材料和试剂

15毫升锥形管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650）
移液器吸头
1,250μl（USA Scientific，TipOne，目录号：1112-1720）
200μl（USA Scientific，TipOne，目录号：1110-1700）
20μl（USA Scientific，TipOne，目录号：1123-1710）
10μl（USA Scientific，TipOne，目录号：1111-3700）
铝箔（Walmart，551605957）
烧杯（100毫升，WWR，目录号：890000-200）
滤纸（GE Healthcare，目录号：1001-929）
T75烧瓶（康宁，目录号：353824）
六孔组织培养板（Corning，目录号：3506）
细胞提升器（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：08-100-240）
23 G针（BD，Precision Glide，目录号：305193）
微量离心管（Eppendorf，目录号：022600028）
MCF10A乳腺细胞系（ATCC，目录号：CRL-10317）
Caki-1肾癌细胞系（ATCC，目录号：HTB-46）
Protein Ladder（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610375）
PVDF蛋白转移膜（默克，目录号：IPVH08100）
Fibronectin抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-59826）
肌动蛋白抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录号：ab8227）
GAPDH抗体（Abcam，目录编号：ab9484）
生物素标记的纤连蛋白（CYTOSKELETON，目录号：FNR03）
链霉抗生物素蛋白缀合的IRDye ®（LI-COR，目录号：926-32230）
IRDye 800CW二抗（LI-COR，目录号：925-32210）
DMEM / F-12 HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11330057）
胰岛素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：12585014）
EGF（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：PHG0313）
氢化可的松（Corning，目录号：354203）
马血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：16050122）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15140122）
霍乱毒素（Sigma-Aldrich，目录号：C8052-2MG）
脱脂奶粉（赛默飞世尔科技，目录号：LP0031B）
BSA（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP9703100）
McCoy的5A（ATCC，目录号：30-2007）
FBS（Corning，目录号：35-011-CV）
0.05％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25300062）
SDS（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP166-100）
脱氧胆酸钠（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP349-100）
Tris Base（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP152-1）
Tris-HCl（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP153-1）
甘氨酸（Fisher Scientific，Fisher Chemical TM ，目录号：G48-212）
吐温20（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP337-500）
氢氧化钠颗粒（Fisher Scientific，Fisher Chemical TM ，目录号：S318-1）
绝对乙醇（200标准）（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP2818500）
N-乙基马来酰亚胺（赛默飞世尔科技，目录号：23030）
碘乙酸（赛默飞世尔科技，目录号：35603）
DTT（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP172-25）
Bromophenol blue（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP115-25）
硝化纤维素（GE Healthcare，目录号：10600012）
NaCl（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP358-1）
KCl（Fisher Scientific，Fisher Chemical TM ，目录号：P217-3）
Na 2 HPO 4 （MP Biomedicals，目录号：02191440.1）
KH 2 PO 4 （MP Biomedicals，目录号：02195453.1）
100％甲醇（Fisher Scientific，Fisher Chemical TM ，目录号：A935-4）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：A38-212）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（ACROS ORGANICS，目录号：215740050）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：5312-500）
MCF10A细胞的生长培养基（见食谱）
Caki-1细胞的生长培养基（见食谱）
10x PBS（见食谱）
1x PBS（见食谱）
10倍TBS（见食谱）
1x TBS（见食谱）
1x TBS 0.2％吐温（见食谱）
1x SDS运行缓冲液（参见食谱）
1x转移缓冲液（见食谱）
2 M DTT（见食谱）
5倍装载染料（见食谱）
阻塞缓冲液（见食谱）
一抗缓冲液（见食谱）
二抗缓冲液（见食谱）
酸洗（见食谱）
1 M Tris-HCl pH 8.0（参见配方）
1 M Tris-HCl pH 8.8（见食谱）
100 mM苯基甲基磺酰氟（PMSF）（见食谱）
100毫摩尔碘乙酸（见食谱）
100 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）（参见食谱）
0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）pH 8.0（见食谱）
脱氧胆酸盐裂解缓冲液（见食谱）
SDS裂解缓冲液（见食谱）

设备

磁力搅拌器（康宁，目录号：440936）
转子轮（Thermo Fisher Scientific，目录号：88881001）
加热块（Thermo Fisher Scientific，目录号：88870001）
Orbital Shaker（康宁，目录号：6780-FP）
Microcentrifuge（Eppendorf，型号：5424 R，目录号：5404000138）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM Legend T plus，目录号：75004367）
孵化器（PHC，Panasonic，型号：MCO-170AICUVL-PA）
移液管（5ml; 10ml，Fisher Scientific，FisherBrand TM ，目录号：13-676-10C; 13-676-10F）
组织培养罩（Thermo Fisher Scientific，目录号：1333）
高压灭菌器
Odyssey Fc成像系统（LI-COR，型号：2800）
光学显微镜（蔡司，型号：ID03）
冰桶
-20°C冰柜（Fisher Scientific，目录号：13-986-148）
SDS PAGE装置和转移罐（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658029fc）
托盘设置转移（12½“x17½”）

软件

LI-COR Lite（ https://www.licor.com/bio/产品/软件/ image_studio_lite / download.html ）
ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）
微软擅长

程序

MCF10A和Caki-1细胞中FN的脱氧胆酸盐分馏
1. 应保持MCF10A乳腺细胞系或Caki-1肾癌细胞在5％CO 2 缓冲培养箱中的T75组织培养瓶中达到不超过80-90％的汇合。有关快速启动协议，请参阅图1。
2. 一旦细胞在烧瓶中约80％汇合，吸出细胞培养基，用15ml 1x PBS冲洗细胞一次并吸出，然后加入2-3ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA。将烧瓶置于5％CO 2 缓冲培养箱中5-7分钟。
3. 一旦细胞从烧瓶中成功移出，您可以使用光学显微镜检查，向烧瓶中加入3 ml生长培养基以中和胰蛋白酶的作用。
4. 将6ml细胞悬浮液转移到15ml锥形管中，并在室温下以300×g离心5分钟离心。
5. 离心后，弃去上清液并将沉淀重悬于生长培养基中。
6. 对于6孔培养皿中的平板培养，在实验当天将达到80％的汇合处的平板细胞。对于Caki-1细胞，电镀数为100,000个细胞/孔，MCF10A细胞为70,000个细胞/孔。对于每种实验条件，六孔板的一个孔中的细胞足以可视化洗涤剂可溶性和不溶性FN级分。
  注意：80％的细胞密度提供足够的可溶性和不溶性FN蛋白用于定量。如果细胞密度在实验条件下是一个变量，那么80％的密度是理想的，因为细胞不会太融合而不能触发可能干扰实验读数的细胞通路。
7. 将细胞在37℃，5％CO 2 下孵育。
8. 第二天，检查是否达到最佳细胞密度。如果是，可以处理细胞用于FN的脱氧胆酸盐分馏。
  注意：由于整个分馏过程是在冰上进行的，因此在这个阶段重要的是你有冷的1x PBS，冷脱氧胆酸盐裂解缓冲液（新鲜添加的抑制剂）和冷SDS裂解缓冲液（新添加的抑制剂）。请参阅“食谱”部分。
9. 从孔中吸出培养基并将板置于冰桶中的冰上。加入10ml 1x冷PBS以除去细胞中任何痕量的生长培养基并完全吸出。如果在孔中看到痕量的培养基，则用1x PBS再次冲洗。此时重要的是确保吸出所有PBS，以便随后加入裂解缓冲液不被稀释。
10. 向每个孔中加入300μl含有抑制剂的冷（4℃）脱氧胆酸盐裂解缓冲液，并立即用细胞提升器刮擦细胞。
11. 将裂解缓冲液中的所有细胞转移到Eppendorf管中，并使用23G注射器针头溶解至少20次。
12. 将管放在冷室中的转子轮上，并旋转30分钟。转子速度对于裂解并不重要。此时裂解时间可延长至1小时而不影响结果（可选）。
13. 将Eppendorf管转移至微量离心机并在21,130 x g 下在4℃下离心30分钟。如果微量离心机的最大速度为15,871 x g ，则可以将离心时间增加到45分钟。
14. 检查是否发现了针头大小的颗粒。颗粒通常很难看到，有时需要第二轮离心。
  注意：将Eppendorf管放入微量离心机中并标记颗粒将沉淀在其中的管帽也是一个好主意。这样可以更容易地知道在哪里寻找颗粒。
15. 将上清液转移到新的Eppendorf管中并将其标记为“可溶性FN”。该蛋白质级分含有可溶于洗涤剂的FN。向可溶性FN级分中加入5x SDS上样染料并储存在-20℃冰箱中直至准备好在凝胶上分离蛋白质。
16. 向沉淀中加入含有抑制剂的20μl冷SDS裂解缓冲液，并使用移液管尖端将沉淀物与缓冲液混合。
17. 将沉淀加热至95℃1分钟，使沉淀与SDS裂解缓冲液完全混合。该蛋白质部分含有脱氧胆酸盐'不溶性FN'。
  注意：用SDS裂解缓冲液加热沉淀1分钟是完全重悬颗粒的必要步骤。
18. 加入5x SDS上样染料，混合并储存在-20°C冰箱中。＆nbsp;
19. 在将可溶性FN和'不溶性FN'样品加载到SDS-PAGE凝胶上之前，将样品加热至95℃5分钟，并在室温下以21,130 x g 离心1分钟。
  
  图1.提取和分离两种FN级分的流程图
生物素化测定法测量MCF10A细胞中回收的FN
1. 如步骤A所述，在相同条件下接种MCF10A细胞，并在5％CO 2 缓冲培养箱中孵育。
2. 用10μl无菌蒸馏水重新配制一小瓶冻干的FN-生物素，并使管在室温下静置几分钟，然后将管轻敲几次以混合。现在浓度为2毫克/毫升。
3. 将20μl储备溶液加入2ml无血清培养基中，使工作浓度为20μg/ ml FN-生物素培养基。要制备含有工作浓度为20μg/ ml FN-生物素的2 ml无血清培养基，您需要总共两瓶冻干的FN-生物素。在我们的手中，将工作浓度降低至10μg/ ml证明不足以使用免疫印迹确定MCF10A细胞对FN的摄取。
4. 在开始生物素化测定之前，血清使细胞饥饿2小时。通过从细胞中吸出生长培养基，用2ml 1x PBS洗涤细胞两次并向细胞中加入无血清培养基来进行血清饥饿。
5. 孵育2小时后，从细胞中吸出无血清培养基，用2ml 1x PBS洗涤6孔板中的细胞，每次2ml，完全吸出PBS，并向细胞中加入500μlFN-生物素培养基。
6. 在37°C培养箱中孵育30分钟。
7. 孵育后，吸出FN-生物素培养基，用2ml 1x PBS洗涤，吸出并加入1ml酸洗液（见食谱）30秒。酸洗步骤对于去除细胞表面结合的FN-生物素是至关重要的。重要的是不要超过酸洗超过1分钟，因为它开始影响细胞形态。
8. 取出酸洗液，用2 ml 1x PBS冲洗孔四次。
9. 根据您的实验问题，吸出PBS并在没有FN-生物素和有或没有测试化合物的情况下向细胞中添加生长培养基。由于我们有兴趣研究TGFβ1和TGFβ2是否通过循环增加FN原纤维形成，我们只有生长培养基，含有10 ng /mlTGFβ1的生长培养基和含有10 ng /mlTGFβ2的生长培养基的对照条件（Varadaraj et al 。，2017）。
10. 为了确定FN是否被再循环形成原纤维，按照程序A，步骤8-17中所述进行脱氧胆酸盐分级分离，每孔使用300μl脱氧胆酸盐裂解缓冲液。
在5％凝胶上解析FN蛋白并进行免疫印迹
1. 在5％SDS-PAGE凝胶上运行可溶性和沉淀裂解物。
2. 加载可溶部分总体积的1/10 th 和颗粒部分的总体积。如果加载1/10 th ，请保持所有实验条件的体积一致。
3. 让凝胶运行直到只有蛋白质梯子的顶部两个梯子保留在凝胶-250kDa和150kDa内。凝胶运行通常需要3-4小时，电压为80 V.
4. 运行完成后，使用硝酸纤维素膜或PVDF膜在25V下在冷室中转移凝胶过夜（12-16h）。或者，转移罐可以在转移过程中放置在冰桶中。
5. 转移完成后，将膜置于免疫印迹盒中，并在室温下加入5ml封闭缓冲液（足以覆盖膜的体积）1小时，并置于55rpm的轨道振荡器上。
6. 封闭后，取出封闭溶液，用1x TBS洗涤膜2-3次，轻轻搅拌。确保所有牛奶痕迹都留下了膜。冲洗直至TBS洗涤清洁。
7. 在第一抗体缓冲液中以1：1,000稀释度添加FN抗体，并使膜在轨道振荡器上以55rpm的速度在4℃下孵育过夜。
8. 在一抗孵育后，通过将膜置于10转1x TBS 0.2％Tween中以55rpm的速度设置的定轨振荡器上冲洗3次。
9. 在设定为55rpm的定轨振荡器上，以1μl稀释度在15ml二抗缓冲液中加入IR Dye 800CW二抗1小时。保护膜免受光照很重要。如果免疫印迹盒是透明的，则在整个孵育和随后的洗涤步骤中用铝箔覆盖盒子。
10. 为了使FN-生物素可视化，进行步骤C1-C6，然后在15ml二级抗体缓冲液中以1μl的稀释度在轨道振荡器上以55rpm的速度添加链霉抗生物素蛋白缀合的IR染料二抗1小时。保护膜免受光照很重要。如果免疫印迹盒是透明的，则在整个孵育和随后的洗涤步骤中用铝箔覆盖盒子。
11. 在抗体孵育后，通过将膜置于10转1x TBS 0.2％Tween中以55rpm的速度设定的轨道振荡器上冲洗3次。
12. 在LI-COR扫描仪上成像之前，取出1x TBS 0.2％吐温并更换为10 ml 1x TBS。
13. ＆nbsp;膜的图像扫描将如图2A所示。
14. 为了探测上样对照蛋白，在10％凝胶上运行1/10 th 的可溶性FN级分，并对GAPDH（图2B）或肌动蛋白进行免疫印迹。肌动蛋白和GAPDH一抗在5 ml（1μg/ 5 ml）中以1μl的稀释度使用，如果稀释的抗体在4°C下储存，可以重复使用几次。
  注意：HRP偶联的二抗也可以使用ECL检测方法进行处理和处理。在这种情况下，您需要HRP共轭链霉抗生物素蛋白二抗。
  
  图2.纤连蛋白分级分离和免疫印迹分析。为了可视化和定量可溶性和沉淀FN，在5％SDS-PAGE凝胶上加载来自Caki-1细胞的可溶性和全部沉淀级分的1/10 ，如（A）中所示。高于250 kDa MW梯的频段是FN。 UN，1,2和3指的是“未经处理”和三种不同的处理条件（B）。为了标准化蛋白质加载，在10％SDS-PAGE凝胶上加载1/10 th 的可溶性FN，并对GAPDH进行免疫印迹。使用LI-COR Lite软件通过在带周围绘制矩形（蓝色框）来量化蛋白质条带的像素强度。较低的值表示背景校正的带强度，较高的值表示背景。

数据分析

通常，脱氧胆酸盐提取和生物素化测定至少独立地测试三次以获得统计学上显着的结果。为了量化原纤维中的FN（沉淀部分）与非原纤维（可溶性FN）部分相比，需要解析的FN和GAPDH的免疫印迹。按照以下逐步的要点进行样品的数据分析。

使用LI-COR Lite软件，单独量化所有蛋白质条带并导出至excel表。
如果实验问题是测试FN原纤维是否随治疗而增加，则计算可溶性FN的像素强度至相应的GAPDH或肌动蛋白水平。
在归一化可溶性FN水平后，计算颗粒FN像素强度与标准化可溶性FN水平的比率。在图2A中，UN中的可溶性FN（未处理）和处理条件1,2和3分别归一化为UN中的GAPDH，1,2和3。
计算UN，1,2和3中颗粒FN的像素强度。
最后计算UN颗粒FN与标准化UN可溶性FN，样品1颗粒FN与标准化样品1可溶性FN等的比率。
要将分析数据表示为出版物中的图形，请将比率转换为折叠差异/相对差异，创建UN和处理样本之间折叠差异的条形图，UN样本为“1”，计算SEM并执行适当的统计（参见Varadaraj et al。，2017年的图4E）。＆nbsp;

如果数据清楚地表明颗粒FN随着处理X的增加而增加，那么可溶性和颗粒FN都可能增加，在这种情况下，您可能错误地推断出只有颗粒FN正在增加。为了检查是否是这种情况，必须进行相同的实验，但提取总蛋白质而不是脱氧胆酸盐部分。如果治疗之间的总FN水平保持不变，那么您可以得出结论，只有原纤维部分随治疗而变化。或者，如果总FN蛋白质随处理而增加，则颗粒FN的增加可能是由于总蛋白质的增加，而不是处理之间颗粒FN部分的差异。我们的研究（参见Varadaraj et al。，2017中的图1C）显示TGFβ1和TGFβ2增加FN原纤维分数，我们在平行实验中测量总FN水平进行分级实验以确认FN原纤维分数增加治疗。

食谱

MCF10A细胞的生长培养基
1. 至500毫升DMEM / F12培养基：
  从4 mg / ml胰岛素原液中加入25 ml马血清，1.25 ml胰岛素，来自150μg/ ml原液的350μl霍乱毒素，来自50μg/ ml原液的215μlEGF和来自500μg的500μl氢化可的松/ ml库存
2. 制作霍乱毒素的储备液：
  将2mg霍乱毒素溶于13.3ml DMEM / F12（不含添加剂）中，并在-20℃冰箱中以350μl等分试样储存。我们使用了等分的霍乱毒素，储存时间不超过6个月
3. 制作EGF原液：
  将1 mg冻干的EGF溶于20 ml无菌dH 2 O中，并在-20°C冰箱中以215μl等分试样储存
4. 制作氢化可的松原液：
  将50毫克氢化可的松溶于100毫升200标准乙醇中，并在-20°C冰箱中以10毫升等分试样储存
Caki-1细胞的生长培养基
向500毫升McCoy的5A培养基中加入50毫升FBS和5毫升青霉素 - 链霉素（可选）

*注意：这些缓冲区可以在室温下存储。
10x PBS（1升）*
称取80g NaCl，2g KCl，14.4g Na 2 HPO 4 ，2.4g KH 2 PO 4 加入500ml无菌dH 2 O并用HCl调节pH至pH7.2至7.4
使用无菌dH 2 O将最终体积补足至1L
1x PBS（1升）*
用900ml无菌dH 2 O稀释100ml 10x PBS 10x TBS（1L）*
1. 称取87.66g NaCl，12.11g Tris碱，加入500ml无菌dH 2 O
2. 使用HCl将pH调节至pH 8.0，并使用无菌dH 2 O将最终体积补足至1L
1x TBS（1升）*
用9份无菌dH 2 O稀释1份10x TBS
1x TBS 0.2％吐温（1升）*
将2ml Tween 20加入1x TBS中
1x SDS运行缓冲液（10 L）*
1. 加入303g Tris碱，1,440g甘氨酸和100g SDS
2. 使用无菌dH 2 O补足总体积10L
1x转移缓冲液（1 L）
加入1.86克甘氨酸，3.02克Tris碱，150毫升100％甲醇，加入总体积1升，dH 2 O
注意：传输缓冲区可以存储在4°C。
2 M DTT
在10毫升无菌dH 2 O中称取3.08克DTT（FW 154.25）。分装并储存在-20°C冰箱中
5倍装载染料
1. 使总体积为100毫升的染料：
  1. 向烧杯，10g SDS，33ml 1M Tris pH 6.8和17ml水中加入50ml甘油
  2. 通过置于设定在37℃的磁力搅拌器使溶液混合，使SDS完全溶解
  3. 使用移液管尖端挑取少量溴酚蓝粉末并混合到溶液中
2. 向90ml该溶液中加入10ml 2M DTT
3. 在-20°C冰箱中以2 ml等分试样储存
阻塞缓冲区
称取0.25克脱脂奶粉，溶于1x TBS中每次使用准备10毫升新鲜
一抗缓冲液
称取0.05 g BSA并溶解于1x TBS中每次使用准备10毫升新鲜
二抗缓冲液
称取0.05g BSA并溶于1x TBS 0.2％Tween中每次使用准备10毫升新鲜
酸洗
称取14.6 g NaCl并加入2.5 ml冰醋酸
用无菌dH 2 O稀释至500 ml并在室温下储存
1 M Tris-HCl pH 8.0（1 L）*
1. 称取157.6g Tris-HCl盐并溶于900ml无菌dH 2 O中
2. 盐溶解后，使用NaOH调节pH至pH 8.0并加水至总共1升
1 M Tris-HCl pH 8.8（1 L）*
1. 称取157.6g Tris-HCl盐并溶于900ml无菌dH 2 O中
2. 盐溶解后，使用NaOH调节pH至pH8.8并加水至总共1L
100mM苯基甲基磺酰氟（PMSF）
在10ml乙醇中称取0.174g，得到100mM储备溶液（FW 174.2）分装并储存在-20°C冰箱中
100 mM碘乙酸
在10ml无菌dH 2 O中称取0.185g，得到100mM原液（FW 185.95）
分装并储存在-20°C冰箱中
100mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）
在10ml乙醇中称取0.125g，得到100mM储备溶液（FW 125.13）分装并储存在-20°C冰箱中
0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）pH 8.0（FW 292.24）（0.5 L）*
1. 称重73.06g并加入400ml无菌dH 2 O.
2. 让盐溶解并将pH调节至8.0
3. 加水使最终体积达到500毫升
脱氧胆酸盐裂解缓冲液（0.1 L）
2％脱氧胆酸钠
0.02 M Tris-HCl pH 8.8
2 mM PMSF
2 mM EDTA
2 mM碘乙酸
2mM N-乙基马来酰胺
1. 制作100毫升缓冲液：
  加入2克脱氧胆酸钠盐，2毫升1M Tris-HCl pH 8.8和剩余的无菌dH 2 O至总体积100毫升
  注意：此缓冲液可以存放在冰箱中不超过3个月。
2. 用抑制剂制备10毫升这种缓冲液：
  加入20μl100mM PMSF原液，40μl0.5M EDTA原液，20μlIldoaceticacid（100 mM原液）和20μlNEM（100 mM原液）
  注意：使用前应先添加抑制剂，最终浓度为2 mM PMSF，2 mM EDTA pH 8.0,2 mM碘乙酸和2 mM NEM。
SDS裂解缓冲液（0.1 L）*
1. 制作100毫升缓冲液：
  加入1 g SDS和2.5 ml 1M Tris-HCl pH 8.0，加水至100 ml
2. 对于10ml SDS裂解缓冲液：
  加入20μl100mM PMSF原液，40μl0.5M EDTA原液，20μlIldoaceticacid（100 mM原液）和20μlNEM（100 mM原液）
  注意：使用前应先添加抑制剂，最终浓度为2 mM PMSF，2 mM EDTA pH 8.0,2 mM碘乙酸和2 mM NEM。

致谢

本出版物中报告的研究部分由美国国立卫生研究院少数民族健康与卫生差异国家研究所授予，奖项编号为U54MD012388，美国国立卫生研究院国家癌症研究所颁发美国原住民癌症预防合作奖U54CA143924 （UACC）和U54CA143925（NAU）向AV和国立卫生研究院授予P20 GM109091至KM内容完全由作者负责，并不一定代表国立卫生研究院的官方观点。我们还要感谢Jean Schwarzbauer（普林斯顿大学）和Donaldson，J.G（国立卫生研究院）帮助制定研究方案的工作。
作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Arjonen，A.，Alanko，J.，Veltel，S。和Ivaska，J。（2012）。有效和无效β1整合素的独特回收。流量 13（4）：610-625。
Caswell，P.T.，Chan，M.，Lindsay，A.J。，McCaffrey，M.W。，Boettiger，D。和Norman，J.C。（2008）。 Rab偶联蛋白协调α5β1整合素和EGFR1的循环，促进3D微环境中的细胞迁移。 J Cell Biol 183（1）：143-155。
Gao，B.，Curtis，T.M.，Blumenstock，F.A.，Minnear，F.L。和Saba，T.M。（2000）。增加肺内皮细胞对α5β1整合素的循环，以应对肿瘤坏死因子。 J Cell Sci 113 Pt 2：247-257。
Hoffman，M.A.，Ohh，M.，Yang，H.，Klco，J.M.，Ivan，M。和Kaelin，W。G.，Jr。（2001）。与2C型VHL疾病相关的von Hippel-Lindau蛋白突变体保留了下调HIF的能力。 Hum Mol Genet 10（10）：1019-1027。
Mao，Y。和Schwarzbauer，J。E.（2005）。纤连蛋白原纤维形成，细胞介导的基质组装过程。 Matrix Biol < / em> 24（6）：389-399。
Mimura，Y.，Ihn，H.，Jinnin，M.，Asano，Y.，Yamane，K。和Tamaki，K。（2004）。表皮生长因子通过蛋白激酶C delta信号通路诱导人皮肤成纤维细胞中纤维连接蛋白的表达。 J Invest Dermatol 122（6）：1390-1398。
Ohh，M.，Yauch，RL，Lonergan，KM，Whaley，JM，Stemmer-Rachamimov，AO，Louis，DN，Gavin，BJ，Kley，N.，Kaelin，WG，Jr。和Iliopoulos，O。（1998）。 von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白是正确组装细胞外纤连蛋白基质所必需的。 Mol Cell 1（7）：959-968。＆nbsp;
Pankov，R.，Cukierman，E.，Katz，B.Z.，Matsumoto，K.，Lin，D.C.，Lin，S.，Hahn，C.and Yamada，K.M。（2000）。整合素动力学和基质组装：α5β1整合素的张力依赖性易位促进早期纤维连接蛋白原纤维形成。 J Cell Biol 148（5）：1075-1090。
Pasqualini，R.，Bourdoulous，S.，Koivunen，E.，Woods，VL，Jr。和Ruoslahti，E。（1996）。聚合形式的纤连蛋白对多种肿瘤类型具有抗转移作用。 Nat Med 2（11）：1197-1203。

Roberts，M.，Barry，S.，Woods，A.，van der Sluijs，P。和Norman，J。（2001）。 PDGF调节的rab4依赖性回收早期内体中的αvβ3整合素是细胞粘附和扩散所必需的。 Curr Biol 11（18）：1392-1402。＆nbsp;

Stickle，N.H.，Chung，J.，Klco，J.M.，Hill，R.P.，Kaelin，W.G.，Jr。和Ohh，M。（2004）。 NEDD8的pVHL修饰是纤连蛋白基质组装和抑制肿瘤发展所必需的。 Mol Cell Biol 24（8）：3251-3261。

Tang，C.H.，Yang，R。S.，Chen，Y.F。和Fu，W。M.（2007）。碱性成纤维细胞生长因子通过磷脂酶Cγ，蛋白激酶Cα，c-Src刺激纤连蛋白的表达， NF-κB和成骨细胞中的p300途径。 J Cell Physiol 211（1）：45-55。

Uitto，J.，Olsen，D。R.和Fazio，M。J.（1989）。皮肤细胞外基质：50年的进展。 J Invest Dermatol 92（4 Suppl）：61S-77S。

Varadaraj，A.，Jenkins，LM，Singh，P.，Chanda，A.，Snider，J.，Lee，NY，Amsalem-Zafran，AR，Ehrlich，M.，Henis，YI和Mythreye，K。（2017）。 TGF-β通过新的TbetaRII依赖性纤连蛋白 - 运输机制触发快速原纤维形成。 Mol Biol Cell 28（9）：1195-1207。

White，D。P.，Caswell，P。T.和Norman，J。C.（2007）。 αvβ3和α5β1整合素循环途径决定下游Rho激酶信号传导，以调节持续性细胞迁移。 J Cell Biol 177（3）：515-525。

Yang，J。T.和Hynes，R。O.（1996）。缺乏α5β1整合素的胚胎细胞中的纤连蛋白受体功能可被αV整联蛋白取代。 Mol Biol Cell 7（11）：1737-1748。

Yi，M。和Ruoslahti，E。（2001）。纤连蛋白片段抑制肿瘤生长，血管生成和转移。 Proc Natl Acad Sci USA 98（2）：620-624。

Yokoi，H.，Mukoyama，M.，Sugawara，A.，Mori，K.，Nagae，T.，Makino，H.，Suganami，T.，Yahata，K.，Fujinaga，Y.，Tanaka，I。and Nakao，K。（2002）。结缔组织生长因子在纤连蛋白表达和肾小管间质纤维化中的作用。 Am J Physiol Renal Physiol 282（5）：F933-942。