. 酵母提取物（AppliChem，目录号：403687.1210）
6. 细菌琼脂（MICROKIT，目录号：BCB006 +）
7. MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）
8. MgCl 2（AppliChem，目录号：131396.1210）
9. DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：M81802）
10. 乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
11. 利福平（Duchefa Biochemie，目录号：R0146.0005）
12. 四环素（Sigma-Aldrich，目录号：T3383）
13. 庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G3632）
14. 壮观霉素（Duchefa Biochemie，目录号：S0188.0005）
15. 卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K4378）
16. LB培养基（见食谱）
17. 1 M MES（见食谱）
18. 1 M MgCl 2（见食谱）
19. 0.1 M乙酰丁香酮（见食谱）
20. 渗透解决方案（请参阅食谱）
21. 抗生素溶液（取决于构建体和农杆菌菌株，参见食谱）

设备

无菌锥形瓶
在短日照条件下（8小时光照/ 16小时黑暗）能够维持21℃的植物生长室，具有140-150μmolm-2秒-1光强度（Radiber SA，产品目录号：AGP-1400）
能够进行OD 600测量的分光光度计，诸如Shimadzu UV-1601（Shimadzu，目录号：206-67001-34）
自动P1000，P200和P20微量移液器
培养箱设置在28°C，例如孵化器D-6450哈瑙（Heraeus Instruments，型号：D-6450）
能够保持28℃和180rpm的培养箱振荡器，如New Brunswick TM I26（Eppendorf，New Brunswick scientific，型号：I26，目录号：M1324-0000）
离心50毫升管，如Rotofix 32A（Hettich，目录号：1206-01）
高压灭菌器

程序

植物生长条件
注：拟南芥NahG植物是获得令人满意的瞬时基因表达/蛋白表达的关键步骤。在该方案中，使用约4周龄的拟南芥NahG植物用于农杆菌渗入。
1. 将种子放在浸有水的土壤中，在植物盆中混合。用保鲜膜覆盖锅并将其置于21°C下8小时光照/ 16小时黑暗周期的生长室中。
2. 直到幼苗有两片真叶（约7-10天）。
3. 小心地将苗移植到40个穴位的种子托盘中的最终目的地。
4. 在生长室内种植植物约3周，在21°C下8小时光照/ 16小时黑暗周期。
5. 当植物具有10-12叶的坚固花环并且没有开始开花时，植物准备好渗透。
农杆菌文化
注意：该方案可以与至少三种不同的农杆菌常用菌株：LBA4404，GV3101和C58C1一起使用。
1. 使用甘油原液和无菌牙签，将农杆菌克隆条纹用于补充有适当抗生素的LB固体培养板中。将培养板置于28°C培养箱中培养48小时，以获得新鲜和单菌落。
2. 在开始渗透前一天，使用平板上的新菌落在LB液体培养基中开始液体农杆菌培养物。使用无菌牙签从单菌落中挑选土壤杆菌生物质，将其置于无菌锥形瓶中，所述无菌锥形瓶具有补充有适当抗生素的20ml LB液体培养基，并在28℃和180rpm下培养过夜。
渗透
1. 农杆菌制备
  1. 将饱和的培养物倒入50ml Falcon管中。
    4,000 em x g 旋转细胞10分钟。
  2. 通过滗析弃去LB培养基上清液。消除尽可能多的上清液。
  3. 使用1体积的新鲜制备的渗透缓冲液，用涡旋重悬细胞沉淀。
  4. 重新悬浮后，在室温下将培养物在黑暗中放置2-4小时。
  5. 准备饱和培养物的1/20稀释液，测量OD 600并计算必需体积以具有0.05的最终OD 600。用渗透缓冲液稀释。
2. 渗透程序
  1. 用重悬浮培养物填充1或2毫升无针注射器，最终OD600值为0.05。通过在叶的远轴侧按压注射器（无针）进行渗透，同时用指尖在近轴侧施加反压。如果渗透成功，观察液体在叶片内的扩散情况。
    渗透整个叶子（ ca。 100μl细菌悬浮液/离开）。
  2. 使用薄纸干燥叶面上多余的培养物（图1，视频1）。
  3. 浸润后两到四天，观察浸润蛋白的荧光或收获浸润的叶子以进行蛋白质提取。
    
    图1.瞬时表达的实验步骤 NahG 拟南芥使用根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的植物A.携带所需构建体的含有农杆菌的Eppendorf管1ml注射器，4周龄的NahG拟南芥属植物和一张纸。 B.植物渗透（详见程序部分）。
    
    视频1

笔记

一些叶子在渗入细菌悬液后可能会发生坏死
在长日照条件下（16小时光照/ 8小时黑暗周期）生长NahG拟南芥，如果植物没有开始开花，可能不会影响瞬时表达。然而，当植物在短日照条件下生长时，植物叶子更大，更容易渗入。
也可以先调整OD 600，然后在黑暗中培养2-4小时。
每株植物渗入不超过4-5片叶子。当更多的叶子渗入时，植物的存活率显着减少。
使用这个协议，蛋白质积累的水平在渗透后3天是最佳的。
实际上玫瑰花结的任何一片叶子都可以渗透出积极的结果，但最年长的叶子往往表现出较低的信号，而最年轻的叶子往往对细菌接种表现出较强的反应，伴随着坏死。
干燥过量的培养物对于渗透的成功并不是决定因素，但由于叶子在潮湿时粘在一起会引起较高程度的坏死，因此非常值得推荐。

食谱

LB培养基（1 L）
NaCl 5克
胰蛋白胨10克
酵母提取物5克
（仅用于固体培养基）细菌琼脂16克
1 M MES（100毫升）
17.5克MES
完成无菌去离子水
调整pH值至5.6
通过过滤消毒
在室温下储存
1 M MgCl 2（100毫升）
20.3克MgCl 2 2/2 完成无菌去离子水
通过高压灭菌来消毒
在室温下储存
0.1M乙酰丁香酮（10毫升）
0.196克乙酰丁香酮
10毫升DMSO
准备1毫升等分试样，并将它们储存在-20°C。
渗透液（100毫升）

加满无菌去离子水
注意：在使用前准备渗透液。
抗生素解决方案

致谢

作者感谢Huang Tan在成像过程中的技术帮助。这项工作得到了西班牙科学技术大学（AGL2016-75819-C2）和中国科学院上海植物逆境生物学中心的支持。该协议源自以前的出版物（Rosas-Díaz等人，2017）。作者声明他们没有利益冲突。

参考

Krenek，P.，Samajova，O.，Luptovciak，I.，Doskocilova，A.，Komis，G。和Samaj，J。（2015年）。农杆菌介导的瞬时植物转化：原理，方法和应用。 Biotechnol Adv 33（6 Pt 2）：1024-1042。
Lawton，K.，Weymann，K.，Friedrich，L.，Vernooij，B.，Uknes，S.and Ryals，J。（1995）。拟南芥中的系统获得性抗性需要水杨酸，而不是乙烯。 Mol Plant Microbe Interact 8（6）：863-870。
Rosas-Díaz，T.，Cana-Quijada，P.，Amorim-Silva，V.，Botella，M.A.，Lozano-Duran，R.和Bejarano，E.R。（2017）。拟南芥NahG 植物作为一种合适且高效的瞬时表达系统， Agrobacterium tumefaciens 。 Mol Plant 10（2）：353-356。