材料和试剂

物料
1. 移液器吸头
2. 5毫升圆形一次性圆底管（FACS管）（Corning，Falcon ®，目录号：352052）
3. 铝箔（Genesee Scientific，目录号：88-101）
4. 0.2μm瓶式过滤器（Thermo Fisher Scientific，Nalgene TM ，目录号：566-0020）
5. 6孔未处理的培养板（Corning，目录号：3736）
6. 无菌细胞刮刀（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：08-100-240）
7. 无菌单独包装的血清移液管（10 ml）（Greiner Bio One International，目录号：607160）
8. 无菌单独包装的血清移液管（5 ml）（Greiner Bio One International，目录号：606160）
9. 1.7毫升微量离心机Eppendorf管（Genesee Scientific，Olympus Plastics，目录号：24-281）
10. Nunc TM TripleFlask TM 处理细胞培养瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：132867）
11. Falcon ® 50 ml锥形离心管（Corning，目录号：352098）
细胞系
1. L-929细胞（ATCC，目录号：CCL-1）
试剂
1. LPS EB-Ultrapure（来自大肠杆菌的脂多糖 O111：B4，InvivoGen，目录号：tlrl-3pelps）
2. PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10010023）
3. Mouse TruStain fcX TM （抗CD16 / 32）（BioLegend，目录号：101320）
4. TLR4 [抗小鼠CD284]（PE）（克隆：SA15-21;同种型：大鼠IgG2a，κ）（BioLegend，目录号：145404）
5. CD14 [抗小鼠]（APC）（克隆：Sa2-8;同种型：大鼠IgG2a，κ）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：17-0141-81）
6. RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11875093）
7. 胎牛血清（热灭活），经认证，美国原产地（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10082147）
8. 台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15250061）
9. HBSS，无钙，无镁（赛默飞世尔科技，Gibco TM ，目录号：14170112）
10. BSA（牛血清白蛋白）（Roche Molecular Systems，目录号：3116956001）
11. DMEM，高糖（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11965092）
12. BMDM媒体（见食谱）
13. 文化传媒（见食谱）
14. 治疗媒体（见食谱）
15. FACS缓冲液（见食谱）
16. L929条件培养基（见食谱）

设备

TC20自动细胞计数器（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450102）
移液器移液器控制器（Drummond Scientific，目录号：4-000-101）
4°C冷室
4°C台式离心机
37°C细胞培养培养箱，CO 2 对照
无菌细胞培养罩
流式细胞仪（BD，型号：FACSCanto TM II，或等效物）

软件

GraphPad Prism 7（Graph Pad Software; La Jolla，CA USA）

程序

第1天，细胞培养
1. 通过温和刮擦收集培养的骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）。通过沿试管壁反复运行移液细胞悬液，将细胞分散成单细胞悬液。离心细胞（400 x g ，5分钟，23℃），吸出上清液，并在BMDM培养基中重悬细胞沉淀。通过台盼蓝排除试验计数活细胞。
2. 在6孔未处理的组织培养板中平板0.5×10 6个细胞/孔。将细胞在2ml /孔的BMDM培养基中培养过夜。孵育16小时后（37℃，5％CO 2 ），细胞应粘附并准备好进行实验。
第0天，LPS刺激前的准备
1. 按照食谱中的描述准备培养和处理培养基。使用前将含LPS的处理介质温热至37°C。
2. 在使用前，将无菌PBS，1.5ml Eppendorf管和FACS缓冲液冷却至4℃。在LPS处理后，使用这些溶液和管收集细胞。
第0天，LPS刺激细胞
1. 吸出BMDM培养基并用3ml HBSS（室温）洗涤3次以除去每个孔中的死细胞和碎片。在培养孔壁上加入HBSS，轻轻旋转盘子洗净。
2. 向标记为“未染色BMDM”和“ t = 0分钟/未处理”治疗组的孔中轻轻加入2 ml培养基。
3. 通过沿着孔的侧面移液培养基，向每个孔中轻轻加入2ml处理培养基。轻轻旋转平板，确保介质均匀分布在孔中。
4. 在37°C孵育所需的时间点。对于剩余的LPS处理组，根据需要重复步骤3a至3c。错开LPS处理使得所有样品同时收获。
第2天，细胞收集和抗体染色
注意：所有试剂都应冷却，程序应在4°C（冷室）下进行。
1. 在收集前将步骤3中处理的转移板加热至4℃5分钟 - 这是阻止内吞作用所必需的。
2. 从每个井中吸出培养基。用2ml无菌预冷的PBS洗涤2次。
3. 每孔加入1ml无菌预冷的PBS。轻轻刮去分离细胞和移液管混合物，将细胞分散成单细胞悬液。
4. 将细胞悬浮液转移至1.5ml Eppendorf管中并离心（400 x g ，5分钟）以沉淀细胞。
5. 抽吸并弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于50μl预混有TruStain fcX TM 抗体（1μg/ ml）的冷FACS缓冲液中10分钟。
6. 在FACS缓冲液中将50μl2x浓度的抗体（抗TLR4或抗CD14;参见表1）加入细胞悬浮液中。向“未染色的BMDM”样品中加入50μlFACS缓冲液。
  
  表1.用于测量TLR4和CD14内吞作用的抗体
7. 轻轻吸取混合物，在黑暗中染色20分钟。
8. 加入1 ml FACS Buffer，离心收集细胞（400 x g ，5 min），吸出上清液，去除多余的抗体。
9. 将细胞沉淀重悬于200μlFACS缓冲液中，并将细胞悬浮液转移至FACS管中。在通过流式细胞仪测量之前，将样品保存在冰上和黑暗中（例如，用铝箔覆盖）。
10. 在1小时内通过流式细胞术分析样品。

数据分析

流式细胞术分析
1. 对于流式细胞术分析，收集＆gt;每个样本100,000个事件。
2. 为了分析，事件是在FSC-A和SSC-A双变量细胞仪上进行门控的;从分析中排除包含死细胞和细胞碎片的低FSC-SSC事件。然后在FSC-A和FSC-H上对细胞进行门控以在单个细胞上进行门控。
3. 然后可以将这些细胞作为直方图显示抗体染色的强度。门控群体上抗体染色的荧光强度记录为细胞群的几何平均值，或平均荧光强度（MFI）。＆nbsp;
用于测量TLR4和CD14胞吞作用的数据分析
1. 对于数据分析，“未染色细胞”的MFI可用于从所有样品中减去背景[“背景减去MFI”]。将给定时间点的“背景扣除MFI”值除以“未刺激[t = 0 min]”样本; “t = 0 min”值应为1.00。对所有后续实验样品重复此操作以确定相对于“未刺激的[t = 0分钟]”样品的“表面表达的相对％”。所有样本值反映了在所需时间点受刺激细胞和未受刺激细胞的MFI比率。
2. 我们将“表面表达式的相对百分比”值转换为百分比;因此，“未处理”或“时间= 0分钟”样品应该等于“表面表达的100％百分比”。人们预计在LPS刺激后的不同时间点，该值会稳定下降。
3. 由于MFI值对流式细胞仪校准的变化敏感，我们建议将数据分析限制在每个独立实验中，并且每个条件以技术三份重复进行。 “表面表达的百分比”应该在独立实验中可重复，因此适合于多个实验的统计分析。典型实验的结果如图2所示。原始数据表示和其他信息可在我们的手稿中找到，该手稿最初使用了此处描述的协议 PubMed 。
  
  图2. TLR4和CD14受体内吞作用数据分析和建议的表达。 A.“数据分析”计算描述为公式。 B.在骨髓衍生的巨噬细胞中随时间测量的特征性TLR4和CD14胞吞作用。根据作者的许可，数据在Schappe et al。，2018年的原始演示文稿中进行了修改。
对于实验和统计分析，我们使用GraphPad Prism。为了比较两个实验组，我们使用学生的 t - 测试。为了比较三个或更多数据组，需要其他统计分析，例如单向ANOVA。

笔记

小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系也表现出特征性的TLR4内吞作用 - 它可用于建立方法和实验。
尽管未经处理的培养板可能允许与胰蛋白酶分离，但酶促分离可能会改变质膜上巨噬细胞表位的表达。
执行“程序”步骤4在步入式4°C冷室中大大提高了数据质量。尽管在冰上冷却材料和试剂可能很方便，但冰，样品和环境实验室空气之间的温度变化可能会无意中将样品加热到4°C以上，从而允许内吞作用进行。
虽然“程序”步骤3d之后的程序步骤不在无菌条件下进行，但使用无菌试剂可最大限度地减少无意中污染配体，从而促进TLR4或CD14内吞作用。
虽然可以获得光谱上不重叠的荧光团，但我们建议每次实验用单一的抗TLR4或CD14抗体染色。
通过仔细的光谱考虑，荧光活/死染料可以包括在该测定中以富集活细胞群。如果实验者包括这些染料，我们建议只使用光谱兼容的核酸结合染料，它可以在最终悬浮期间快速标记死细胞。一些活力染料和染色方法（例如“活/死固定染料”或基于膜联蛋白V的染色试剂盒）需要额外的染色步骤，这可能会影响该测定的时间和温度敏感性。
抗体的滴定，包括同一抗体克隆的新批次，是必不可少的。虽然表1中提供了建议，但不正确的染色会限制测定中的信噪比（SNR），并且在灵敏度和一致性方面会降低数据质量。
避免样本组大于24个样本，以便在流式细胞术分析之前最大限度地缩短样本处理时间。
我们的大部分数据都是在BD FACSCanto II流式细胞仪上收集的。

食谱

BMDM媒体
1. RPMI 1640 + 10％FBS + 20％L929条件培养基
2. 在4°C下储存长达1个月
文化传媒
1. RPMI 1640 + 10％FBS
2. 在4°C下储存长达1个月
治疗媒体
1. RPMI 1640 + 10％FBS +1μg/ ml LPS
2. 为每个实验准备新鲜的
FACS缓冲液
1. PBS + 1％BSA
2. 使用前无菌过滤缓冲液通过0.22μm过滤器
3. 在4°C下储存长达1周
L929条件媒体
注意：由L-929细胞培养物（可从ATCC获得）产生。根据供应商的说明传代细胞，并在DMEM，高葡萄糖+ 10％FBS中培养。
1. 为了产生L929条件培养基，向T-150 TripleFlask中加入150ml DMEM，高葡萄糖+ 10％FBS。加入0.72×10 6个 L-929细胞，并通过平衡烧瓶角部孔处的培养基体积小心地混合。在37℃，5％CO 2 培养7天
2. 在第7天，将培养基，无菌过滤器通过0.22μm过滤器收集到烧瓶中，并储存在-20°C [“第1周培养基”];向TripleFlask中加入150毫升DMEM，高葡萄糖+ 10％FBS以替换收集的培养基
3. 在第14天，从烧瓶和无菌过滤器通过0.22μm过滤器[“第2周培养基”]收集培养基。在23°C解冻第1周媒体
4. 将第1周和第2周的培养基和等分试样合并到50ml管中。将L929条件培养基在-20°C下储存长达6个月

致谢

我们要感谢Jonathan Kagan博士（波士顿儿童医院）及其同事，他们的协议（在此引用）我们为我们的研究进行了调整。我们还要感谢Desai实验室的成员协助编辑本手稿。我们还要感谢UVA流式细胞仪核心和卡特免疫中心流式细胞仪核心。我们感谢我们的资助支持这项工作：从美国国立卫生研究院获得GM108989（BND）和5T32GM007055-41（MSS）。
作者声明他们没有利益冲突报告。

参考

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Kagan，J。C.，Su，T.，Horng，T.，Chow，A.，Akira，S。和Medzhitov，R。（2008）。 TRAM将Toll样受体4的内吞作用与干扰素-β的诱导结合起来。 Nat Immunol 9（4）：361-368。
Roy，S.，Karmakar，M。和Pearlman，E。（2014）。 CD14介导Toll样受体4（TLR4）内吞作用和脾酪氨酸激酶（Syk）和干扰素调节转录因子3（IRF3）在上皮细胞中激活并损害中性粒细胞浸润和铜绿假单胞菌在体内杀死。 J Biol Che m 289（2）：1174-1182。
Schappe，MS，Szteyn，K.，Stremska，ME，Mendu，SK，Downs，TK，Seegren，PV，Mahoney，MA，Dixit，S.，Krupa，JK，Stipes，EJ，Rogers，JS，Adamson，SE， Leitinger，N。和Desai，BN（2018）。 Chanzyme TRPM7介导脂多糖诱导的收费所必需的Ca 2 + 流入类似受体4内吞作用和巨噬细胞激活。免疫 48（1）：59-74 e55。
Tan，Y.，Zanoni，I.，Cullen，T.W。，Goodman，A。L.和Kagan，J。C.（2015）。 Toll样受体4内吞作用的机制揭示了致病菌和共生细菌使用的常见免疫逃避策略。我 mmunity 43（5）：909-922。
Zanoni，I.，Ostuni，R.，Marek，L.R.，Barresi，S.，Barbalat，R.，Barton，G.M.，Granucci，F。和Kagan，J。C.（2011）。 CD14控制LPS诱导的Toll样受体4的内吞作用。 Cell 147（4）：868-880。