材料和试剂

移液枪头（VWR）
24孔板（Corning，Costar ®，目录号：3524）
96孔板（康宁，目录号：3595）
细胞培养瓶（康宁，目录号：430639）
96孔OptiPlate（PerkinElmer，目录号：6005290）
凝胶加样枪头
来自HTL细胞的CRISPR / Cas9缺失了PS1 / PS2缺陷的HTL细胞（PS1 / PS2基因）[Xu等，2016] ）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：11965092）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：26140079）
胰蛋白酶0.25％-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31985062）
双荧光素酶报告基因检测试剂盒（普洛麦格，目录号：E1960）
X-tremeGENE 9试剂（Roche Diagnostics，目录号：06365787001）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：S374-1）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（EMD Millipore，目录号：PX1565-1）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：SX0420-5）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：BP366-500）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS缓冲液）（见食谱）
1x被动裂解缓冲液（PLB）（见食谱）
LAR2底物（见食谱）
停止＆amp; Glo ®试剂（见食谱）

设备

微量移液器（Eppendorf）
真空泵
37℃，5％CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma TM Series 3110水套）
细胞培养显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse TS100）
摇床（ARMA LAB，型号：轨道摇床100）
生物安全柜（贝克，型号：SterilGARD e3）
EnVision Multilabel Plate阅读器（PerkinElmer，型号：EnVision Multilabel）

软件

GraphPad Prism 5（ https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）

程序

细胞培养
1. 在37℃，潮湿的5％CO 2气氛下，通常使用PS1 / PS2去除的HTL细胞在补充有10％（v / v）FBS的DMEM中生长。
2. 用0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃处理细胞约2分钟。用DMEM培养基（补充有10％[v / v]胎牛血清）将细胞稀释至0.4×10 6 / ml，并在每孔50,000个孔中分裂到24孔板中，转。
转染
1. 准备一个样本的主混合：
  向无菌1.5 ml Eppendorf管中加入：
  10μlOpti-MEM培养基
  0.195μlX-tremeGENE 9转染试剂。
  注意：
  1. 避免在添加试剂时触摸试管的一侧。
  2. 为更大的样本数量做一个主混合：例如，对于10个样本，乘以11来准备一些额外的混合。（10×11 =110μl培养基; 0.195×11 =2.145μlX-tremeGENE 9转染试剂）。
2. 每孔加入10μlOpti-MEM培养基到96孔板中，然后每孔加入65 ng总DNA。
  注：我们通常将DNA质粒稀释至100 ng /μl的浓度，并将其保存在4°C。
3. 在96孔板的每个孔中加入10μl主混合物到DNA混合物中，并通过移液轻轻混合。
4. 在室温下孵育约30分钟
5. 小心转移20μL混合物移液到24孔板培养细胞的每个井中。
  注意：在该测定中，10ng C99（或其变体）-TEV位点-rTA表达构建体，10ng C99（或其变体）-TEV蛋白酶构建体和5ng phRG-tk Renilla归一化萤光素酶表达载体分别是与40ng pBSK质粒对照一起转染到PS1 / PS2缺失的HTL细胞中。
6. 将培养细胞在补充有10％（v / v）胎牛血清的DMEM中在37℃，5％CO 2的潮湿空气中培养。
萤光素酶测量
1. 转染后一天，通过真空泵将培养细胞中的培养基从管道上连接到液体收集器和凝胶装载移液器尖端，并轻轻地施加足够的体积（500μl/孔）的PBS（见食谱）冲洗每口井的底部。
2. 将100μl的1x PLB（参见食谱）分配到每个孔中，并轻轻地将培养板在室温下摇动15分钟（，例如<70rpm）。
  注意：我们使用Eppendorf研究 Pro电子单通道移液器（20-1,000μl）分配PLB缓冲液。但是，任何可以设置为100μl的实验室移液器都可以使用。
3. 将20μlPLB裂解液转移至96孔OptiPlate的每个孔中，不含细胞碎片。
  注意：一般来说，在进行测定之前不需要清除残余细胞碎片的裂解物。
4. 对EnVision Multilabel Plate Reader进行编程，以执行2秒的预先测量延迟，然后使用Envision 96 Plate US发光（700 nm发射滤波器）孔径进行10秒的测量，以进行每个报告分析。
5. 向96孔OptiPlate的每个孔中分配50μlLAR2底物（参见配方），通过移液2次或3次混合并使用EnVision Multilabel Plate Reader测量萤火虫萤光素酶活性。发光读取代表萤火虫萤光素酶活性。
6. 分配50μl停止＆amp; Glo试剂（参见配方）放入同一平板，通过移液2次或3次混合并通过EnVision Multilabel Plate Reader测量海肾荧光素酶活性。发光读取代表海肾荧光素酶活性。

数据分析

每个数据点表示至少三次独立实验的平均值（表1），计算出的活动如表2所示。数据以分组条形图类型呈现。数据的统计分析可以用GraphPad Prism使用双尾Student's测试与对照（图2）完成。
这个Tango相互作用测定的适用性的一个实际例子最近被显示在（Yan等人，2017年）。

表1.原始的萤火虫和海肾活动读

表2.相对活动和正常化活动

注意：对于活动标准化，每个相对活动除以WT（C99-T4L-rTA）的相对活动的平均值和100倍。

图2.通过Tango测定验证C99二聚化

笔记

细胞的状态是非常重要的。进行数据分析时，注意海肾荧光素酶信号（表3）。它应该是大约100万张照片。

表3.不良细胞状态的例子

这些孔（ctrl1组3孔和ctrl2组3孔应为阴性对照，低Renilla活性，这在一定程度上反映了细胞状态和转染效率，使得相对活性远高于正常水平。

食谱

10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS缓冲液）（1升）
11.5克Na 2 HPO 4 4 2克KH 2 PO 4 4克/克 80克NaCl
2克KCl
溶于1升无菌去离子水中 1x PBS的pH应该是7.4
1x被动裂解缓冲液（PLB）
从双荧光素酶报告基因检测试剂盒中加入1倍体积的5x PLB到4倍体积的蒸馏水中并充分混合

1x PLB可以储存在4°C以下，不超过一个月
LAR2底物（来自双荧光素酶报告基因检测试剂盒）
在萤光素酶测定缓冲液2（每瓶10ml）中重悬冻干的荧光素酶测定底物，-20°C保存少于1个月或-70°C少于1年。
停止＆amp; Glo试剂（来自双荧光素酶报告基因检测试剂盒）
新增1个音量停止＆amp; Glo ® Substrate to 49 volume Stop＆amp; Glo ®缓冲液和涡旋10秒

致谢

国家自然科学基金面上项目（31300607,31300245和91217311），科技部2012ZX09301001,2012CB910403,2013CB910600，XDB08020303,2013ZX09507001，上海市科委（13ZR1447600），国家自然科学基金），上海新星计划（14QA1404300），国家卫生研究院赠款DK071662（HEX），GM102545和GM104212（KM）。作者宣称没有利益冲突。

参考

Barnea，G.，Strapps，W.，Herrada，G.，Berman，Y.，Ong，J.，Kloss，B.，Axel，R.and Lee，K.J。（2008）。信号级联的遗传设计来记录受体激活 Proc Natl Acad Sci USA 105（1）：64-69。
Xu，T.H.，Yan，Y.，Kang，Y.，Jiang，Y.，Melcher，K。和Xu，H.E。（2016）。阿尔茨海默氏病相关突变增加淀粉样蛋白前体蛋白对γ-分泌酶切割的抗性，而Aβ42/Aβ40比率。 Cell Discov 2：16026.
Yan，Y.，Xu，T.H.，Harikumar，K.G.，Miller，L.J.，Melcher，K.and Xu，H.E。（2017）。淀粉样蛋白前体蛋白的跨膜结构域的二聚化由γ-分泌酶切割位点周围的残基决定。 J Biol Chem 。