材料和试剂

移液枪头（VWR）
6孔板（Corning，Costar ®，产品目录号：3506）
1.5 ml Eppendorf管
96孔板（康宁，目录号：3595）
细胞培养瓶（康宁，目录号：430639）
96孔OptiPlate（PerkinElmer，目录号：6005290）
凝胶加样移液枪头
Invitrol TM TM PVDF /滤纸三明治（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：LC2005）
来自HTL细胞的CRISPR / Cas9缺失了PS1 / PS2缺陷的HTL细胞（PS1 / PS2基因）[Xu等，2016] ）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：11965092）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：26140079）
胰蛋白酶0.25％-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31985062）
Lipofectamine 2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11668019）
链霉亲和素MagBeads（金斯瑞，目录号：L00424）
CelLytic TM M（Sigma-Aldrich，目录号：C2978）
蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11836153001）
2x SDS上样缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610737）
β-巯基乙醇（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610710）
Bolt TM 4-12％Bis-Tris Plus凝胶，15孔（Thermo Fisher Scientific，目录号：NW04125BOX）
Novex TM Tris-甘氨酸转移缓冲液（25x）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：LC3675）
精密加蛋白质预染标准（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610374）
甲醇（EMD Millipore，目录号：MX0485-5）
Seppro®剥离缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：S4324）
生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4501）
氢氧化钠（NaOH）溶液（Fisher Scientific，目录号：SS255）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：S374-1）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（EMD Millipore，目录号：PX1565-1）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：SX0420-5）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：BP366-500）
Tris碱（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP381-5）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
盐酸（HCl）（EMD Millipore，目录号：HX0603-75）
吐温20（EMD Millipore，目录号：9480-OP）
奶粉（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706404）
抗FLAG-过氧化物酶抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A8592）
抗β肌动蛋白抗体（Abcam，目录号：ab6276）
抗小鼠IgG，HRP连接的抗体（Cell Signaling Technology，目录号：7076S）
SuperSignal West Pico底物（Thermo Fisher Scientific，目录号：34080）
注：此产品已停产。
高纯水（ddH2O）（由PURELAB Ultra系统生产）
生物素溶液（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS缓冲液）10倍（见食谱）
电泳缓冲液（见食谱）
Tris缓冲盐水（TBS缓冲液）10倍（见食谱）
TBST缓冲液（见食谱）
阻止解决方案（见食谱）
抗FLAG抗体溶液（见食谱）
抗β肌动蛋白初级抗体溶液（见食谱）
抗小鼠IgG二抗溶液（见食谱）
底物溶液（见食谱）

设备

移液器
37℃，5％CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma TM Series 3110水套）
细胞培养显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse TS100）
生物安全柜（贝克，型号：SterilGARD e3）
标准台式离心机（Eppendorf，型号：5417 R）
英杰公司SDS-PAGE电泳盒（赛默飞世尔科技，产品目录号：A25977）
Tank-blot装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini Trans-Blot Module，目录号：1658029FC）
ChemiDoc TM XRS +成像仪系统（Bio-Rad Laboratories，型号：ChemiDoc TM TM XRS +）
振荡器（Fisher Scientific，型号：化学混合器346）
摇摆平台（ARMA LAB，型号：轨道摇床100）
磁分离架（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）

软件

Image Lab 5.2.1软件（ http：//www.bio- rad.com/en-ch/product/image-lab-software ）

程序

细胞培养
1. 在添加有10％（v / v）胎牛血清的DMEM中，在37℃，潮湿的5％CO 2下，常规地使PS1 / PS2-去除的HTL细胞生长，大气。
2. 用0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃处理细胞约2分钟。用DMEM培养基（补充有10％[v / v]胎牛血清）将细胞稀释至0.4×10 6 / ml，并以0.8×10 6 /孔在转染前一天进入6孔板。
转染
1. 准备一个样本的主混合：
  向无菌1.5 ml Eppendorf管中加入：
  50μlOpti-MEM培养基
  2.6μlLipofectamine 2000转染试剂。
  注意：
  1. 避免在添加试剂时触摸试管的一侧。
  2. 制备更大样品量的主混合物：例如，对于10个样品，乘以11以制备一些额外的混合物（50×11 =550μl培养基; 2.6×11 =28.6μlLipofectamine 2000转染试剂） em>
2. 在96孔板中，每孔加入1.3μl总DNA到50μlOpti-MEM培养基中。
  注意：1.3μg总DNA含有300ng BirA生物素连接酶编码DNA，500ng Avi-C99编码DNA和500ng C99-TEV位点-rTA-Flag编码DNA。
3. 在96孔板的每个孔中加入50μl主混合物到DNA混合物中，轻轻混匀
4. 在室温下孵育约30分钟
5. 转移100μl混合物到6孔板中培养的细胞的每个孔中注意：用移液器小心地加入100μl的混合物。
6. 转染后，使用标准的0.1-2.5μl移液器加入生物素溶液（参见配方）至终浓度为40μM。
  注意：我们通常在6孔板中培养2ml细胞，所以只需要加入2μl生物素溶液。确保你添加了少量的生物素。
7. 将培养细胞在补充有10％（v / v）胎牛血清的DMEM中在37℃，5％CO 2的潮湿空气中培养。
预先清理MagBeads
1. 完全重新悬浮珠子
2. 在一个新的1.5毫升试管中加入20μlMagBeads（带有储存缓冲液的珠子）的25％浆液到每个样品中。
  注意：为一个试管中的所有样品准备一个总体积的MagBeads。
3. 将试管放在磁力分离架上收集珠子。
  移除并丢弃上清液注意：使用凝胶加样移液枪头，以避免意外移液珠。
4. 向管中加入0.1ml /样品PBS缓冲液（参见食谱）并倒转管几次以混合。使用磁性分离架收集珠子，并从最底部用加样尖吸取上清液。重复这个步骤两次
细胞裂解和蛋白质纯化
1. 转染一天后，使用加样枪头通过真空泵从培养细胞中除去培养基，并用足够体积的PBS（即，500μl/孔）轻轻冲洗。
2. 在每个孔中分配150μlCelLytic TM裂解缓冲液，补充有1x蛋白酶抑制剂混合物。
3. 在冰上溶解细胞约30分钟
4. 用移液管将裂解物转移到1.5ml Eppendorf管中，并在4℃下在微型离心机中全速旋转（约20,000xg）10分钟以除去不溶物质。
5. 取10μl上清液，加入10μlSDS上样缓冲液，并加入100 mMβ-巯基乙醇作为输入。
6. 将粗上清蛋白提取物与预洗过的链霉抗生物素蛋白MagBeads一起在摇床上在4℃温育约30分钟。
7. 使用磁力分离架收集珠子并丢弃上清液。
  注意：如有必要，保留上清液进行分析。
8. 添加0.5毫升CelLytic TM M裂解缓冲液的管，轻轻涡旋混合。使用磁力分离架收集珠子并丢弃上清液。重复这个步骤两次。
9. 用含有100mMβ-巯基乙醇的20μlSDS上样缓冲液在54℃洗脱样品10分钟。
SDS-PAGE和Western印迹分析
1. 将预制的4-20％SDS PAGE凝胶置于Invitrogen SDS-PAGE盒中。
2. 将10μl预染蛋白质标准物和25μl含珠的样品加入到凝胶的孔中，并在200V的电泳缓冲液（参见配方）中运行凝胶1小时。
3. 用甲醇浸泡PVDF膜，然后转移到转移缓冲液中。
4. 浸泡海绵，并在转印缓冲液中过滤纸张。
5. 按以下顺序准备印迹三明治：阳极（ - ，黑色），海绵，滤纸，SDS凝胶，PVDF膜，滤纸，海绵，阳极（+，白色）。
6. 在恒定的90 V和4°C条件下，在槽式印迹装置中进行蛋白质转移约90分钟
7. 拆开印迹三明治，立即转移膜到1x TBST（见食谱）进行短暂的冲洗。
  注意：检查蛋白质标准以查看转移效率。
8. 在室温下用摇动器将20毫升阻断溶液（参见食谱）孵育1小时
9. 在室温下用10ml TBST洗膜3次，每次10分钟
10. 孵育10毫升/膜抗Flag抗体溶液（见食谱）在室温1小时或过夜在4°C。
11. 在室温下用10ml TBST洗膜3次，每次10分钟
12. 在室温下用足够新鲜制备的底物溶液（每个膜2ml，参见食谱）孵育膜。
13. 在2层透明塑料薄膜之间转移薄膜，并使用1秒至120秒的印迹 - 化学法应用于Bio-Rad成像仪系统，以获得20张照片。
14. 在室温下用剥离缓冲液剥离第一抗体约15分钟
15. 使用抗β肌动蛋白初级抗体溶液（见食谱）重复从阻断步骤开始的Western印迹1小时。
16. 用10ml TBST（室温，每次10分钟）洗涤3次后，与10ml /膜抗小鼠IgG二抗溶液（参见食谱）一起温育约45分钟。
17. 用10ml TBST（室温，每次10分钟）洗3次后，用Bio-Rad Imager系统记录图像。
  注意：Image Lab 5.2.1 Western blot软件设置：选择Blots Chemi应用程序;第一个图像的信号积累开始1秒，最后一个图像结束120秒，图像总数为20;选择位置凝胶，使用“+”或“ - ”按钮调整图像区域;运行协议来获取图像。选择最适合数据分析的

数据分析

抗FLAG蛋白质印迹分析显示输入裂解物中和链霉抗生物素蛋白珠下拉物质中存在C99-TEV位点-FLAG（图2），表明C99均低聚。链霉亲和素珠子下拉测定的一个实际例子以前在Yan等人的<2017>中显示。

图2.下拉测定C99寡聚化验证。在链霉亲和素MagBeads（GenScript）上回收生物素化的Avi-标记的C99蛋白和相关的C99（WT）-TEV位点-rTA-Flag，并用SDS样品缓冲液洗脱，而二聚体界面突变体（T43P / V45P：ctrl1和I45P / V46P：ctrl2）（Yan等人，2017）不是。通过抗FLAG免疫印迹检测共纯化的C99-TEV位点-rTA-Flag蛋白质。 β-肌动蛋白输入水平作为加载对照。

食谱

生物素溶液
将0.486克生物素粉末加入到50毫升ddH2O中，并逐滴缓慢加入10N氢氧化钠溶液，直至生物素溶解，制成40毫克生物素溶液。
磷酸盐缓冲盐水（PBS缓冲液）10倍（1升）
11.5克Na 2 HPO 4 4 2克KH 2 PO 4 4克/克 80克NaCl
2克KCl
溶于1升ddH 2 O
1x PBS的pH应该是7.4
电泳缓冲液（1 L）
3.03克Tris
14.4克甘氨酸
1克SDS
将ddH <2> O添加到1L
Tris缓冲盐水（TBS缓冲液）10×（1 L）

24.228克Tris-碱 87.66克NaCl
溶于1L无菌去离子水中，用HCl调pH至7.4
TBST缓冲区

加入1 ml吐温20至1 L TBS缓冲液
阻止解决方案
1x TBST补充有5％（w / v）奶粉
抗FLAG抗体溶液
15毫升TBST与3微升主要抗FLAG-过氧化物酶抗体
抗β肌动蛋白一抗溶液
15毫升的TBST与7.5微升的初级抗β肌动蛋白抗体
抗鼠IgG二抗溶液
15 ml TBST与15μl抗鼠IgG，HRP连接的抗体
底物溶液
1卷SuperSignal West Pico A和1卷SuperSignal West Pico B混合使用

致谢

国家自然科学基金面上项目（31300607,31300245和91217311），科技部2012ZX09301001,2012CB910403,2013CB910600，XDB08020303,2013ZX09507001，上海市科委（13ZR1447600），国家自然科学基金），上海新星计划（14QA1404300），国家卫生研究院赠款DK071662（HEX），GM102545和GM104212（KM）。作者宣称没有利益冲突。

参考

Xu，T.H.，Yan，Y.，Kang，Y.，Jiang，Y.，Melcher，K。和Xu，H.E。（2016）。阿尔茨海默氏病相关突变增加淀粉样蛋白前体蛋白对γ-分泌酶切割的抗性，而Aβ42/Aβ40比率。 Cell Discov 2：16026.
Yan，Y.，Xu，T.H.，Harikumar，K.G.，Miller，L.J.，Melcher，K.and Xu，H.E。（2017）。淀粉样蛋白前体蛋白的跨膜结构域的二聚化由γ-分泌酶切割位点周围的残基决定。 J Biol Chem 。