材料和试剂

移液器吸头（SARSTEDT）
12孔板（Greiner Bio One International，目录号：665180）
猎鹰管
Parafilm M（Bemis，目录号：PM996）
显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，Menzel-Gläser）
盖玻片（Thermo Fisher Scientific，Menzel-Gläser）
Kimtech Science精密擦拭巾（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：75512）
方形培养皿（Greiner Bio One International，目录号：688102）
Arabidopsis thaliana 生态型Col-0
甲醇（Carl Roth，目录号：8388.4）
乙醇（Reuss Chemie，目录号：RC-A15-A）
醋酸
周期酸（Sigma-Aldrich，目录号：P7875）
偏亚硫酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9000）
盐酸（Carl Roth，目录号：4625.1）
碘化丙啶（Sigma-Aldrich，目录号：81845）
水合氯醛（Sigma-Aldrich，目录号：15307-R）
甘油（Carl Roth，目录号：3783.1）
阿拉伯树胶（Carl Roth，目录号：4159.3）
固定解决方案（见食谱）
希夫试剂（见食谱）
水合氯醛溶液（见食谱）
霍耶的解决方案（见食谱）

设备

玻璃烧杯
精密镊子（RubisTech，型号：5-SA RT，目录号：5-SA RT）
移液器（吉尔森）
通风橱（Renggli AG）
冰箱（利勃海尔）
烤箱（Ehret）
绿灯LED灯（内部制造）
共聚焦激光扫描显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP5）
注意：此产品已停产。可以使用任何共聚焦激光扫描显微镜。
电脑

软件

ImageJ（NIH USA，版本1.8， https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

来自拟南芥的表皮剥离
1. 根据规定的时间点和基因型标记12孔板，并在每个标记的孔中加入1 ml固定液（见食谱）。
2. 使用精密镊子从5 th 或6 th 叶的远轴侧收集表皮皮（图1A;视频1）。通常，每个时间点和基因型收获来自4个单株植物的4个重复。一口井含有4种表皮果皮。有关详细信息，请参阅注释1-3。
  
  视频1
3. 将含有收集的表皮皮的12孔板在4℃下在黑暗中孵育至少12小时。样品可以在4°C下储存在固定液中长达4周。表皮皮肤易碎，从现在开始需要小心处理。见注4。＆nbsp;
mPS-PI染色
1. 在通风橱中执行步骤B2-B8。
2. 使用P1000移液器从孔中取出固定液（图1B）。将废物收集在玻璃烧杯中，并在方案结束时将其丢弃到卤化液体废物中。
3. 通过加入1ml dH 2 O并在工作台上以圆周运动缓慢摇动板来洗涤样品。删除dH 2 O.
4. 通过添加1ml的80％乙醇并在65℃下孵育5-15分钟来去除表皮皮肤（图1C）。除去乙醇并重复洗涤步骤（步骤B3）。
5. 将样品在室温（20°C，室温）下在1 ml固定液中孵育1小时。取出固定液并重复洗涤步骤（步骤B3）。
6. 向表皮皮中加入1ml 1％高碘酸溶液，并在室温下孵育平板40分钟。确保用溶液完全覆盖果皮。参见注释5.除去高碘酸溶液并重复洗涤步骤（步骤B3）。仔细进行，因为在这一步之后皮肤非常脆弱。
7. 通过在室温下加入500μl席夫试剂（参见配方）和50μl碘化丙啶溶液（1mg·ml -1 ）20-40分钟来染色表皮。确保用溶液完全覆盖植物组织。在该步骤之后样品应呈现粉红色（图1D）。取出碘化丙锭溶液，分别用Falcon管收集。碘化丙锭废物应像溴化乙锭废物一样处理。
8. 在室温下将样品置于1ml dH 2 O中20-30分钟。
显微镜载玻片制备
1. 根据定义的时间点和基因型标记显微镜载玻片。
2. 在通风橱中执行步骤C3-C4和C6-C7。
3. 在每个显微镜载玻片上加入70μl水合氯醛溶液（参见食谱）。小心将溶液分布在载玻片的中心，以避免从载玻片的边缘漏出。
4. 使用精密镊子将染色的表皮果皮小心地转移到含有水合氯醛溶液的显微镜载玻片上。将所有四个重复放置在彼此旁边（如图1E所示）。滑块上的果皮应尽可能平坦。小心;果皮很容易破裂。
5. 在不放置盖玻片的情况下，将显微镜载玻片转移到方形培养皿中并在室温下在黑暗中孵育24小时。
6. 使用Kimtech擦拭物从样品的边界除去尽可能多的水合氯醛溶液（图1F）。不要用抹布接触样品。
7. 将2-3滴Hoyer溶液（参见食谱）放在表皮上并加入盖玻片。在盖玻片上施加轻微的压力，以确保果皮平整，甚至在显微镜载玻片上。
8. 将载玻片转移回方形培养皿并在室温下在黑暗中储存至少3天以使固定剂固定（图1G）。请参见注释6.幻灯片可以在黑暗中存储几个月。＆nbsp;
  
  图1.表皮的收获和染色。 A.叶背面的表皮; B.去除解决方案; C.脱皮表皮; D.粉红色的植物组织; E.含有水合氯醛溶液和表皮的显微镜载玻片; F.去除水合氯醛溶液; G.最后的幻灯片。
成像
1. 使用共聚焦激光扫描显微镜实现图像采集。
2. 设置显微镜，如表1所示。
  
  表1.保卫细胞淀粉成像的标准显微镜设置
3. 每个显微镜载玻片获得20个单个气孔图像（图2A;每个重复5个图像）。仅从表皮果皮的无叶肉部分（图2B和2C）获取气孔图片。图像气孔始终具有相同的缩放系数（6x，图2A），用于数据比较。见注7.
  
  图2.保卫细胞淀粉颗粒的成像。 A.单一气孔（比例尺=10μm）; B.无叶肉细胞的表皮剥离（比例尺=10μm）; C.表皮的叶肉细胞污染（比例尺=10μm）; D.完全（绿色圆圈）和未完全（红色圆圈）发育的气孔（比例尺=10μm）。

数据分析

使用ImageJ 1.8版（NIH USA， http）测定淀粉颗粒面积（μm 2 ）：//rsbweb.nih.gov/ij/ ）环绕颗粒区域（图3）。使用显微镜制造商提供的软件将合适的比例绘制在第一张图片上。对每个保卫细胞单独测量保卫细胞淀粉颗粒面积，每个时间点和基因型总共收集至少40个值。然后可以将淀粉含量表示为这些值的平均值。在独立植物材料上重复相同的实验设置至少3次以获得最终数据集。

图3. ImageJ中概述的保卫细胞淀粉颗粒区域。比例尺=5μm。

笔记

每个时间点和基因型的表皮剥离收获时间不应超过1-2分钟。在收获多种基因型的情况下，每种基因型收获一次重复。按照相同的顺序收集额外的重复，以确保对所有基因型进行类似的治疗。＆nbsp;
如果在黑暗中收获（例如，在夜间），任何绿色光源都可用于收集表皮果皮。＆nbsp;
为了获得适合保卫细胞淀粉染色的表皮，重要的是大部分表皮不含叶肉。
在收获后和染色过程中，当果皮存放时，确保果皮不会变干。
处理高碘酸时要小心，因为这种化合物有毒。
一旦盖玻片不再可移动，显微镜载玻片就可以成像了。
仅为完全发育的气孔获取图像（图2D）。

食谱

固定解决方案
50％甲醇
10％醋酸
用dH 2 O补足至500毫升注意：固定溶液可以存储在4°C长期使用
希夫试剂
1.9克偏亚硫酸氢钠
3毫升5 N HCl
97毫升dH 2 O
注意：将希夫试剂在4°C下保存长达2个月
水合氯醛溶液
40克水合氯醛
10毫升甘油
20毫升dH 2 O
注意：将水合氯醛溶液保存在4°C以备长期使用
霍耶的解决方案
30克阿拉伯树胶
200克水合氯醛
20克甘油
50毫升dH 2 O
注意：在带有磁棒的烧杯中将阿拉伯树胶加入水中，将其置于通风橱中的振荡器上过夜以溶解它。然后使用通风橱中的漏斗将少量的水合氯醛加入到烧杯中。让它溶解，摇晃。最后，加入甘油。在使用前让解决方案设置几天。将溶液在室温下避光保存。解决方案保持混浊。不要动摇

致谢

这项工作得到了瑞士国家科学基金会（SNSF-Grant 31003A_166539）和苏黎世联邦理工学院的支持。作者要感谢Mario Coiro在建立伪Schiff碘化丙锭染色方法方面的初步帮助; Daniel Horrer和Diana Pazmino将这种方法应用于表皮皮肤。该协议改编自Truernit 等人（2008）。作者声明没有利益冲突。

参考

Horrer，D.，Flutsch，S.，Pazmino，D.，Matthews，J。S.，Thalmann，M.，Nigro，A.，Leonhardt，N.，Lawson，T。和Santelia，D。（2016）。蓝光在保卫细胞中诱导明显的淀粉降解途径，以确保气孔开放。 Curr Biol 26（3）：362-370。
Santelia，D。和Lunn，J。E.（2017）。保卫细胞中的过敏性淀粉代谢：独特功能的独特功能。植物生理学 174（2）：539-549。＆nbsp;
Truernit，E.，Bauby，H.，Dubreucq，B.，Grandjean，O.，Runions，J.，Barthelemy，J。和Palauqui，J.C。（2008）。三维组织组织和基因表达的高分辨率整体成像使韧皮部研究成为可能拟南芥的发育和结构。植物细胞 20（6）：1494-1503。