材料和试剂

安全锁管1.5 ml SafeSeal（SARSTEDT，目录号：72.706.400）
Rotilabo ®安全锁管用密封夹（Carl Roth，目录号：N217.1）
安全锁管支架（VWR，目录号：30128-282）
带有原始盖子的96孔微孔板（P型）（Cole-Parmer，目录号：EW-07903-80和EW-07903-86）
移液器吸头
1. 标准提示：20-200μl，100-1,000μl（Mettler-Toledo International，目录号：17001118和17001129）
2. 过滤器提示：20-200μl（Mettler-Toledo International，目录号：17014963）
用于多通道移液器的储液器60 ml（BrandTech Scientific，目录号：703459）
铝箔（可选）
蓝藻/藻类培养
甲醇≥99.9％（Alfa Aesar，目录号：41467.K7）
苯酚（Sigma-Aldrich，目录号：P1037）
氢氧化钾 p.a。（Ing.PetrŠvec - PENTA，目录号：15520-31000）
乙醇96％（默克，目录号：1590102500）
硫酸96％（Ing.PetrŠvec - PENTA，目录号：20370-11000）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
蒸馏/双去离子水
氢氧化钠（Ing.PetrŠvec - PENTA，目录号：15760-31000）
盐酸（Ing.PetrŠvec - PENTA，目录号：19360-11000）
葡萄糖校准系列（见食谱）

设备

移液器
1. 20-200μl（Mettler-Toledo International，目录号：17014391）
2. 100-1,000μl（Mettler-Toledo International，目录号：17014382）
3. 多通道移液器20-200μl（Mettler-Toledo International，目录号：17013805）
冰箱4°C，冷冻室-20°C（LIEBHERR，型号：LCexv 4010，目录号：9005382197172），可选-80°C（Revco TM ExF -86°C立式超低温冰箱，Thermo Fisher Scientific，目录号：EXF24086V）
通风橱（MERCI，型号：M 1500，目录号：2D100110200001）
冷冻离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：Sigma 1-16K，目录号：10030）
真空浓缩器（Eppendorf，型号：Concentrator plus，目录号：5305000100）
分析天平，精确度为10μg（赛多利斯，目录号：SECURA225D-1OBR）
微孔板分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：Multiskan TM GO，目录号：51119300）

程序

收获生物量
1. 收获1ml OD 730 0.1-0.5的蓝藻培养物悬浮液（注1）。
2. 将细胞以15,000 x g 离心，实验室温度5分钟，彻底弃去上清液（图1.1）。
3. 对于长期储存，在进一步分析之前，将样品保持在-80°C并在冰上融化。

从细胞中提取叶绿素和类胡萝卜素（注2）
1. 加入1毫升甲醇，预冷至4°C＆nbsp;
2. 通过轻轻向上和向下移液使样品均匀化。
3. 在颜料定量的情况下，用铝箔覆盖样品。＆nbsp;
4. 通过使样品在4℃在黑暗中静置20分钟从细胞中提取颜料。
5. 将样品在15,000 x g ，4°C下离心5分钟，目测检查颗粒;它应该是蓝色（或紫色），没有绿色。如果颗粒为绿色，则重复步骤B3-B4。
6. 用移液管彻底弃去所有甲醇上清液（图1.2）。保留颗粒以进一步分析总糖或淀粉/糖原。
7. 任选地，根据Zavřel等（2015a），使用分光光度计测量甲醇上清液中叶绿素和类胡萝卜素的浓度。＆nbsp;
8. 对于长期储存，在-80°C下保持没有叶绿素和类胡萝卜素的颗粒，并在进一步分析前在冰上融化。
  
  图1. Synechocystis sp。中总碳水化合物和糖原测定的各个步骤PCC 6803。该方案从细胞收获和离心（1）开始，并将叶绿素a和类胡萝卜素提取到甲醇（2）。对于总糖测定，将沉淀重悬于500μl蒸馏水和500μl5％苯酚（3）中。对于糖原测定，将沉淀重悬于400μl30％KOH（4）中，并将样品在95℃温育60分钟以除去游离葡萄糖。温育后，加入1.2ml预冷的乙醇（5），在-20℃下进行过夜的糖原沉淀。沉淀后，将样品强烈离心60分钟，弃去乙醇，将沉淀（6）在60℃下真空干燥60分钟（7），并将糖原在100μl1NHCl中水解成葡萄糖（8）在95°C。水解后，通过加入100μl1NNaOH（9）中和样品，用300μl蒸馏水（10）稀释并与500μl5％苯酚（11）混合。为了定量游离葡萄糖，根据图2（12）中的方案将8×60μl的每种样品转移到96孔板中，并向每个孔中加入150μl96％硫酸用于生色团建立（13）。用乙醇（6）和干燥（7）强力离心后的细胞沉淀用红色箭头标记。步骤（3）中的样品的蓝色，源自藻胆蛋白，不影响总碳水化合物含量的分光光度定量。

准备样品以测定总细胞糖类
1. 如过程A和B中所述，对细胞进行取样并从细胞中提取叶绿素和类胡萝卜素。
2. 向每个带有细胞沉淀的安全锁管中加入500μl蒸馏水，并用移液管充分混合。
3. 移动到通风橱。
4. 通过将1g苯酚溶解在19ml蒸馏水中制备5％苯酚（w / w）。
5. 将500μl5％苯酚加入每个带有细胞沉淀和500μl蒸馏水的安全锁管中，并用移液管充分混合（图1.3）。
6. 将样品保持在实验室温度15分钟（苯酚将渗透到细胞中）。
7. 根据图2中的方案用移液管将8×60μl的每个样品转移到96孔板中（位置A4-H12，每个样品将具有8个技术重复，图1.12和1.13）。如果评估超过9个样品，请使用额外的96孔板（注3）。
8. 继续执行程序E.
  
  图2.用于测量总糖和淀粉/糖原含量的96孔板的示意组织。前24个孔（A1-H3）指定用于6个葡萄糖校准点（每个校准点）将有4个技术重复），其余72个孔（A4-H12）被指定用于9个样品（每个样品将有8个技术重复）。

准备淀粉/糖原含量测定样品
1. 如过程A和B中所述，对培养物进行取样并从细胞中提取叶绿素和类胡萝卜素。
2. 通过在14ml蒸馏水中稀释6g氢氧化钾制备30％KOH（w / w）。
3. 在冰上解冻细胞沉淀后，向每个带有细胞沉淀的安全锁管中加入400μl30％KOH，并用移液管充分混合。
4. 用密封夹密封安全锁管（注4）。
5. 将样品在95°C孵育90分钟以除去游离葡萄糖和其他碱敏感糖（Evans，1942; Whistler和BeMiller，1958）（图1.4）。
6. 在实验室温度下冷却样品10分钟。
7. 加入预先冷却至4°C的1.2 ml乙醇，用移液管充分混合（图1.5）。
8. 将样品在-20°C下保存过夜（注5）。
9. 将样品在4℃，20,000 x g 下离心60分钟。
10. 弃去乙醇并保留颗粒用于进一步分析（注6，图1.6）。
11. 将剩余的乙醇在真空下在60℃下干燥60分钟（图1.7）。
12. 向干燥的沉淀中加入100μl1NHCl，并用移液管充分混合（图1.8）。
13. 用密封夹密封安全锁管（注4）。
14. 将样品在95℃孵育30分钟以水解淀粉/糖原。
15. 在实验室温度下冷却样品10分钟。
16. 加入100μl1NNaOH并用移液管充分混合以中和1N HCl（图1.9）。
17. 加入300μl蒸馏水，用移液管充分混合（图1.10）。
18. 在实验室温度下以15,000 x g 离心10分钟，并将500μl上清液转移到新的安全锁定管中。丢弃带有颗粒的安全锁管。
19. 移动到通风橱。
20. 用上清液向每个安全锁管中加入500μl5％苯酚，并用移液管充分混合（图1.11）。
21. 将样品保持在实验室温度15分钟（苯酚将与葡萄糖反应）。
22. 根据图1中的方案用移液管将8×60μl的每种样品转移到96孔板中（位置A4-H12，每个样品将具有8个技术重复，图1.12和1.13）。如果评估超过9个样品，请使用额外的96孔板（注3）。

准备葡萄糖校准曲线
1. 根据表1准备6 x500μl葡萄糖校准溶液（D-葡萄糖：25-500μg/ ml -1 ）。
  
  表1.蒸馏水中D-葡萄糖校准系列的制备
2. 移动到通风橱。
3. 用校准溶液向每个管中加入500μl5％苯酚溶液，并用移液管充分混合。
4. 将试管保持在实验室温度15分钟（苯酚会与葡萄糖反应）
5. 根据图1中的方案，用移液管将4 x60μl的每种葡萄糖校准溶液转移至96孔板（位置A1-H3，每个校准点将有4个技术重复）（注3，图1.12和1.13）。

分光光度法测定糖类含量
1. 将20毫升96％的硫酸倒入容器中，用于多通道移液器。
2. 用校准溶液或样品使用多通道移液管向每个孔中加入150μl96％硫酸，并通过上下移液几次混合均匀（注7）。
3. 用塑料盖盖住96孔板。
4. 在实验室温度下孵育样品5分钟（注8）。
5. 用微孔板分光光度计测量碳水化合物浓度：
6. 根据D-葡萄糖校准重新计算碳水化合物的浓度（图3）。
  
  图3.根据该方案在490 nm处测量的D-葡萄糖（溶解在蒸馏水中）与5％苯酚和96％硫酸混合的代表性校准。每个校准点代表4的平均值技术重复，误差线表示标准偏差。虚线表示通过最小二乘法计算的测量点的线性拟合。线性回归方程（y =αx+β）表示校准方程斜率（α）和截距（β）。通过最小二乘法计算R 2 系数。

数据分析

该协议提供每个样品的8个技术重复和每个校准溶液的4个技术重复。为了重现性，强烈建议至少在生物学一式三份中测量每个样品，这些样品应来自独立实验。
为了确定样品中的总碳水化合物和/或淀粉/糖原浓度，490nm处的最终吸光度（A <4> ）应符合分光光度计的线性吸光度范围（注释10）。对于微孔板分光光度计（Multiskan TM GO，Thermo Scientific），该线性吸光度范围为0.1-3.0。每个样品的最终A 490 也应符合校准曲线的范围。对于葡萄糖浓度25-500μg/ ml，如图3所示，该A 490 范围是0.2-2.3。

碳水化合物测定：
从校准数据计算线性回归模型（y =αx+β）的斜率（α）和截距（β）系数（代表性校准曲线如图3所示），并使用这些系数计算每个样品中的碳水化合物浓度并复制根据等式（1）（注11）：

如果使用比1 ml更低或更高体积的藻类/蓝细菌悬浮液（步骤A1），和/或使用比500μl（步骤C2）或300μl更低或更高体积的蒸馏水稀释样品的情况（步骤D17），和/或在添加5％或更高体积的5％苯酚而不是500μl的情况下（步骤C5和D20），根据等式（2）计算最终碳水化合物浓度：

Synechocystis sp。中糖原含量的代表性结果。在广泛的光照强度下培养并在指数生长期采样的PCC 6803如图4所示。

图4.蓝藻Synechocystis sp。中糖原含量的测定PCC 6803。 A.单个96孔板中A 490 的代表性测量（原始数据），遵循图2的方案：A1-H3：六个葡萄糖校准点（25- 500μg/ ml -1 ），A4-H11：8个独立的 Synechocystis 细胞样本，在27.5-1,100μmol光子 m -2 sec -1 。 B. Synechocystis 细胞中的最终糖原含量：空心圆表示来自五个独立实验的平均值，误差条代表标准偏差。 Synechocystis 在平板光生物反应器（Nedbal et al。，2008）中以准连续培养方式在如前所述的生长饱和条件下培养（Zavřel等人。，2015b）。在五个独立的96孔板内测量糖原。仅用水填充的孔（在这种特定情况下不使用的坯料）具有约<4> 的0.06左右。

笔记

分析所需的细胞悬浮液的量可随培养密度而变化。对于 Synechocystis sp的培养物优化1ml的样品体积。 PCC 6803，细胞密度约为1-2×10 7，细胞ml -1 。这种 Synechocystis sp的密集培养物。 PCC 6803每升培养物含有约5-100mg的糖原和总糖。使用稀释培养物，建议收获更大的培养体积。相反，对于致密培养物，建议使用较低的样品体积 - 具有高细胞密度，在甲醇提取后一些色素可以保留在细胞中，这可以影响总糖或淀粉/糖原的分光光度定量。
对于真核藻类，应该省略该步骤，因为通过甲醇进行色素提取而没有机械破坏坚固的细胞壁通常是无效的。对于真核藻类，可以通过在乙醇中过夜孵育细胞沉淀来除去色素，如步骤D7-D10中所述。
如果分析超过9个样品，请对每个96孔板进行校准，以确保校准溶液和样品的相同条件。
用密封夹密封安全锁管是至关重要的，因为如果没有这种处理，在95℃温育期间管将打开并且样品将爆裂。
沉淀的淀粉/糖原可以在-20℃下储存在乙醇中达数月。
沉淀淀粉/糖原颗粒的颜色可以在黄色/棕色和透明之间。如果颗粒是透明的，建议在安全锁管中保留100-200μl乙醇，以避免与乙醇一起丢弃沉淀的淀粉/糖原（步骤D10）。
使用带过滤器的移液器吸头保护移液器免受硫酸气溶胶的影响。 96％硫酸与样品的反应释放出大量的热量。因此，必须缓慢移液以避免从孔中喷出最终混合物。建议使用多通道移液管将苯酚溶液与硫酸混合至少8次，以确保所有技术重复和所有样品的可重复条件。
样品可以孵育长达40分钟而不会显着损失最终的混合物颜色（图5）。

图5.通过A 490 信号的减少测量的D-葡萄糖（溶于蒸馏水），5％苯酚和96％硫酸颜色的反应动力学。虚线表示通过最小二乘法计算的测量点的线性拟合。 A 490 斜率（α）由线性回归方程计算：y =αx。
D-葡萄糖（溶于蒸馏水），5％苯酚和96％硫酸的混合物的吸收最大值为490nm（图6）。

图6.根据本方案制备的D-葡萄糖（溶于蒸馏水），5％苯酚和96％硫酸的混合物的光谱。峰值最大值为490 nm。
如果A 490 （最终碳水化合物浓度）太高而不符合分光光度计的线性吸光度范围，则必须用5％苯酚（和等量蒸馏水）稀释样品在生色团建立之前，即，在步骤F2之前。在生色团建立后（步骤F2之后）稀释样品可导致不正确的分光光度定量糖类含量。
在淀粉浓度评估的情况下，将最终值除以因子0.9，因为淀粉的摩尔质量比（C 6 H 10 O 5 ）和葡萄糖（C 6 H 12 O 6 ）为0.9。对于如图3所示的代表性校准曲线，样品中的碳水化合物浓度计算如下：碳水化合物[μgml -1 ] =（A 490 -0.0727） /0.0045。

食谱

葡萄糖校准系列
1. 将5毫克D-葡萄糖溶于9.995毫升蒸馏水中，制备500微克 -1 D-葡萄糖（w / w）
2. 根据表1，用蒸馏水将500μg/ ml -1 D-葡萄糖溶液稀释到6个安全锁管中

致谢

该方案采用自出版物： Synechocystis sp的表型特征。 PCC 6803亚基显示出对非生物胁迫的敏感性差异（Zavřel et al。，2017）。 T. Z.，J。J.在国家可持续发展计划I（NPU I）中，捷克共和国教育，青年和体育部支持P. O.，拨款号为LO1415。 J.Č。也得到了GAČR的支持，授权号为15-17367S。捷克的系统生物学C4SYS研究基础设施（项目编号LM2015055）支持使用仪器和其他设施。 M. A. S.得到了俄罗斯科学基金会（第14-14-00904号）的资助。作者宣称没有利益冲突。

参考

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