材料和试剂

移液器吸头
铝箔
玻璃幻灯片
ACLAR ®含氟聚合物薄膜（电子显微镜科学，目录号：50425-10）
玻璃雕刻笔
无菌手术刀片＃11（电子显微镜科学，目录号：72044-11）
铜网（例如，300目）（Sigma-Aldrich，目录号：G4901）
网格存储盒，100容量（电子显微镜科学，目录号：71140）
Parafilm双向拉伸100 mm x 38 m长（TAAB，目录号：P069）
带PE塞的玻璃瓶（Fisher Scientific，目录号：03-339-26C）
制造商：DWK Life Sciences，目录号：KFS60965D2。
玻璃烧杯
Whatman ®定性滤纸，1级（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1001150）
氰基丙烯酸酯强力胶水
多聚甲醛（PB中4％）（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
戊二醛（电子显微镜科学，目录号：16310）
NaH 2 PO 4 ·H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：S9638）
Na 2 HPO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：S2429）
HCl（Sigma-Aldrich，目录号：30721）
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S2770）
四氧化锇溶液（H 2 O中2％）（Sigma-Aldrich，目录号：75633）
注意：
1. 该储备溶液可以用0.2M PB稀释，达到用于对比的最终1％工作浓度。
2. 极毒，只能在经批准的通风橱下操作，穿着适当的防护服，小心轻放;不要丢弃在水槽中;遵守当地有毒废物处理规定。
绝对乙醇（按程序要求用蒸馏水稀释）（默克，目录号：1009831011）
醋酸铀酰（电子显微镜科学，目录号：22400）
环氧丙烷（Sigma-Aldrich，目录号：82320）
注意：极毒，只能在经批准的通风橱下操作，穿着适当的防护服，小心轻放;不要丢弃在水槽中;遵守当地有毒废物处理规定。
Durcupan TM 树脂组（Sigma-Aldrich，目录号：44610）
柠檬酸铅溶液（Leica Ultrostain II，TAAB，Leica Microsystems，目录号：T534 / 2）
注意：
1. 将3％柠檬酸铅溶液预先包装在氦气氛下的真空密封袋中。
2. 有毒，小心处理，使用后收集;遵守当地有毒废物处理规定。
0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）（见食谱）
4％的甲醛溶液和0.2％的戊二醛（见食谱）
Durcupan TM ACM树脂（见食谱）

设备

立体（解剖）显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica S6D）
Vibratome（例如，Leica Biosystems，型号：Leica VT 1000S）
LSE TM 孵化器数字摇床（Corning，目录号：6781-4）
冰箱
通风橱
温控器
Ultramicrotome（Leica Microsystems，Reichert，型号：Reichert Ultracut S）
金刚石刀（硅藻土超45°，宽度至少1.5毫米）
用于截面拾取的完美环路（电子显微镜科学，目录号：70944）
透射电子显微镜，工作电压为80 kV（例如，JEOL，型号：JEM-1011）
圆顶模拟加热板搅拌器（DLAB MS-H-S，DLAB Instruments Ltd.）
镊子适合网格处理
冰柜

软件

NIH ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）
Kaleidagraph（Synergy Software http://www.synergy.com/wordpress_650164087/kaleidagraph/ ）< br />
来自Soft Imaging System（德国明斯特）的AnalySIS

程序

使用大脑立体定位图谱作为指导（例如，Allen Brain Atlas http： //mouse.brain-map.org/static/atlas ）在立体显微镜下切割完整脑区的一般区域，用至少2％PFA和可变比例的戊二醛固定（至少0.1％达到同样多为2％）。继续将立体显微镜下的啮齿动物大脑切成包括海马体在内的半球楔形物。
使用任何类型的氰基丙烯酸酯强力胶将大脑样本安装在vibratome板上（图1）。仅使用一小滴（~50μl）超强力胶，并用塑料移液管尖端涂抹，因此它覆盖与脑块大小相同的区域。只需将大脑块放在胶水覆盖的区域（不要施加压力，也不要让大脑变干！）。一旦组织块在胶合板上，将其快速移动到振动切片机的0.1M PB溶液填充室中。胶水会迅速聚合，并可立即开始切片。

图1.冠状脑半球楔形物安装在带有强力胶的vibratome板上
使用振动切割机切割50-90μm薄的自由浮动部分（参见视频1）。振动切片机的腔室应填充0.1 M PB，因此大脑样本浸没在液体表面下方。振动切片机的设置应根据使用中的实际机器进行优化，并且高度依赖于组织的状况。对于坚固固定的材料，应使用更高的速度和更低的频率。对于弱固定材料，较低的切割速度和较高的频率可能是最佳的。＆nbsp;

视频1
在玻璃瓶中收集自由浮动的部分（使用圆形刷毛刷），并在以下解决方案中将它们在温和移动的振荡器上孵育：
1. 在0.1 M PB，pH 7.4中孵育2 x 5分钟。
2. 在0.1％PB，pH 7.4的1％四氧化锇中孵育1小时（有毒，穿着防护服，在引擎盖下）。
3. 在0.1 M PB，pH 7.4中孵育2 x 5分钟（停止点，样品可以在此步骤中在冰箱中保存过夜）。
4. 在30％乙醇中孵育5分钟。
5. 在50％乙醇中孵育5分钟。
6. 在1％乙酸双氧铀和70％乙醇中孵育30分钟。
  注意：
  1. 该孵育步骤（步骤4f）是光敏感的;用铝箔包裹时，应避免溶液。
  2. 乙酸双氧铀是有毒的。穿防护服，在通风橱下工作，并按照当地法规处理。
7. 在80％乙醇中孵育5分钟。
8. 在95％乙醇中孵育5分钟。
9. 在100％乙醇中孵育2 x 5分钟。
10. 在1：1 100％乙醇/环氧丙烷中孵育5分钟。
11. 在100％环氧丙烷中孵育2 x 5分钟。
12. 在1：1环氧丙烷/树脂中孵育30分钟
13. 在1：3环氧丙烷/树脂中孵育30分钟。
14. 在树脂中孵育2 x 1 h（停止点，样品可以在树脂步骤中在冰箱中保存过夜）。
Waferize：创建一个由5层组成的多层三明治：
1）玻璃载玻片;
2）矩形ACLAR ®薄膜，每个方向比玻璃滑块大1-2mm（可以用Letter或A4尺寸胶片的剪刀手动切割）;
3）渗透的树脂渗透部分可以用一点额外的树脂直接转移到ACLAR ®薄膜上。一旦所有部分都安排在电影上;
4）用另一个ACLAR ®薄膜覆盖它们，与组织样品下面的薄膜大小相同，避免形成气泡;
5）用金刚石点玻璃雕刻笔将样品的名称/ ID刮到覆盖整个“晶圆”的载玻片上，并在适当的恒温箱中在60°C下聚合36-48小时。
固化后，取下上玻片和上ACLAR ®薄膜，用11号手术刀刀片切出感兴趣的区域（图2）。

图2.锇固定和树脂嵌入的脑切片。 A.图像显示锇固定和树脂嵌入的脑切片与海马正确; B.显示CA1（Cornu Ammonis 1）区域的采样区域的图像，其在解剖显微镜下用解剖刀片切出。 DG：齿状回。比例尺= 1 mm。
用超级胶水安装在树脂块上。
用超薄切片机切割50-70纳米薄的超薄切片（图3）。

图3.显示漂浮的50-70 nm超薄CA1切片在DIATOME超45°1.5 mm钻石刀（蓝色）的蒸馏水填充槽中形成色带的图像
借助完美的环路，在例如，300目铜网格上安装部分。请参阅供应商网站上的详细信息（超薄部分的完美循环）
将网格收集到存储箱中。
使用Leica的Ultrostain II柠檬酸铅溶液在Parafilm覆盖的培养皿中制备~50μl液滴，并将这些液滴中的网格孵育1分钟。
通过快速（轻柔地）移动三个连续的dH 2 O填充玻璃小瓶中的网格，消除对比铅溶液的痕迹。
用透射电子显微镜检查切片。

数据分析

数据收集和分析

应使用数码相机（例如，Mega-View-III数码相机和软成像系统（SIS，明斯特，德国））进行电子显微照片的计算机采集。电子显微照片应根据对于给定TEM的设置;一般来说，80 KV应该用于脑组织的最佳对比度。每个块应分析5到10个部分，每个动物可以使用2个块来收集显微照片。每个动物至少50μm 2 可以以伪随机方式选择并以均匀放大率拍摄（例如，最终放大倍数，20,000x，我们的相机和范围设置提供~33μm 2 大小的字段。
突触后树突棘，轴突boutons，多突触boutons（MSB;单个突触前bouton与多个脊柱头形成单独的突触），具有穿孔突触后密度（PSD）的脊柱和线粒体的轮廓可以在电子显微照片上识别（图4）。各种轮廓，例如，脊柱和线粒体轮廓区域，圆形度（4π*面积/周长 2 ;值1.0表示完美圆形，0表示完全扁平形状可以使用NIH提供的引擎测量PSD的长度：ImageJ v1。（Schneider et al。，2012）。必须识别脊柱，终端，线粒体的轮廓，并使用ImageJ的内置引擎手动测量它们的参数（图5）（使用工具'形状描述符'记录这些值）。

图4. CA1海马地层中间syn突触神经毡的代表性电子显微照片，显示假结肠突触后棘（橙色）和来自不同治疗条件（1和2）的小鼠脑材料。箭头指示穿孔的脊柱突触，其在“条件2”的海马中更常见。比例尺=1μm。

图5.使用ImageJ手动测量电子显微照片中的轮廓。面板指示可以选择和测量单个脊柱轮廓的方式（细箭头，黄色轮廓），以及数据如何由Image J的引擎（粗箭头）。
可以使用Kaleidagraph（Synergy Software，Reading，PA，USA）或任何其他类似软件来编译数据。治疗的手段和可能的影响可以通过单因素方差分析和Bonferroni和Tukey的 post-hoc 测试来确定治疗之间的差异，用 P ＆lt; ; 0.05认为有统计学意义。为了消除偏差，应始终盲目地进行数据收集和量化。

食谱

用于1L溶液的磷酸盐缓冲液（0.1 M pH 7.4）
1. 在玻璃烧杯中加入800毫升蒸馏水
2. 向溶液中加入20.209g磷酸氢二钠
3. 向溶液中加入3.394克磷酸二氢钠
4. 最多可装1升
5. 使用HCl或NaOH检查并将溶液调节至最终所需pH
4％甲醛溶液和0.2％戊二醛（1升）
1. 在通风罩中的加热搅拌板上将600ml 0.1M PB加入玻璃烧杯中
2. 在搅拌至约60℃的同时加热。请注意不要让解决方案过热
3. 向加热的PB溶液中加入40g多聚甲醛粉末。粉末会慢慢溶解到溶液中
4. 在搅拌的同时，用移液管缓慢滴加1M NaOH溶液直至溶液澄清
5. 一旦多聚甲醛溶解，冷却溶液并通过滤纸过滤以除去粗颗粒并沉淀
6. 最后，用0.1 M PB将溶液的体积调节至1 L.
7. 储存于4°C，并在使用前立即加入戊二醛。
Durcupan TM ACM树脂
注意：
1. Durcupan TM ACM树脂用于渗透和脱水振动切片的平面嵌入。
2. R 发出四个Durcupan TM 组件（A，B，C和D），组件C应保持冷藏，其余在室温下。
1. 混合10g A和10g B组分。加入0.3克C和0.3克D组分并搅拌，以帮助用磁力搅拌器溶解。搅拌必须彻底和缓慢，以避免气泡积聚。在搅拌的同时盖住混合物以避免过度暴露于水分中
2. 在室温下搅拌30分钟后，让混合物静置1小时。在这段时间之后它就可以使用了。过量的树脂可以保存在冰箱（-18°C）中一周

致谢

作者声明不存在利益冲突。我们感谢TündeMagyar和RenátaPop获得出色的技术支持，帮助进行动物处理，实验和数据收集。该项目得到了欧盟的支持，并由欧洲社会基金共同资助（赠款协议编号EFOP-3.6.2-16-2017-00008;标题：神经炎症在神经变性中的作用：从分子到诊所。 BR还得到了匈牙利科学院JánosBolyai研究奖学金的支持。该协议已经过以下工作的改编和修改：Hazai et al。，2013; Kim et al。，2015年和Babits 等人，2016年。

参考

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Babits，R.，Szoke，B.，Sotonyi，P。和Racz，B。（2016）。食物限制可改变海马突触的超微结构。海马 26 （4）：437-444。
Calverley，R.K。和Jones，D.G。（1987）。测定大鼠新皮质中穿孔突触的数量密度。细胞组织Res 248（2）：399-407。
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Fortin，D.A.，Srivastava，T。和Soderling，T。R.（2012）。突触可塑性期间树突棘的结构调节。神经科学家 18（4）：326-341。
Hazai，D.，Szudoczki，R.，Ding，J.，Soderling，S。H.，Weinberg，R。J.，Sótonyi，P。和Rácz，B。（2013）。肌动蛋白调节因子WAVE-1缺失引起的CA1海马超微结构异常。 < em> PLoS One 8（9）：e75248。
Kim，IH，Rossi，MA，Aryal，DK，Racz，B.，Kim，N.，Uezu，A.，Wang，F.，Wetsel，WC，Weinberg，RJ，Yin，H。和Soderling，SH（2015 ）脊柱修剪通过纹状体多巴胺的电路控制驱动抗精神病敏感的运动。 Nat Neurosci 18（6）：883-891。
Schneider，C.A.，Rasband，W。S.和Eliceiri，K.W。（2012）。 NIH Image to ImageJ：25年的图像分析。 Nat Methods < / em> 9（7）：671-675。
Stewart，J.，Mitchell，J。和Kalant，N。（1989）。终身食物限制对年轻和老年Fischer 344大鼠空间记忆的影响八臂径向和Morris水迷宫。 Neurobiol Aging 10（6）：669-675。