材料和试剂

物料
1. 带通气孔的T75组织培养瓶（SARSTEDT，目录号：83.1813.002）
2. 带通气孔的T25组织培养瓶（SARSTEDT，目录号：83.1810.002）
3. 96孔Nunc，白色，平底组织培养多孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：136101）
4. 96孔，平底，Costar透明组织培养板（康宁，目录号：3595）
5. 96孔ELISA微孔板（Greiner Bio One International，目录号：655101）
6. 24孔板（康宁，目录号：3526）
7. 6孔板（康宁，目录号：3516）
8. 组织培养皿，直径10厘米，带盖的Nunclon（Thermo Fisher Scientific，目录号：150350）
9. Bijou管5毫升无菌（x2,000）（SARSTEDT，目录号：60.9921.532）
10. 冷冻管，2.0毫升白帽（SARSTEDT，目录号：72.380）
11. 5 ml血清移液器（SARSTEDT，目录号：86.1253.001）
12. 10毫升血清移液管（SARSTEDT，目录号：86.1254.001）
13. 25毫升血清移液器（SARSTEDT，目录号：86.1685.001）
14. 120毫升无菌容器刻度（x250）（SARSTEDT，目录号：75.9922.420）
15. 250ml Sterilin TM 容器（Thermo Fisher Scientific，目录号：190A）
16. 30 ml Sterilin TM 通用（Thermo Fisher Scientific，目录号：128AFS）
17. 2毫升吸液吸管独立包装无菌无热原（SARSTEDT，目录号：86.1252.011）
18. 5.0 ml TipOne ®重复分配器提示（无菌）（STARLAB，目录号：S4761-0500）
19. 1.25毫升TipOne重复分配器提示（无菌），工业包装（STARLAB，目录号：S4786-0125）
20. 细胞刮刀（Fisher Scientific，目录号：FB55199）
21. 20毫升一次性无菌注射器（BD，目录号：300296）
22. 10毫升一次性无菌注射器（BD，目录号：302188）
23. 1.5毫升管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
24. 0.5毫升管（5,000）（SARSTEDT，目录号：72.699）
25. 0.2μm注射器过滤器无菌（SARSTEDT，目录号：83.1826.102）
26. 注射器过滤器0.4μm（x50）（GE Healthcare，Whatman，目录号：6896-2504）
27. 血细胞计数器（Fisher Scientific，目录号：MNK-420-010N）
28. 血细胞计数器盖玻片（Fisher Scientific，目录号：MNK-504-030M）
29. X2500 Countess Chamber Slides（2,500）（赛默飞世尔科技，目录号：C10314）
30. 蓝色松散移液器吸头（1,000μl）（SARTEDT，目录号：70.762）
31. 200μl黄色移液器吸头（SARTEDT，目录号：70.760.002）
32. 中性移液器吸头（10μl）（SARTEDT，目录号：70.1130）
细胞
1. 人膀胱癌衍生的EJ细胞和结直肠癌来源的HCT116细胞（从ATCC获得）
  注意：它们在含有5％FBS的DMEM和RPMI 1640的1：1（v / v）混合物中培养，称为“DR / 5％”培养基。
2. 正常人尿路上皮（NHU）细胞
  注意：如上所述（Bugajska等，2002），它们在完整的KSFM中建立和培养。
3. 3T3neo和3T3CD40L成纤维细胞 - 如前所述产生的稳定转染的NIH3T3衍生物（Bugajska et al。，2002）
  注意：它们在补充有10％FBS且含有0.5mg / ml G418的DMEM中培养，在共培养实验中省略了抗生素（Georgopoulos等，2006）。
试剂
1. 纯化水（双蒸馏ddH 2 O）
2. D-PBS，10x，无钙，无镁（Thermo Fisher Scientific，目录号：14200067）
3. Mikrozid AF液体，10 L罐（LAVABIS，目录号：SF000301）
4. G418,100 mg / ml溶液（InvivoGen，由Source BioScience LifeSciences提供，目录号：ant-gn-1）
5. 角质形成细胞无血清培养基（KSFM）和补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：17005075）
6. RPMI-1640培养基，含碳酸氢钠，不含L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：R0883-6X500ML）
7. Dulbecco的改良Eagle's培养基（DMEM）（高葡萄糖）与碳酸氢钠，不含L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：D6546-6X500ML）
8. 汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（西格玛奥德里奇，目录号：H9394-6X500ML）
9. L-谷氨酰胺溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G7513-100ML）
10. 胎牛血清（FBS）（合格的胎牛血清，500 ml）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524-500ML）
11. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-29092）
12. 胰蛋白酶-EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：T4174）
13. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650-100ML）
14. Frosty先生 TM 冷冻容器（赛默飞世尔科技，目录号：5100-0001）
15. 异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A415-4）
16. MycoProbe TM 支原体检测分析（R＆amp; D Systems，目录号：CUL001B）
17. 丝裂霉素C（10mg）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-3514B）
18. CK18（细胞角蛋白18）单克隆抗体克隆CY-90（Sigma-Aldrich，目录号：C8541-.2ML）
19. 山羊抗兔IgG IRDYE800二抗（tebu-bio，目录号：039611-132-122）
20. 山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor ® 680二抗（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：A-21057）
21. TRAF-3抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-949）
22. Phospho-ASK1（Thr845）抗体（Cell Signaling Technology，目录号：3765）
23. 从HB-9110杂交瘤系（购自ATCC）的培养物上清液中纯化的激动性抗CD40单克隆抗体G28-5（以10μg/ ml使用）
24. 亲和纯化的人血清蛋白吸附的山羊抗小鼠IgG（X-连接子）（以5μg/ ml使用）（Sigma-Aldrich，目录号：M8645）
25. 来自 Streptomyces sp的Staurosporine。（Sigma-Aldrich，目录号：S4400-.1MG）
26. 多西紫杉醇（Sigma-Aldrich，目录号：01885-5MG-F）
27. CellTiter 96 ® AQ ueous 一种溶液检测（5,000种检测）（Promega，目录号：G3581）
28. 细胞DNA片段化ELISA试剂盒（最多500次测试）（Roche Diagnostics，目录号：11585045001）
29. Cytotox-Glo TM 细胞毒性试验（5 x 10 ml）（Promega，目录号：G9291）
30. Sensolyte ®均质AFC Caspase-3/7检测试剂盒（Cambridge Bioscience，目录号：ANA71114）
31. CM-H2DCFDA（5-（和-6） - 氯甲基-2'的氯甲基衍生物，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯）（Thermo Fisher Scientific，目录号：C6827）
32. 甘油（Fisher Scientific，目录号：10795711）
33. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：NP0002）
34. Tris-HCl，粉末，1 KG（Melford，目录号：T1513）
35. 氟化钠（Acros Organics，目录号：424325000）
36. 焦磷酸钠四元酸（Sigma-Aldrich，目录号：P8010-500G）
37. 原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6508-10G）
38. 蛋白酶抑制剂（PI）鸡尾酒（默克，目录号：535140-1）
39. PI鸡尾酒（New England Biolabs，目录号：5872S）
40. AQUAGUARD-1水浴和CO 2 培养箱消毒解决方案（生物工业，目录号：01-867-1B）（见食谱）
41. 1x PBS（见食谱）
42. PBS / EDTA解决方案（见食谱）
43. 冷冻介质（见食谱）
44. FACS缓冲液（见食谱）
45. 70％乙醇（见食谱） - 乙醇，绝对（Fisher Scientific，目录号：E / 0650DF / P17）
46. DR介质（见食谱）
47. SSB缓冲区（见食谱）
48. 裂解缓冲液（见食谱）

设备

Gilson Pipettes
P1000（200-1,000μl）
P200（50-200μl）
P20（2-20μl）
P10（1-10μl）
Gilson REPETMAN电子移液器0.1-50毫升（Gilson，目录号：F164503）
水浴（Memmert）
沸水浴（格兰特）
-80°C冰柜
Sparkfree冰箱和冰柜（Labcold）
电泳电源
冷冻离心机（PRISM R）
Universal 320台式离心机（Hettich Zentrifugen）
涡旋混合器
超声波均质机Sonicator
NuAire CellGard ES生物安全柜（TripleRed）
Iso Class 5 Nuaire Autoflow IR直接加热CO 2 培养箱与HEPA过滤系统在37°C和5％CO 2 （TripleRed）
Odyssey TM 红外成像系统（Li-Cor）
番石榴EasyCyte TM 流式细胞仪（Millipore）
Countess II自动细胞计数器（赛默飞世尔科技，目录号：AMQAX1000）
EVOS TM XL核心成像系统（Fisher Scientific）
FLUOstar OPTIMA（BMG Labtech）

软件

MARS软件（BMG Labtech），版本2.0
Guava EasyCyte流式细胞仪软件（Millipore），Guavasoft版本2.6
Image Studio Life，版本4.0
Adobe Photoshop CS，版本8.0

程序

一般细胞培养
1. 细胞维持和传代
  1. 将细胞常规维持在37℃，5％CO 2 湿润气氛中，由高压灭菌的ddH 2 O补充，补充有1％AQUAGUARD-1（参见配方）。所有II级柜体表面以及CO 2 培养箱均使用Mikrozid（每周）或70％乙醇（每日）溶液进行常规消毒。
  2. 通过相差显微镜常规观察培养的细胞。将所有细胞系保持在T75烧瓶中，其中含有12-14ml培养基或T25烧瓶，在4-5ml培养基中。所有细胞系每2-3天或在约80-95％汇合时进行传代培养。上皮细胞以1:10的比例常规传代，效应（3T3Neo和3T3CD40L）细胞以1：6的比例传代。
  3. 对于常规传代，通过用0.1％（w / v）EDTA在磷酸盐缓冲盐水（EDTA / PBS）中的溶液（参见配方）洗涤5分钟然后添加胰蛋白酶-EDTA溶液来收集细胞，直到细胞脱离细胞。培养瓶。当细胞重新悬浮时，通过添加各自的血清补充培养基使胰蛋白酶失活，然后离心以吸出培养基并重悬于新鲜培养基中。
  4. 除非另有说明，否则培养的细胞每两天更换一次。收获3T3细胞并与癌细胞一样传代，豁免EDTA / PBS处理非常短，因为延长的时间可能导致细胞快速分离。
2. 冷冻保存和恢复
  1. 对于长期储存，在生长和适当通过后，细胞'库'和'子库'在液氮中冷冻保存，如下所述。
  2. 对于细胞系的冷冻保存，通过常规传代收集培养物并通过离心沉淀。将细胞沉淀重悬于冷冻培养基（参见配方）中，细胞密度不小于1×10 6个/ ml细胞/ ml。
  3. 将细胞在总共1-1.5ml中等分到聚丙烯冷冻管中，然后转移到含有250ml异丙醇的冰冷的'Mr Frosty冷冻容器'中，以将冷却速率控制在1℃/分钟。然后将细胞置于-80℃冰箱中4-6小时，然后转移至液氮中。
  4. 通过在37℃快速解冻回收细胞，然后加入5-10ml预热的生长培养基。将细胞在210μM离心5分钟，然后根据需要接种到组织培养瓶中（T25烧瓶用于常规维护，T75烧瓶用于制备共培养物）。
    注意：
    1. 我们建议对保持最多10-15代的培养物进行实验。为了避免由于可能的与培养相关的遗传漂变而产生的任何假象，应该在该次数的传代后建立新的细胞培养物。细胞“库”和“子库”的使用允许所有实验都以一致的结果进行。
    2. 对于在补充有FBS的培养基中维持的细胞系，先前使用的血清批次进行测试（'批次测试'）以确保其对于细胞生长是最佳的。使用CellTiter 96 AQ ueous 测试细胞生长/增殖 One Solution Assay。
3. 其他
  使用MycoProbe TM 支原体检测试验（参见试剂）对所有细胞系进行常规检测，以确认没有支原体污染。
效应细胞（3T3Neo和3T3CD40L）与靶细胞（上皮细胞）的共培养（图1）
1. 效应细胞和靶细胞的制备（'第0天'）
  1. 在建立共培养物的前一天，效应细胞（3T3Neo和3T3CD40L）应处于指数生长期，并且不超过85％汇合。
  2. 将TTS烧瓶中的3T3Neo和3T3CD40L效应细胞和种子通过，每瓶密度为21×10 5 细胞，并孵育过夜（O / N）。
  3. 同时确保靶细胞（上皮细胞，例如，HCT116和EJ）被适当传代以确保它们处于指数生长期（'分裂'比率取决于细胞的生长特征）线）。
  4. 第二天， ie ，开始共培养实验的那天（'第1天' - 见下文），为所有培养物补充培养基（即，培养基 - 改变3T3s和靶上皮细胞）。
    注意：确保首先发生这种情况（特别是对于3T3单元格，在执行下一步之前）。
2. 通过丝裂霉素C（MMC）处理（'第1天'）抑制效应3T3细胞的生长
  1. 在效应3T3细胞进行中等变化后大约5-6小时（即，中午），从3T3Neo和3T3CD40L烧瓶中取出培养基，每个T75培养瓶中加入9ml仅DR培养基（不含补充剂）含有5μg/ ml丝裂霉素C（MMC），并在37℃下孵育2小时。图2A显示了在MMC处理之前和之后3T3细胞的代表性培养物。
  2. 吸出培养基并用PBS洗涤细胞3次以除去任何痕量的MMC。向每个烧瓶中加入0.8ml胰蛋白酶-EDTA并孵育1-2分钟直至细胞分离，然后用完全培养基灭活。在210 x g 离心5分钟，吸出上清液并重悬于完全培养基中。
  3. 计数细胞（3T3Neo和3T3CD40L）并计算所需的细胞悬液体积。在96孔板中每孔加入100μl含有1×10 4 细胞（用于细胞毒性测定），在24孔板中每孔加入6×10 4 细胞（用于上清液收集）），在6孔板中每孔3×10 5 细胞，或在10cm直径培养皿中每孔30×10 5 细胞（用于流式细胞仪的培养物）实验和制备全细胞裂解液）。
    注意：不同类型多孔板的细胞数和每孔最小体积是根据培养表面积的差异进行转换的。
  4. 一旦种子效应3T3细胞，在37°C孵育平板O / N（图1A）。
    注意：对于DNA片段化分析，上皮细胞可以用DNA标记试剂O / N预脉冲（见下文）。
3. 将靶标（上皮细胞）接种到3T3效应细胞上（共培养）（'第2天'）
  1. 第二天（早上第一件事），用EDTA / PBS洗涤靶细胞（除去培养基后），然后每瓶加入0.8ml胰蛋白酶-EDTA，将细胞在37℃温育2-3分钟。直到细胞分离。通过添加完全培养基使胰蛋白酶失活。
    注意：如果需要，可以在胰蛋白酶消化和计数之前，根据需要用任何药理学抑制剂（用于功能实验）预处理靶细胞。
  2. 在210×g离心下离心5分钟，然后吸出上清液并重悬于完全培养基中。然后，计算细胞数并计算所需的细胞悬液量。
  3. 从每个孔中取出培养基或培养含有前一天效应细胞（3T3s）的培养皿（上面的步骤B2c），使用小的黄色尖端并轻轻抽吸（有助于确保多孔板倾斜并且尖端仅接触孔底部的边缘，以避免去除粘附的细胞。
  4. 在3T3效应物的顶部每孔加入100μl含有1×10 6个 4 细胞的悬浮液（或基于上述步骤B2中描述的转化的等效体积和细胞数）。 br /> 注意：通过接种上述数量的上皮细胞，使用1：1（效应子：靶）比例（例如，HCT116细胞）;但是在某些情况下，1：0.8的比例可能是最佳的（例如，EJ细胞）。
  5. 现在建立了共培养物，并将多孔板（或培养皿）在37°C温育（图1B）。
  6. 孵育期根据要进行的测定或程序而变化（例如，细胞死亡测定，上清液的收集或裂解细胞）。图2B提供了72小时的代表性共培养物的实例。
    注意：
    1. 对于正常上皮细胞与3T3效应物的共培养，遵循相同的步骤，然而对于这种共培养物，将正常（NHU）细胞接种在它们自己的（无血清，KSFM培养基）中。
    2. 对于功能性抑制实验，可根据需要在任何药理学抑制剂的持续存在下进行共培养。
  图2.效应细胞（3T3Neo和3T3CD40L）单独或与上皮细胞（HCT116）共培养的图像。 A.MMC处理前后3T3Neo和3T3CD40L效应细胞的代表性相差图像，这是为了介导3T3细胞生长停滞而进行的。这些图像证实了3T3细胞在治疗后如何保持活力和健康。 B.生长停滞的3T3Neo和3T3CD40L效应细胞与癌细胞系HCT116的代表性共培养物的相差显微镜图像72小时。 HCT116细胞与3T3CD40L成纤维细胞的共培养代表'mCD40L'的递送，而与3T3Neo的共培养用作'对照'。注意由于存在暗的，相 - 非 - 亮的凋亡细胞（代表性死细胞或这些细胞的聚集体，由实心三角形表示），细胞毒性是如何明显的。比例尺=100μm。
通过可溶性激动剂激活CD40连接
1. 为了比较mCD40L与可溶性激动剂的作用，以上述相同密度接种的上皮细胞常规用经过充分表征的激动性抗-CD40 mAb G28-5进行处理（Bugajska 等。，2002）。
2. 在上皮细胞接种过程中以10μg/ ml的浓度添加G28-5单克隆抗体（mAb）（mAb从HB-9110杂交瘤细胞系的培养上清液中纯化）。
3. 为了增加mAb的交联能力，使用以2.5μg/ ml使用的亲和纯化的人血清蛋白吸附的山羊抗小鼠IgG（X-接头）交联抗体。添加G28-5 mAb后30分钟将X-接头添加到培养物中。
  注意：可溶性激动剂与mCD40L的促细胞凋亡能力差异已在其他地方展示和详述（Dunnill等，2017）。
检测细胞死亡（细胞凋亡）的生化标志物
1. 细胞膜完整性丧失（透化）
  1. 将种子癌细胞置于96孔白色组织培养处理的平板中的生长停滞的3T3顶部（如上所述），并在37℃下孵育48小时（或72小时）。
  2. 加入50μlCytoTox-Glo TM 底物（参见试剂），在室温下避光孵育10分钟（因此最终体积为150μl/孔）。
  3. 使用FLUOstar OPTIMA（BMG Labtech）读板器测量发光（RLU）。
  4. 使用MARS软件（BMG Labtech）获取数据并通过Microsoft Excel进行适当分析以校正与3T3成纤维细胞相关的背景（详见数据分析部分）;代表性数据如图3所示。
  图3.检测作为细胞死亡标志物的质膜完整性丧失。<3> 3T3Neo和3T3CD40L成纤维细胞与HCT116和EJ肿瘤细胞共培养，如正文中详述48小时。使用Cytotox-Glo试剂检测膜完整性的丧失。所有培养物（共培养物和单培养物）的原始数据（相对发光单位，RLU）显示在图A中。仅对共培养物的数据，在成对减去3T3Neo（对照）和3T3CD40L（mCD40L）培养物RLU读数后获得。来自各个共培养物（'bkgd corr'）获得的RLU读数，在图B中显示（也参见数据分析）。最后，数据表示为C组中的倍数变化（即，'mCD40L RLU'/'控制RLU'，每种共培养物）。
2. 效应caspase激活
  1. 在96孔白色，组织培养处理的平板中生长停滞的3T3s上的种子癌细胞（如上所述）并在37℃下孵育48小时或72小时（后一时间点通常提供更强的半胱天冬酶活性）。
  2. 用50μl培养基填充所有孔，然后加入50μlSensoLyte®均质AFC Caspase-3/7底物（参见试剂），使总体积为200μl/孔。
  3. 将板在室温（RT）下在黑暗中孵育过夜，然后使用FLUOstar OPTIMA（BMG Labtech）读板仪分别使用激发/发射355 nm / 520 nm滤光片测量荧光（RFU）。
  4. 使用MARS软件（BMG Labtech）获取数据并使用Microsoft Excel进行适当分析，以校正与3T3成纤维细胞相关的背景（详见数据分析部分）;代表性数据如图4所示。
  图4.效应物胱天蛋白酶活化的检测将3T3Neo和3T3CD40L成纤维细胞与HCT116和EJ肿瘤细胞共培养，如图3所示72小时。使用Sensolyte半胱天冬酶3/7试剂检测效应子半胱天冬酶3/7活性。在从各个共培养物（'bkgd corr'）获得的RFU读数中成对减去3T3Neo（对照）和3T3CD40L（mCD40L）单培养RFU读数后获得共培养物的相对荧光单位（RFU）数据并显示在图A中，数据也表示为B组中的倍半胱天冬酶活性（即，'mCD40L RFU'/'控制RFU'，用于每种共培养物）。
3. DNA片段化
  1. 对于该测定，并且如图1B中所示，在用MMC处理3T3成纤维细胞并接种的那天，可以用浓度为10μM的DNA标记试剂BrdU处理（'脉冲'）上皮细胞（根据制造商的说明，见试剂）一夜之间（O / N）。
  2. 第二天，上皮细胞用EDTA / PBS洗涤一次，通过胰蛋白酶消化提取，计数，然后作为200μl悬浮液加入生长停滞的3T3细胞顶部（从培养基中取出培养基后，如下所述）上面的文化协议）。然后将细胞培养物温育48小时（或72小时）。
  3. 作为阳性对照并且为了计算％DNA片段化（下文），用0.5μM星形孢菌素（STS）（或者，3μg/ ml多柔比星）单独处理癌细胞48小时。
  4. 测量DNA片段化前一天，根据制造商的说明准备（'涂层'）ELISA板以检测片段化的DNA。
  5. 在实验当天，从共培养物中收集上清液，并将100μl培养上清液加入到包被的96孔ELISA板中的适当孔中;按照制造商的描述进行ELISA，完成后，在4°C下孵育96孔ELISA板O / N.
  6. 在第二天，完成ELISA测定（如制造商的说明书中所述）并使用FLUOstar OPTIMA（BMG Labtech）读板仪测量455nm处的吸光度（Abs）。
  7. 使用MARS软件（BMG Labtech）获取数据并通过Microsoft Excel进行分析。
  8. 如下计算％DNA片段化：％凋亡细胞=（共培养细胞的Abs）×100 /（用STS处理的靶细胞的Abs）;代表性数据如图5所示。
  的图5. DNA的检测片段化。 3T3Neo和3T3CD40L成纤维细胞用DNA标记试剂（BrdU的）共培养-pulsed HCT116细胞48个小时，使用ELISA测定如详述部分中检测到的DNA片段化正文。原始吸光率读数（在455nm的波长）在图A以0.5μM呈现两个共培养物，而治疗HCT116细胞的星形孢菌素（STS）充当了最大DNA片段的阳性对照。共培养获得的值表示为相对于STS的％DNA片段化（％DNA片段）（图B），如在正文的适当部分中详述的那样计算。
检测细胞内细胞死亡介质
1. 活性氧物种
  通过分光光度法测量荧光
  1. 如上所述（在96孔板中）将上皮细胞与3T3Neo和3T3CD40L细胞共培养。然而，值得注意的是，当进行这种共培养时，3T3s不会被MMC抑制生长，以避免由于与CM-H2DCFDA的相互作用而产生高背景荧光读数。
    注意：实验的持续时间很短，因此3T3细胞的任何生长都不会影响这种短期共培养物的整体细胞活力。
  2. 孵育共培养物所需的时间（从30分钟到3小时）。
  3. 洗涤细胞，用PBS以除去任何培养基然后添加100μl/孔的预温热（37℃）含有1 CM-H 2 DCFDA的μM并在5％CO <子>在37℃下温育30分钟PBS 2 。处理后，取出CM-H2DCFDA试剂，加入100μl预热（37°C）PBS。
  4. 在激发485 nm /发射520 nm的FLUOstar OPTIMA（BMG Labtech）读板仪上测量荧光。
  5. 使用MARS软件（BMG Labtech）获取数据并使用Microsoft Excel进行适当分析，以校正与3T3成纤维细胞相关的背景（详见数据分析部分）;代表性数据在图6A中提供。
  通过流式细胞术测量荧光
  1. 治疗（标签）的所需数量的上皮细胞（例如，EJ）用含有1μMH2DCFDA的预加热的PBS，并在5％CO <子>在37℃下温育30分钟2 < /子>。上皮细胞可以粘贴或悬浮时进行标记。
  2. 在6孔板中用如上所述的3T3Neo和3T3CD40L效应物共培养CM-H2DCFDA标记的上皮细胞3小时。
  3. 共培养后，加入200μl胰蛋白酶提升细胞，当细胞分离时，加入500μl含5％FBS的PBS灭活。
  4. 将细胞收集在1.5 ml样品管中，并在4℃下以210 x g 离心10分钟。
  5. 弃去上清液，重悬于冷PBS（或FACS缓冲液）中，并使用Guava EasyCyte仪器通过流式细胞术测量荧光。使用Guava EasyCyte软件分析采集后的数据;图6B提供了这种分析的一个例子，并说明了仅用于测量上皮细胞中ROS诱导的“门控”策略（以及排除任何3T3细胞相关的自发荧光）。
  的图6检测ROS的通过分光光度法（A）和流式细胞仪（B）分析 A. 3T3Neo和3T3CD40L成纤维细胞在96个孔板中共培养与EJ细胞30分钟，然后接种。如正文中所述，用CM-H2DCFDA标记培养的细胞。在从3T3Neo和3T3CD40L单独培养物中成对背景扣除后获得RFU数据。未标记的共培养物（无标记）用作阴性对照（左）。数据也表示为相对于对照的RFU读数的倍数变化（右）。 B.将3T3Neo和3T3CD40L成纤维细胞接种在24孔板中，然后与EJ细胞共培养3小时（EJ在共培养前用CM-H2DCFDA标记）。绿色荧光强度直方图提供了指示两个群体（'峰'），3T3和上皮细胞的荧光模式，其未标记并分别用CM-H2DCFDA标记。如上所示（门R1）对上皮细胞群（右峰）进行适当的“门控”，用于3T3Neo / EJ（上部直方图）和3T3CD40L / EJ共培养物（下部直方图）。来自两者的数据在门控后重叠（右图），以便仅鉴定EJ细胞中荧光强度的变化。强度的变化（灰色对空）表明由mCD40L介导的ROS诱导。
  注意：对于ROS的分光光度法和流式细胞术检测，3T3细胞未被MMC抑制生长，以确保用CM-H2DCFDA标记后缺乏显着的背景荧光。 < br />
2. 衔接蛋白和促凋亡激酶（免疫印迹）
  1. 种子3T3Neo和3T3CD40L细胞用MMC（上文）处理10cm直径培养皿，30×10 5培养细胞/培养皿，10ml DR 5％，或6孔培养皿，3×10 < sup> 5 /孔在2ml培养基中（对于每种条件制备重复的培养皿或孔）。在37°C O / N孵育培养皿/培养皿。
  2. 在O / N附着后，去除上清液并在含有30×10 5 5 细胞/培养皿的DR / 5％培养基中加入10ml靶细胞悬浮液或在含有3×10 5的2ml中加入 sup>细胞/孔在6孔板中。
  3. 将培养皿/培养皿在37°C和5％CO 2 孵育一段所需的时间（从1.5小时到36小时不等）。
  4. 完成孵育期后，通过添加150μl完全裂解缓冲液/培养皿或70μl/孔制备裂解液用于6孔板（参见裂解缓冲液制备配方）并如所述（Dunnill 等人，2017）。
  5. 对40μg蛋白质裂解液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹，以检测靶细胞中的细胞内蛋白质表达;代表性数据如图7B所示。
    注意：虽然β-肌动蛋白的表达可用于证明总体相等负荷，因为裂解物是由3T3neo / 3T3CD40L和上皮细胞共培养物制备的（因此是细胞类型的混合物 - 上皮细胞和非上皮细胞）），必须确保上皮细胞确认（并在必要时进行调整）样品加载;这可以根据与人特异性抗细胞角蛋白抗体（例如抗CK8或抗CK18）的反应性进行 - 参见图7A的实例和其他地方（Dunnill等，2017）。
  图7.使用免疫印迹检测mCD40L激活的细胞内信号蛋白。 HCT116细胞与3T3Neo（' - '）和3T3CD40L（'mCD40L'）成纤维细胞共培养指定的时间段和全细胞如正文中所述制备的蛋白质裂解物。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析40微克总蛋白质。 β-肌动蛋白表达显示总体上相等的负荷，同时根据与人特异性抗CK18抗体的反应性确认上皮细胞裂解物的正确上样（参见正文）（图A）。用于检测TRAF3和磷酸化ASK1的代表性实验显示在图B中。注意如何单独包含来自3T3CD40L培养物的裂解物证实了抗体对人（上皮）细胞蛋白检测的特异性。

数据分析

使用上面列出的软件进行分析以生成原始数据和图像。在Excel上分析数据，并使用Adobe Photoshop CS处理图像。
为了计算细胞死亡或测量ROS诱导，必须确保由于存在效应3T3细胞而引起的任何背景“噪音”通过从共培养细胞的读数中减去来解释。因此，适当地成对地减去背景荧光或发光读数;从3T3CD40L + HCT116共培养读数中减去单独3T3CD40L培养物的即，RFU或RLU读数（并且类似地对于3T3Neo和3T3Neo + HCT116共培养读数）。豁免是DNA片段化，因为仅仅预先标记了靶上皮细胞，这是不必要的。此外，在所有实验中，适当地包括空白对照。
平均值和标准偏差（SD）用作描述性统计。双尾，配对或非配对学生的 t - 测试，以及适当的ANOVA，用于评估统计学显着性。对于所有实验，包括最少5-6个技术重复，并且一式三份进行实验（n = 3）。

笔记

为了确保用于制备共培养物的所有细胞都是健康的，重要的是要合理地快速工作并确保细胞具有足够的CO 2 并保持在37°C不使用的时候。
用于检测细胞凋亡标记物的所有试剂（除非制造商另有说明）必须解冻并在加入细胞前充分置于室温。

食谱

AQUAGUARD-1解决方案
10毫升AQUAGUARD-1
1,000毫升ddH 2 O
1x PBS
900毫升ddH 2 O
100毫升10倍D-PBS
PBS / EDTA
1克乙二胺四乙酸（EDTA）
1,000毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1x）
冷冻媒体
10％（v / v）FBS
10％（v / v）DMSO
80％（v / v）标准培养基
70％乙醇
700毫升乙醇
300毫升ddH 2 O
DR媒体
250毫升DMEM
250毫升RPMI
补充5％FBS和1％L-谷氨酰胺维持癌细胞或10％FBS和1％L-谷氨酰胺维持3T3细胞
FACS缓冲区
9毫升1x PBS
1毫升FBS

SSB缓冲区

甘油	10毫升
十二烷基硫酸钠（SDS）	1克
Tris-HCl	6.25ml（储备溶液1M，pH6.8）
氟化钠（NaF）	0.42克
焦磷酸钠四元素	0.446克
原钒酸钠	0.0184克

使用ddH 2 O
使最终体积达到50 ml 注意：该溶液需要在50°C加热时搅拌。

裂解缓冲液（用于制备细胞裂解液）
1毫升SSB缓冲液
13μlDTT溶液（PBS中2mg / ml）
2μl蛋白酶抑制剂（PI）混合物（VWR）或10μlPI鸡尾酒（New England Biolabs）

致谢

根据我们以前发表的研究（Dunnill et al。，2017），共培养方案是一个经过改进和进一步优化的版本。 KI得到了博士学位的支持。伊拉克高等教育和科学研究部的奖学金。 AM和BA获得海外博士学位。利比亚高等教育部的奖学金。 MI是博士。学生目前得到Laura Crane Youth Cancer Trust的Jacquie Roeder研究基金的支持。所有作者均声明不存在利益冲突。

参考

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Bugajska，U.，Georgopoulos，N.T.，Southgate，J.，Johnson，P.W。，Graber，P.，Gordon，J.，Selby，P.J。和Trejdosiewicz，L.K。（2002）。恶性转化对人尿路上皮细胞对CD40介导的细胞凋亡的易感性的影响。 J Natl Cancer Inst 94（18）：1381-1395。
Dunnill，C.J.，Ibraheem，K.，Mohamed，A.，Southgate，J。和Georgopoulos，N。T.（2017）。由氧化还原状态决定的信号通路解读CD40介导的细胞凋亡的恶性细胞特异性。 Oncogene 36（18）：2515-2528。
Georgopoulos，N.T.，Merrick，A.，Scott，N.，Selby，P.J.，Melcher，A。和Trejdosiewicz，L.K。（2007）。 CD40介导的结直肠癌死亡和细胞因子分泌：炎症性肿瘤细胞杀伤的潜在靶点。< / a> Int J Cancer 121（6）：1373-1381。
Georgopoulos，N.T.，Steele，L.P.，Thomson，M.J。，Selby，P.J.，Southgate，J。和Trejdosiewicz，L.K。（2006）。 CD40诱导癌细胞凋亡的新机制，涉及TRAF3和JNK / AP-1激活。细胞死亡不同 13（10）：1789-1801。
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