材料和试剂

MatTek菜肴（35毫米，＃1.5盖玻片，20毫米开口：MATTEK，目录号：P35G-1.5-20-C）
ColorpHast pH指示条，pH范围6.5-10（默克，目录号：109543）
10-100和1,000μlGilsonMICROMAN ®正位移移液器吸头（Gilson，目录号：FD10004，FD10006）
10cm组织培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：150350）
细胞提升器（康宁，目录号：3008）
铝箔
保鲜膜
闪烁瓶（Sigma-Aldrich，目录号：Z190527）
1.5 ml微量离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM12400）
Dubecco的最小必需培养基（DMEM）粉末，酚红（Sigma-Aldrich，目录号：D2429）
NaOH颗粒（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
磷酸盐和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS ++ ）冷却至4°C并在室温下（GE Healthcare，Hyclone TM ，目录号：SH30264.02）< br />
大鼠尾胶原蛋白溶液（溶于20 mM乙酸，商业品牌很好，但内部制剂通常更清洁，聚合更快）浓度大于5 mg / ml（此处使用6 mg / ml）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
硼酸（粉末99.5％，Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
乙酸（西格玛奥德里奇，目录号：27221-1L）（冷藏至4°C，低于50毫升，16.65米是必需的）
Atto-488 NHS-酯1mg（Sigma-Aldrich，目录号：41698）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
Sircol Collagen Assay试剂盒（可从Accurate Chemical＆amp; Scientific获得，目录号：CLRS1000）
Slide-A-Lyzer透析盒（G2），截止频率为20,000 MW（Thermo Fisher Scientific，目录号：87735）
1 M Tris（pH 7.4，KD Medical，目录号：RGF-3340）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
HCl（37％，Sigma-Aldrich，目录号：H1758-500ML）
10x DMEM（见食谱）
10x重构缓冲液（10x RB;参见食谱）
1N NaOH（微量离心管中500μl;参见配方）
1 N HCl（微量离心管中500μl;参见配方）
50 mM硼酸盐缓冲液pH 9.0（参见食谱）
在DMSO中的5mg / ml Atto-488 NHS-酯染料（参见配方）
氯化钠（NaCl），8％溶液（见食谱）
50 mM Tris缓冲液（见食谱）

设备

10-100和1,000μlGilsonMICROMAN ®容积式移液器（Gilson，目录号：F148314，F148180）
实验室计时器
2-4 L烧杯
超透明8 x 20 mm离心管（可选：Beckman Coulter，目录号：345843）
装满冰的长方形冰桶
水浴
大型烧杯大型磁力搅拌棒（Sigma-Aldrich，SP Scienceware - Bel-Art Products - H-B Instrument，目录号：Z284491）
用于闪烁瓶的小磁力搅拌棒（Sigma-Aldrich，SP Scienceware - Bel-Art Products - H-B Instrument，目录号：Z126942）
搅拌盘
小型离心机（即，VWR，型号：Galaxy Mini）
生物罩（任何品牌）
具有10倍和20倍相位对比度的明场显微镜
冷却离心机能够达到20,000 g和4°C（即，TOMY，型号：MX-307）
Lab Rocker（即。，Denville Scientific，型号：110，目录号：S2110）
Airfuge超级离心机（可选：Beckman Coulter，目录号：340400）
激光扫描或旋转盘共聚焦显微镜（即，尼康仪器，型号：A1R;或横河电机，型号：CSU-X1）

程序

注意：如果您计划反复制作胶原蛋白凝胶，强烈建议您投资10-100和100-1,000μl容积式移液器。这些有助于准确移取粘性溶液（如胶原蛋白）。移液准确度越高，整体实验重现性越好。

胶原蛋白凝胶计算
1. 在产生任何胶原凝胶之前，准确计算储备溶液所需的不同组分的体积是很重要的。因为仅有一小部分（2-4％之间）的标记胶原用于凝胶生成，所以相对少量的胶原用于标记过程。通常，重周的实验将需要产生含有150μl胶原的20-24个培养皿并使用约2,000μl的原液浓度的胶原蛋白。这相当于每周使用40至80μl或120至240μg标记胶原的范围。这里，5ml标记的3mg / ml胶原蛋白应该在相似的使用期间持续37至75周。可以标记较小体积的胶原蛋白，但由于方案中的正常损失，建议使用不少于2.5ml的胶原蛋白。以下步骤将引导您完成初始计算。
  1. 计算胶原蛋白量：
  2. 除以10来计算10x RB和10x DMEM的数量：
    10x DMEM：
    10x RB：
  3. 1N NaOH的体积将根据您的原料胶原浓度的pH值而变化，其浓度可在1.8和3.0之间变化。一个好的起点是每毫升胶原蛋白添加3微升，然后相应调整。我们发现16μl适合我们自制的胶原蛋白。
    注意：这取决于胶原蛋白的原始pH值，并且甚至可以在商业批次和制剂之间变化。确定每道菜所需的实际数量可能需要进行初步测试。
  4. 计算PBS ++ 的数量：
胶原蛋白凝胶制剂
1. 将所有凝胶组分在冰上预冷（胶原原液，10x DMEM，10x RB，1N NaOH，1N HCl，PBS ++ ）和10cm组织培养皿。最后添加组织培养皿：在添加凝胶成分之前，确保没有水凝结在内盘表面上。
  注意：为了减少从锥形管转移到10厘米组织培养皿时胶原蛋白溶液的损失，我们发现直接在培养皿中混合是有帮助的。
2. 将适当计算量的原料胶原溶液（2.5ml）移液到预冷的组织培养皿中。一定要把菜放在冰上。
3. 加入10倍DMEM（0.25毫升），然后加入10倍RB（0.25毫升）。用1ml容量移液管加入各缓慢研磨后，确保不引入任何气泡。或者，您可以使用细胞刮刀进行均质化。
4. 将计算的1N NaOH加入溶液中，用正位移移液管或细胞刮刀研磨/混合。一旦溶液充分混合并显示一致的单一颜色，取2μl样品并用pH条测试pH，等待1-2分钟以确定pH。 pH值应介于7.0和7.4之间，溶液颜色应为桃色（粉红橙色：图1）。如果溶液的pH值超过7.4，则用1N HCl调节，每次1μl。一定要注意变化，并相应地调整PBS ++ ，包括2μl样品（即，如果加入2μlHCl，则减少PBS ++ 相同数量）。
5. 将PBS ++ （必要时调整）加入组织培养皿中直至完全混合并再次置于冰中。
6. 通过将培养皿倾斜45度并旋转培养皿，允许重力帮助将胶原蛋白均匀地铺展在培养皿上。
7. 将培养皿盖住并放置在工作台顶部，让胶原蛋白在室温下（约21°C）聚合。 30分钟后在倒置明场显微镜上使用10x或20x相衬物镜通过眼睛检查胶原凝胶，然后每15分钟检查一次。应该看到小而交织的原纤维（图1）。同样，聚合过程可以根据使用的胶原改变制剂的制备。孵育时间太短会导致胶原蛋白凝胶完整性的丧失和胶原蛋白单体的整体损失，并导致最终产品浓度大大降低。较长时间的孵化没有重大影响（总是在较长的孵化时间）。如果您不确定，建议以150μl的小批量进行测试。此外，在添加PBS ++ 之前和之后拍摄明场图像将有助于确定结构是否发生了显着变化。
  
  图1.聚合胶原凝胶工作流程的荧光标记。协议程序B和C的原理图工作流程。图像显示3mg / ml大鼠尾胶原在21℃聚合1小时（用20x物镜拍摄）。注意可辨别的胶原纤维的外观。
用NHS-酯染料标记胶原蛋白凝胶
1. 溶液完全聚合并形成凝胶后，加入10 ml 50 mM硼酸盐缓冲液（pH 9.0），在室温下孵育15 min。
2. 同时，使用以下等式计算正确标记凝胶内蛋白质量所需的染料量：
3. 上述等式是对于1mg的Atto-488 NHS-酯，用200μl（5mg / ml）DMSO稀释，使用2摩尔过量，这是该公司推荐的。
  注意：每种染料都有不同的摩尔过量，最适合NHS结合。不要认为上述内容适用于所有染料。过度贴标可能会导致凝胶形成问题。
4. 将45.28μlAtto-488 NHS-酯染料加入15 ml锥形管中，用50 mM硼酸盐缓冲液将体积调至5 ml，并快速涡旋。
5. 小心地从组织培养皿中吸出硼酸盐缓冲液（将培养皿置于45度角，并用吸管吸取底部边缘的虹吸管）。
6. 将染料溶液加入胶原凝胶中，用铝箔包裹培养皿，避免光照。让染料在室温下与胶原凝胶结合1小时或在4°C下结合4小时（可以过夜），同时摇摆。
  注意：在室温下，大部分染料将在前20分钟内结合。
7. 吸出染料并加入10ml 50mM Tris缓冲液（pH7.5）以淬灭染料反应。摇动孵育10分钟。保持凝胶覆盖箔。
8. 加入10毫升PBS ++ 。在接下来的4小时内用PBS ++ 6 x冲洗凝胶以洗掉过量的染料。
将胶原凝胶液化成溶液
1. 吸出PBS ++ 并翻转培养皿，将其一侧盖在组织培养罩中盖上10-15分钟，以减少凝胶中的液体量。
  注意：本节中的其余步骤应在4°C下执行。
2. 向凝胶中加入500至1,000μl的500mM乙酸。将凝胶放入冷室并缓慢摇动1小时。
  注意：添加的醋酸量越大，凝胶越容易进入溶液状态。但是，这会降低您的最终浓度。我们建议从500μl开始，如果需要，随着时间的推移逐渐增加。
3. 1小时后，使用细胞刮刀混合凝胶。将凝胶刮到培养皿的一侧（以一定角度）并用1,000μl正位移移液管吸取凝胶溶液，设置为750μl。如果使用常规移液器，由于凝胶粘度，您可能需要在大约100μl标记处切断移液器吸头以获得更大的尖端开口。
4. 将胶原蛋白溶液转移到用铝箔包裹的闪烁瓶中，并加入小磁力搅拌棒。在4℃下搅拌凝胶过夜。定期检查凝胶是否已进入溶液状态。你不应该看到聚合胶原蛋白的任何'块'。如果这样做，添加更多的乙酸，然后在4°C下进一步搅拌几个小时。或者，取5至10μl并在35 mm组织培养皿中涂抹，并在显微镜下以10x放大倍数检查溶液浓度。
5. 检查凝胶的体积。根据起始体积（5 ml）和浓度（3 mg / ml），您可以对浓度进行有根据的猜测。如果您需要更浓缩的溶液，请继续进行盐沉淀方案（程序F）。如果猜测没问题，那么继续下面的下一步。
透析染料标记的胶原溶液
1. 在4℃下预冷8L 20mM乙酸。这需要9.6毫升16.65 M溶液（标准购买浓度）。
2. 将4L 20mM乙酸加入大烧杯中。在酸中润湿Slide-A-Lyzer G2盒。将胶原蛋白移入盒式磁带，确保在关闭之前清除任何气泡。
3. 在烧杯中加入一个大的搅拌棒和装有标记胶原蛋白的盒子，盖上保鲜膜，用橡皮筋牢牢固定保鲜膜。用铝箔覆盖烧杯的上部3/4，以保护标记的胶原蛋白免受过量光照。搅拌4小时。
4. 改变醋酸一次，再过夜透析。
5. 将胶原蛋白溶液从盒中取出至几个1.5ml离心管中。将管置于冷却离心机中。在4℃下以20,000 x g 旋转1小时。取出并保存上清液，小心不要拔出任何颗粒。
6. 按照Sircol胶原蛋白测定法测定胶原蛋白的浓度。
7. 荧光标记的胶原蛋白可以在4°C下避光保存一年以上或无限期保存在-80°C。
使用盐沉淀浓缩胶原蛋白溶液（改编自 Chandrakasan 等，1976）
1. 在4°C下执行所有步骤。
2. 估计要浓缩的胶原蛋白的当前体积（应该仍然在闪烁瓶中）并添加等体积的8％NaCl。
  注意：沉淀物应在几分钟内开始形成。
3. 将溶液在4°C搅拌4小时或过夜。
4. 一旦液体部分澄清，没有明显的胶原蛋白残留，将胶原蛋白转移到15ml离心管中。
5. 在13,000 x g 下将溶液在4℃下旋转20分钟。
6. 吸出上清液并保持沉淀。加入2毫升500毫升乙酸（大约浓缩两次）。＆nbsp;
7. 在15 ml管中加入一个小磁力搅拌棒，在4°C下搅拌溶液，直至胶原蛋白进入溶液，3-4小时。
8. 转到程序E进行透析。
用未标记的胶原蛋白计算和混合标记的鼠尾胶原蛋白并获得适当的量
注意：许多研究人员将荧光标记和未标记的胶原蛋白溶液以特定比例（1：5,1：4等）混合在一起，以产生能够维持细胞寿命的荧光可见胶原凝胶。完全标记的胶原蛋白不会聚合，并且通常对于实际成像来说太亮。通常最终的胶原蛋白浓度不正确地确定，因为比率没有考虑标记和未标记部分之间胶原浓度的差异。此外，标记胶原蛋白浓度的批次间差异使凝胶一致性成为可能改变实验结果的问题。这里描述了如何计算和混合基于蛋白质重量的2-4％（显示4％）荧光标记的凝胶以构成6ml体积。即使变化很小，我们建议始终使用下面步骤6中显示的计算的最终浓度。注意，始终将胶原蛋白溶液保持在4°C或冰上，以减少蛋白质降解的可能性。
1. 计算4％的未标记胶原蛋白（ULC）是否适合您想要混合的量：
2. 多个 X 按0.04获得此金额的4％（ Y ）。
3. 使用此数字然后计算您需要从未标记的卷中取出的音量（ V ）。
4. 对上述＃3中的荧光标记胶原蛋白（FLC）进行计算也是如此。
5. 将它们一起在15ml锥形管中在4℃下缓慢混合1小时。转移至1.5 ml离心管并以20,000 x g 旋转30分钟以去除任何碎片。
6. 计算'新'量（ C ;以mg为单位），因为在3和4中删除并添加的卷可能不相同。
  
  注意：蛋白质（mg）应与步骤G1相同。
  然后将新的 C 除以总体积（TV = [总UL RTC - 删除] + [添加F RTC]）。
7. 用浓度标记管，并在4°C下储存。
胶原蛋白清除（可选）
注意：要从原始胶原蛋白处理或标记过程中去除多余碎片的胶原蛋白溶液，使用Beckman Coulter Airfuge以高RPM旋转可快速清除溶液。
1. 使用正位移移液管，将450μl4％标记的胶原蛋白添加到4个8 x 20 mm离心管中。
2. 将管加入离心机转子，锁定设备并启动旋转。调节压力以在25-30 PSI（约90,000-10,000 rpm）之间进行调节。设定时间为30分钟。
3. 30分钟后，在离心管的底部边缘经常会出现彩色条纹。确保不要打扰沉淀的胶原蛋白，将上清液移至15毫升锥形管中，并在4℃下储存。＆nbsp;
4. 用剩余的胶原重复该过程（这通常需要总共12个管）。
5. 这种4％荧光标记的胶原蛋白现在可用于生成用于活细胞显微术的单个胶原凝胶，使用程序I（下文）中的计算和程序B中使用的方案。
胶原蛋白凝胶为20毫米直径的MatTek玻璃底盘
注意：对于20 mm直径的玻璃底皿，150μl胶原蛋白溶液将产生300μm厚的凝胶。由于胶原蛋白溶液的高粘度和一些体积/管的损失，每个培养皿额外增加20μl用于计算。始终聚合至少1个额外的菜超过你需要的。以下是每种条件下2个培养皿的实例计算，最终浓度为3 mg / ml。
1. 2（餐具）x 170（每个培养皿中的μl胶原蛋白）=340μl的胶原蛋白溶液
2. 计算胶原蛋白量：
3. 除以10来计算10x RB和10x DMEM的数量：
  10x DMEM：
  10x RB：
4. 1N NaOH的体积：~1μl＆nbsp;
5. 计算PBS ++ 的数量：
6. 遵循程序B.改变聚合温度将改变聚合时间和结构（Doyle et al。，2015）。降低聚合温度导致凝胶形成较慢。我们假设降低温度导致原纤维聚合的成核位点减少，因此原纤维延伸得更多，并在图2中观察到更大的孔径。
7. 预计按照该协议，使用激光扫描共聚焦，旋转盘共聚焦（图2）或光片显微镜可以容易地观察到单个原纤维。
  
  图2. 4％标记胶原蛋白的荧光图像。 A.单一共焦切片（XY）和10％YZ投影（右）4％atto 488标记的3 mg / ml大鼠 - 尾胶原凝胶在21°C聚合。 B.图A中所示的胶原凝胶的3D渲染（X，Y，Z尺寸：分别为100×100×80μm）。 C.用EGFP-α-辅肌动蛋白（品红）转染的HT-1080纤维肉瘤癌细胞的高分辨率最大强度投影，其通过在16℃聚合的Atto 565标记的3mg / ml大鼠尾胶原（绿色）迁移。图像显示时间序列中的第一帧（左）和63 rd 帧（右）（Z每15微米，每隔30秒在Z上成像）。时间以分钟为单位。

笔记

虽然使用鼠尾胶原蛋白是一种使用3D水凝胶的简单方法，但它需要重复才能使凝胶变得一致。胶原蛋白I型3D凝胶高度依赖于1）胶原浓度，2）离子浓度，3）pH，当然还有4）温度。因为这些中的每一个都会影响聚合时间，这不可避免地导致ECM结构的差异，所以上述每个参数在实验之间是一致的是至关重要的。 pH值是迄今为止变化最大的，因为它需要进行测试和调整以中和每批胶原蛋白。建议每批应检查pH值，并且不要假设1 N NaOH的量总是相同。在整个方案中使用小等份的储备溶液以减少由于随时间发生的蒸发引起的浓度变化。
需要注意的其他关键问题是10x DMEM解决方案：由于盐度高，在4°C或冰上时总会出现沉淀物。研磨10倍DMEM溶液对于保持一致的离子浓度是重要的。

食谱

10x DMEM（50 ml）
1. 将1份含酚红（Sigma-Aldrich）包装的粉末DMEM加入50ml蒸馏水中
2. 用热（约50℃）搅拌混合物直至DMEM粉末进入溶液中
3. 温暖时无菌过滤。制备4个10ml和20个0.5ml等分试样。 0.5ml大小的等分试样用于日常实验
4. 将两种尺寸储存在-20°C直至使用。将热等分试样在37°C水浴中解冻，然后在冰上涡旋并冷却
5. 可在-20°C下无限期保存，在4°C下保存1个月
10x重建缓冲液（100 ml）
1. 2.2克碳酸氢钠（Sigma-Aldrich）
2. 4.8克HEPES（Sigma-Aldrich） - 或 - 20毫升1M HEPES原液，最终0.2 M
3. 蒸馏水可达100毫升
4. 过滤灭菌并在-20°C下储存成类似于10x DMEM的等分试样
5. 可在-20°C下无限期保存，在4°C下保存1个月
氢氧化钠溶液（NaOH），1N
1. 0.5g NaOH颗粒（Sigma-Aldrich）
2. 蒸馏水至12.5毫升
3. 充分混合并过滤灭菌，分成500μl等分试样并无限期保存在-20°C
1 N HCl
1ml HCl（37％或12M，Sigma-Aldrich）
蒸馏水至12毫升
过滤灭菌，分成500μl等分试样并无限期保存在-20°C
50 mM硼酸盐缓冲液（pH 9.0）
1. 1.55g硼酸（粉末99.5％，Sigma-Aldrich）
2. 加蒸馏水至400毫升
3. 在搅拌的同时一次加入几个固体NaOH颗粒（Sigma-Aldrich）直至pH为~9.0
4. 加蒸馏水至500毫升
5. 使用0.2μm过滤器过滤消毒
6. 在室温下储存长达1年
DMSO中的5 mg / ml荧光NHS-酯染料（200μl）
1. Atto-488 NHS-酯1mg（Sigma-Aldrich）
  注意：任何NHS-酯染料都是合适的，可以替代
2. 将200μlDMSO（Sigma-Aldrich）加入染料管中并在旋转混合器上混合（用箔包裹）1小时
3. 立即使用并以10-20μl等分试样储存多余的
4. 储存在-80°C
氯化钠（NaCl），8％溶液
1. 将4 g NaCl（Sigma-Aldrich）溶于500 ml蒸馏水中，充分混合
2. 使用0.2μm过滤器过滤灭菌
50 mM Tris缓冲液（pH 7.4）
5 ml 1 M Tris（KD Medical）
加蒸馏水至100毫升
使用0.2μm过滤器过滤消毒
在室温下储存长达1年

致谢

我要感谢Joshua Collin，Gavrel Pacheco和Tomoko Ikeuchi的有益评论。这项工作得到了NIDCR校内研究部的支持。这项工作改编自以前的工作（Doyle，2016）。作者声明没有利益冲突。

参考

Chandrakasan，G.，Torchia，D。A.和Piez，K。A.（1976）。从大鼠尾腱和皮肤制备完整的单体胶原蛋白，并在溶液中制备非螺旋末端的结构。 J Biol Chem 251（19）：6062-6067。
Doyle，A.D.，Carvajal，N.，Jin，A.，Matsumoto，K。和Yamada，K.M。（2015）。局部3D基质微环境通过收缩性依赖性粘连的时空动态调节细胞迁移。 em> Nat Commun 6：8720。
Doyle，A。D.（2016）。生成具有受控多种架构的3D胶原凝胶。 Curr P rotoc Cell Biol 72：10 20 11-10 20 16.
Fitch，S。M.，Harkness，M。L.和Harkness，R。D.（1955）。从组织中提取胶原蛋白。自然 176（4473 ）：163。
Friedl，P.，Noble，P.B.，Walton，P.A.，Laird，D.W.，Chauvin，P.J。，Tabah，R.J.，Black，M。和Zanker，K.S。（1995）。体外间充质和上皮癌外植体中协调细胞簇的迁移。 Cancer Res 55（20）：4557-4560。
Gross，J.，Highberger，J。H.和Schmitt，F.O。（1955）。通过中性盐溶液从结缔组织中提取胶原蛋白。 Proc Natl Acad Sci USA 41（1）：1-7。
Weiss，P。和Garber，B。（1952）。间充质细胞的形状和运动作为培养基物理结构的功能：对定量形态的贡献。 Proc Natl Acad Sci USA 38（3）：264-280。