材料和试剂

细胞培养塑料器皿
1. T75和/或T25烧瓶（康宁，目录号：T75为430641U，T25为3056）
2. 板低细胞结合，96孔，圆底（Thermo Fisher Scientific，Nunc TM ，目录号：145399）
3. 离心管（15毫升; 50毫升，Corning，目录号：430790; 430828）
4. Cryovials（STARLAB，目录号：E3110-6122）
5. 塑料条纹（5毫升; 10毫升; 25毫升，Corning，Costar ®，目录号：4487; 4488; 4489）
6. 移液器吸头（TipOne，STARLAB，目录号：S1111-3700; S1111-1706; S1111-6701）
7. 非粘附微量离心管（Eppendorf，目录号：0030108116）
试剂
1. DMEM低葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D6046）
2. 胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10500064）
3. 明胶，Analar（BDH，目录号：440454B）
4. L-谷氨酰胺，200 mM（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
5. MesenPRO RS TM 培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：12746012）
6. PBS，不含钙和镁（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
7. 青霉素 - 链霉素（P / S），10,000单位青霉素和10毫克链霉素/ ml（Sigma-Aldrich，目录号：P0781）
8. 胰蛋白酶/ EDTA 10x（Sigma-Aldrich，目录号：T4174）
9. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
10. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T8154,0.4％[w / v]溶液）
11. 多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
12. 甲醇（Fisher Scientific，CAS：67-56-1）
13. 鱼皮明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G7041）
14. 抗体：
  小鼠抗原纤维蛋白（用于1/200，默克，目录号：MAB1919）
  兔抗纤连蛋白（用于1/200，Sigma-Aldrich，目录号：F3648）
  驴抗小鼠680 nm（用于1/400，LI-COR，目录号：926-68072）
  驴抗兔488 nM（1/500使用，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：R37118）
15. DAPI（1 / 100,000，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：D1306）
16. 明胶溶液（见食谱）
17. MesenPRO RS TM 培养基（参见食谱）
18. DMEM低葡萄糖（见食谱）
19. 胰蛋白酶（见食谱）

设备

水浴，37°C（Grant JB Nova）
CO 2 培养箱（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：Galaxy ® 170 S）
玻璃血细胞计数器（品牌）
层流罩（ENVAIR，型号：Envair Eco Safe Basic Plus）
倒置显微镜（奥林巴斯，型号：CKX31）
Moticam 2300相机耦合到Motic Images Plus 2.0 ML软件（Motic，型号：Moticam 2300）
细胞培养离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：3-16KL）
吸气器（干式真空泵/压缩机，Welch Vacuum - Gardner Denver，型号：2511）
高压灭菌器（Prestige Medical，型号：Classic 2100 Extended，目录号：210004UK）

软件

Motic Images Plus 2.0 ML软件，Motic ®

程序

准备细胞
1. 在烧瓶中培养细胞（细胞可来自冷冻小瓶或来自先前建立的培养物。细胞特性可通过使用特定标记物确认，详见Dominici 等人，，2006或Redondo-Castro et al。，2017）。推荐的初始密度约为2,500个细胞/ cm 2， 2 ，但数量可以调整（取决于供体及其增殖特性）。确保细胞均匀分布并在37℃下在MesenPRO RS TM 培养基（或任何其他合适的MSC培养基）中孵育。
2. 当培养细胞（来自先前的传代亚培养物或来自冷冻的小瓶）并达到70-80％汇合时，它们准备进行传代培养或用于产生球状体。一段通常需要一个星期，但这一次可能会根据捐赠者而改变;来自一些供体的细胞增殖可以与传代之间的三周一样慢。细胞应该使用至第6代，培养基应每3-6天更换一次（生长缓慢的细胞需要较少的培养基更换）。
3. 在水浴（~37℃）中加热明胶溶液，并加入足够的明胶溶液以覆盖烧瓶/孔的整个表面。理想情况下，将它们放在培养箱中过夜（37°C）。吸出明胶并用温热或室温PBS冲洗。涂有明胶的烧瓶和平板可以保存在培养箱中，直到细胞准备好（理想情况下，这一步骤需要在同一天完成，但如果需要，可以在前一天完成。烧瓶可以保存在培养箱中，37℃ C）。
4. 细胞准备好后，吸出培养基并用温PBS洗涤细胞两次。然后加入含有胰蛋白酶的溶液，在PBS中稀释1/10，从10x原液中[胰蛋白酶的最终浓度为0.5％（w / v）]。使用覆盖烧瓶表面所需的最小体积（对于T25通常为1-2 ml或对于T75为5 ml，体积可能不同）。它应该是温暖的，因为胰蛋白酶在37°C时效果最佳。将烧瓶放回培养箱中5分钟，每隔2分钟检查一次，以便细胞分离。＆nbsp;
5. 分离后，将含有细胞和胰蛋白酶的溶液转移到falcon管中。加入体积为DMEM的低倍葡萄糖（含有FBS，检查配方部分.MesenPRO RS TM 培养基可用于此步骤，但DMEM通常更便宜）到烧瓶中，洗掉烧瓶中剩余的细胞（如果加入5ml胰蛋白酶，则加入10ml培养基以终止反应）。将整个体积转移至管中，并以770 x g 离心5分钟。＆nbsp;
6. 弃去上清液，将细胞重悬于1-2ml培养基中。在玻璃血细胞计数器中计数活细胞（使用台盼蓝）并将细胞分成新的培养瓶或播种，如果它们位于正确的通道中则生成球状体（P5-P6）。＆nbsp;
球体形成
1. 将沉淀重悬于MesenPRO RS TM 培养基中（每孔14,000-60,000个细胞[图1C]不需要进一步修改该方案 - 悬浮液体积或孵育天数），并加入50μl细胞悬液至低细胞结合板的每个孔。根据具体要求，可以使用密度的变化。在电镀期间混合和重悬细胞悬浮液可以帮助在整个板上获得更可重复的球体尺寸。
2. 球体将在不到24小时内开始出现（图1A和1D）。播种后几个小时，大多数井应该包含小球状体，这些小球状体将逐渐收敛成一个大的球状体。在培养5天后，通过眼睛可见球状体并且足够稳定以进行实验研究（图2）。来自不同供体的细胞可以更快或更慢地生长（图1A和1B），因此可能需要调整培养时间。如果需要更长时间的培养，或者使用大量细胞，可以通过缓慢移除培养基而不破坏球体来改变培养基。在5-6天内，小剂量（14,000-25,000个细胞）不需要更换培养基。
  
  图1.球状体的形成。：一种。在细胞接种后第1,4和6天，来自2个不同人供体的球状体的面积（对于从Lonza购买的细胞为白点，对于购自3H Biomedical的细胞为黑点）。注意供体之间的尺寸差异，尺寸的逐渐减小和小于0.15mm 2 的所有结构的排除标准（用虚线表示）。 B.同一时间点来自同一捐助者的球状体的平均面积;来自黑色的3H Biomedical捐赠者，灰色的Lonza捐赠者。 C.5天后用14,000和60,000个细胞形成的球状体的代表性图像。比例尺=500μm。 D.体外形成球状体（20,000个细胞）长达6天的时间过程。请注意尺寸减小。比例尺=500μm。
治疗和收集球体
1. 处理可以直接添加到介质中，而无需移动球状体。确保调整体积和浓度。确保您的培养箱中有水以避免蒸发，这可能会导致球体周围介质的最终体积发生变化，从而导致结果不准确。
2. 可以使用塑料移液器吸头（200μl或1 ml尺寸适合）轻松收集上清液，只需注意避免球状体。单独或与上清液一起收集球状体，并使用塑料移液管尖端将其转移到管中（图2）。
  
  图2.使用球状体。从板上方（A）和下方（B）的孔中可以看到球状体（图中5天的球状体，20,000个细胞）。可以用移液管尖端（C）容易地吸出球状体并将其转移到离心管（D）中。球体用箭头表示。作为参考，（A）和（B）的孔来自96孔板。
球状体的免疫染色
1. 将球体转移至含有4％多聚甲醛的含有1％Triton X-100的PBS中的非粘附微量离心管，4°C或过夜，轻轻摇动（此处可使用任何管旋转器，使用~500μl以确保正确固定的球体）。
2. 用PBS中的0.1％Triton X-100洗涤球体，至少两次（约15分钟/洗涤;所有洗涤需要~500μl以确保有效洗涤;不需要离心，等待1分钟然后吸入液体，这样球状体将沉积到管的底部）。
3. 通过在4℃下暴露于增加系列的甲醇（10％，20％，50％，75％和95％）在PBS溶液中脱水15-20分钟（每种浓度~500μl应该足够）。＆NBSP;
4. 将球状体在4％的100％甲醇中孵育4小时或轻轻摇动过夜。＆nbsp;
5. 再水化球状体（涉及相同的甲醇系列减少）。＆nbsp;
6. 通过将3％鱼皮明胶（FSG）中的球状体在0.1％Triton X-100 / PBS溶液中于4℃温育10分钟-1小时至温和摇动过夜来阻断非特异性染色。＆nbsp;
7. 与在0.1％Triton X-100 / PBS + 3％FSG中稀释的一抗孵育，在4℃下轻轻摇动过夜。用户应测试抗体的最佳浓度。我们提供了使用纤连蛋白和原纤蛋白-1的实例，但是通过该方法可以检测其他蛋白质。
8. 在0.1％Triton X-100中洗涤球体三次，每次在室温下洗涤30分钟。＆nbsp;
9. 将球状体与0.1％Triton X-100 / PBS中的二抗孵育3-24小时，在4°C轻轻摇动。此时可以添加DAPI或其他染色步骤。
10. 使用0.1％Triton X-100 / PBS洗涤三次。球状体已准备好成像（例如，通过荧光或共聚焦显微镜，参见图3中的实例）。我们通过使用浸渍共焦透镜对球体进行成像，同时将球体浸没在PBS溶液中，但可以使用不同的方法，并且每个研究人员都需要使这一步适应他们自己的显微镜和资源。
  
  图3.球状体的免疫荧光染色实例免疫染色球体的共聚焦图像（A，比例尺=100μm），以及纤维连接蛋白（B）的更高放大倍数（比例尺=50μm）的细节和原纤维蛋白-1染色（C），以及合并图像（D）。

数据分析

测量球体：可以通过拍摄照片并使用连接到倒置显微镜的相机测量其最大截面积来监测球体生长。明场图像足以实现可靠的测量。所有小于0.15 mm 2 的结构都不被视为球状体，不包括在进一步分析中（图1A和1B）。关于该过程的更多细节可以在（Redondo-Castro 等人，，2018）中找到。
生物测量：上清液可直接用于不同的测定，如ELISA或Western印迹。可以裂解球状体以在分子生物学测定（ELISAs，Western印迹，PCR，等）中使用它们或者用于组织学或免疫细胞化学方案（图4）。
条件培养基：上清液可用作细胞和体内处理的条件培养基。

图4.球体形成和应用。描绘球体形成的主要阶段和一些主要应用的方案。

笔记

来自不同捐赠者的细胞可能表现不同（图1）。在形成球状体之前，一些供体需要更长的传代时间或不同的孵育时间。根据您的捐赠者特征调整时间。
由于细胞包含在少量培养基中，重要的是蒸发不是问题，因为这会影响处理的浓度并因此影响细胞行为。确保您的培养箱托盘始终盛水。使用所有外部孔作为含有PBS和1-2％P / S的额外液体储库是个好主意。
免疫荧光方案可能需要使用者进一步优化，因为一些表位可能比其他表位更易接近（尤其是球状体表面上的表位）。因此，我们建议优化孵育的浓度和时间，以确保正确的目标正确渗透和染色。

食谱

明胶溶液
1. 将明胶（0.1％）溶解在蒸馏水中并对溶液进行高压灭菌
2. 将溶液储存在4°C并在两周内使用
MesenPRO RS TM Medium
1. 解冻MesenPro补充剂（与介质一起出售）并将其加入500毫升瓶中
2. 加入5毫升P / S.
3. 将培养基储存在50ml等分试样中并保持在4℃
4. 在喂食细胞之前加入5毫升新鲜谷氨酰胺（培养基中的谷氨酰胺可持续长达14天）
DMEM低葡萄糖
1. 将50ml FBS和5ml P / S加入500ml瓶中
2. 如果不立即使用，请将介质保存在4°C
3. 添加5毫升新鲜谷氨酰胺，然后将其添加到细胞中（培养基中的谷氨酰胺可持续长达14天）
胰蛋白酶
在使用前将PBS中的胰蛋白酶/ EDTA10x稀释至1x

致谢

这项工作得到了卒中协会（授予TSA 2017/03，英国），工程和物理科学研究委员会（EPSRC，英国），医学研究委员会博士培训中心（MRC）的资助。 -CDT）在再生医学学生资助计划EP / L014904 / 1和曼彻斯特再生医学网络（MaRMN）。
作者贡献声明：所有作者都参与了本协议的编写，编辑和测试。
利益冲突声明：作者声明没有利益冲突或竞争利益。

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