材料和试剂

50毫升Falcon ®管（Corning，目录号：352098）
无菌塑料培养皿，90毫米（Dominique DUTSCHER，Gosselin，目录号：688302）＆nbsp;
无菌塑料培养皿，35毫米（Corning，Falcon ®，目录号：351008）
镍铬合金线，不锈钢，圆形，22规格，直径0.64 mm（电子烟供应商）
铝制螺帽，40毫米带橡胶衬垫（VWR，SPV，目录号：215-2690）＆nbsp;
用于厨房或浴室的多功能硅胶，280毫升（Castorama，Rubson）
60毫升Luer-lock注射器（B. Braun Melsungen，Omnifix ®，目录号：4613503F）
Teflon TM PTFE微管，内径（int）和外径（ext）直径分别为1.15 mm和1.75 mm（Dominique DUTSCHER，PTFE，目录号：091932）
针18 G 0.9 x 40 mm（Dominique DUTSCHER，BD Microlance TM 3，目录号：301300）
油管，直径1.14 mm（Dominique DUTSCHER，Silicone，目录号：4906591）
油管，直径3.17 mm（Dominique DUTSCHER，Silicone，目录号：4906600）
油管，直径2.79 mm（Gilson，PVC，目录号：F117948）
Microtubes，1.5 ml（Dominique DUTSCHER，Eppendorf，目录号：033511）
直带倒刺连接器（Cole-Parmer，目录号：EW-50621-95）
Valve Luer聚碳酸酯单向（Cole-Parmer，目录号：EW-30600-01）
用于空气的无菌注射器过滤器，0.2μm，6.4 cm直径（Labomoderne，Midisart，目录号：RS3320）
可高压灭菌的聚丙烯袋，3 L，非印刷（Dominique DUTSCHER，Gosselin，目录号：140230）
提示1,200μl用于移液管（Dominique DUTSCHER，Sartorius，目录号：077200B）＆nbsp;
自制注射器支架
用于曝气的自制针座
折叠裙边帽，直径14.9毫米（Dominique DUTSCHER，Saint Gobain，目录号：110602）
灭菌用纸（Dominique DUTSCHER，目录号：006950）
手术刀片无菌No 21（Dominique DUTSCHER，目录号：132521）＆nbsp;
带有灯丝的硼硅酸盐玻璃毛细管，易于填充，外径1.5 mm，内径0.86 mm（哈佛电器，目录号：30-0057）
用于体外研究的10mm直径NMR管（Norell，目录号：1008-UP-8）
用于体内研究的特殊自制NMR管（见图1）
硅胶膜
Hebeloma cylindrosporum （ectomycorrhizal basidiomycete）（实验室自己的系列，可根据要求提供）
Pinus pinaster
Zea mays
浓缩（30％）过氧化氢（H 2 O 2 ）溶液（Sigma-Aldrich，目录号：216763-500ML-M）
液氮（液化空气）
硫酸钙二水合物（CaSO 4 •2H 2 O）（默克，目录号：102161）
盐酸硫胺素-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T4625-10G）
硫酸锰（II）一水合物（MnSO 4 •H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M7899-500G）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4 •7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：Z0251-100G）
硼酸（H 3 BO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：B6768-500G）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4 •5H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C8027-500G）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4 •2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1651-100G）
硝酸钾（KNO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P8291-1KG）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 •H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：71504-250G-M）
硫酸镁七水合物（MgSO 4 •7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：63138-250G）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333-500G）
氯化钙二水合物（CaCl 2 •2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080-500G）
柠檬酸铁铵（Sigma-Aldrich，目录号：RES20400-A702X）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270-1KG）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7002-500G）
MES（2-N-吗啉代 - 乙磺酸，4-吗啉基甲磺酸一水合物）（Sigma-Aldrich，目录号：69892-500G）
三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）（Sigma-Aldrich，目录号：T1378-500G）
亚甲基二膦酸（MDP）（Sigma-Aldrich，目录号：M9508-5G）
1 N硫酸溶液（Merck，目录号：109072）
高氯酸70％（HClO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：311421-250ML）
偏钒酸钠（NaVO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：590088-25G）
碳酸氢钾（KHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：60339-500G）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758-500G）
氢氧化钾1 N（KOH）（默克，目录号：105029）
4-吗啉丙磺酸（MOPS）（Sigma-Aldrich，目录号：M1254-250G）
叠氮化钠（NaN 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S2002-100G）
氧化氘（D 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：151882-100G）
微量元素（见食谱）
矿物盐基础解决方案（见食谱）
硫胺素溶液（见食谱）
N6完全液体溶液（见食谱）
固体N6全液体溶液（见食谱）
交互媒介（IM）（见食谱）

设备

样品瓶，120 ml（VWR，SPV，目录号：SPVAGO2246）
玻璃瓶，1,000毫升，ISO硼硅酸盐，毕业（Dominique DUTSCHER，目录号：046415）＆nbsp;
玻璃瓶，2,000毫升，ISO硼硅酸盐，毕业（Dominique DUTSCHER，目录号：046416）＆nbsp;
玻璃缸（直径7毫米）
刻度硼硅酸盐玻璃烧杯1,000 ml（Dominique DUTSCHER，目录号：068942）
聚丙烯经济型烧杯3,000，带模压刻度（Dominique DUTSCHER，目录号：391134）
两对不锈钢直镊子Wironit，Brucelles型，130毫米（Dominique DUTSCHER，目录号：491037）＆nbsp;
刀片20至25的手术刀手柄（Dominique DUTSCHER，目录号：3740004）
独立式燃烧器（Dominique DUTSCHER，目录号：071109）
用于燃烧器的丁烷气筒（Dominique DUTSCHER，目录号：060415）
钉子，锤子，剪刀和剪钳
温度控制在25°C的培养箱＆nbsp;
高压灭菌器
层流柜
直径7.5毫米的软木钻孔机（Dominique DUTSCHER，目录号：942783）
高压O 2 气瓶（空气产品）
离心机5804 R，冷藏，无转子，（Eppendorf，型号：5804 R，目录号：5805000017）
转子F-34-6-38，适用于6×85毫升管，含转子盖（Eppendorf，目录号：5804727002）
50毫升Falcon管适配器（Dominique DUTSCHER，目录号：033252）
蠕动泵（Gilson Minipuls3）＆nbsp;
Varian UNITY INOVA 500 MHz核磁共振谱仪，配备10 mm宽带探头，工作频率为202.4 MHz， 31 P

软件

用于计算的Microsoft Excel
Statistica 7.1（StatSoft Inc.，Tulsa，OK，USA）用于统计分析
用于处理 31 P-NMR谱的VnmrJ和ACDlabs

程序

真菌和植物培养物的制备以及随后的植物真菌培养
1. Hebeloma cylindrosporum 的培养条件根据先前在 Bio-protocol （Becquer 等人，2017a）中描述的程序，将菌丝体在玻璃罐中培养。
2. Pinus pinaster 的培养条件
  种子消毒，发芽和培养条件的程序先前已在 Bio-protocol 中进行了描述（Becquer et al。，2017b）。
3. Zea mays的培养条件
  1. 用6％H 2 O 2 溶液对玉米种子（ Zea mays L.）表面进行灭菌30分钟，然后用无菌冲洗蒸馏水。＆nbsp;
  2. 为了发芽，将种子放在预先用去离子无菌水润湿的两张无菌滤纸之间。在30°C下在黑暗中孵育6天以进行发芽。＆nbsp;
  3. 将幼苗转移到装有0.2mM CaSO 4 溶液（35ml /管）的试管中，在生长室中，在16/8 h光/暗循环，25°C /空气中的20℃，80％/ 100％RH，CO 2 体积分数为350×10 -6 且光合有效辐射为400μmolm - 2 sec -1 （400-700 nm）。＆nbsp;
  4. 然后，将试管置于流动层流柜下，用每个试管中35ml相互作用介质（见配方6）代替CaSO 4 溶液。将试管放回生长室中，使其适应24小时。
4. 为了研究引起真菌菌丝体特异性反应的植物根部信号，遵循先前在Becquer 等中描述的孵育程序。（2017b）。
用于体内 NMR研究的真菌样品制备
1. 设备准备
  1. 带有钩子的木制扦子，在其末端用镍铬合金丝制成。
  2. 用于参考NMR光谱（16.38ppm）化学位移的玻璃毛细管，填充50mM亚甲基二膦酸盐（MDP）在30mM Tris缓冲液（pH8.9）中的溶液（参见视频1如何制备毛细管）。 />
    
    视频1.使用MDP解决方案制作化学位移参考
  3. 一种特殊的自制核磁共振管，由3部分组成（见图1和视频2）
    1. 外部NMR管（直径10mm）。
    2. 内部玻璃圆筒（直径7毫米），可拧在外管上。
    3. 在该装置顶部的塑料盖，其被钻孔以允许3个特氟隆管将NMR管连接到蠕动泵，从而允许氧合的相互作用介质循环。入口管延伸到NMR管的底部。输出管延伸到NMR管中的菌丝体顶部。安全输出管的末端位于菌丝体上方3厘米处。
    该装置附有一根绳子，可以在不使用气升系统的情况下手动将其引入核磁共振谱仪磁铁的孔中，以避免3根PVC管和磁铁壁之间的摩擦。
    
    图1.用于体内 31 P NMR测量的装置的方案
    
    视频2.用于体内NMR测量的实验装置
  4. 一种允许含氧相互作用介质循环到上述管中的系统，在NMR数据采集过程中避免菌丝体的缺氧。
    它包括：
    1. 从NMR管延伸的3个特氟龙管通过PVC管连接到蠕动泵。
    2. 入口管从玻璃瓶（2,000ml）供应相互作用介质，其中氧气从压缩的O 2 气瓶鼓泡到NMR管。
    3. 输出管将已经氧化菌丝体的培养基收集到另一个原来空的玻璃瓶（2,000ml）中。
    4. 如果正常输出系统功能失常，安全输出管应避免磁铁孔中的任何泄漏。
2. 在体内装置NMR管中引入真菌菌丝体（见视频2）
  1. 从烧瓶中取出真菌菌丝体，或从含有相互作用介质的注射器中取出（参见Becquer et al。，2017b），轻轻滴下溶液，用刮刀将其放在滤纸上或镊子。
  2. 将真菌菌丝体尽可能温和地放在NMR管的底部，首先使用刮刀，然后使用木制叉的扁平侧。对于 Hebeloma cylindrosporum ，在上述培养条件下获得的三个菌丝体样品对于完全松弛的数据采集的1小时的合理信噪比<1> 1 P-NMR是必需的。
  3. 借助木制扦子和钩子将化学位移参考毛细管放在NMR管的底部中心。
  4. 将内管拧在NMR管上。如果参考毛细管没有很好地定位在内管内，请再次启动并用钩子移动它以将其设置在内管的中间。
  5. 在塑料盖上滚动硅胶膜以确保氧化灌注溶液不会从NMR管中泄漏。
3. 启动充氧灌注系统（改编自Lee和Ratcliffe，1983）
  1. 在含有通过入口管连接到NMR管的相互作用介质的玻璃瓶中开始氧气鼓泡。
  2. 将进口管，输出管和安全输出管的蠕动泵控制的流量调节至9 ml min -1 。
  3. 在弦谱的帮助下，用NMR光谱仪的磁体孔中的3根管子手动和缓慢地引入NMR管。
体外 NMR研究的真菌样品制备（改编自Roby et al。，1987）
1. 用液氮冷冻菌丝体。
2. 在萃取前将它们储存在-80°C。
3. 对于每次 31 P-NMR测量，在4℃下解冻6个冷冻菌丝体，并用1ml含有10mM钒酸钠的70％（v / v）高氯酸将其压碎。
4. 去除颗粒物质并中和样品中的高氯酸（改编自Aubert et al。，1996）：
  1. 将浓悬浮液在10,000 x g 下离心10分钟，以丢弃沉淀中的颗粒物质。
  2. 将上清液转移到50 ml Falcon试管中，加入pH电极并通过非常缓慢地加入2 M KCO 3 溶液中和溶液，使泡沫消退，当pH值为6.5时停止。
  3. 再次以10,000 x g 离心10分钟以除去沉淀中的KClO 4 。
  4. 冷冻干燥上清液并将其储存在-80°C。
  5. 对于NMR测量，将冷冻干燥的材料重新溶解在2ml MOPS 40mM（未调节的pH）中。然后加入0.2ml EDTA 100mM。用KOH 1 N调节pH至7.8。
  6. 加入NaN 3 至终浓度100mg / ml -1 以避免微生物降解。
  7. 添加D 2 O（终浓度10％）用于NMR信号的场频锁定。
31 P-NMR数据采集
1. 记录核磁共振谱，Varian UNITY INOVA 500 MHz，工作频率为202.4 MHz， 31 P，配备10 mm宽带探头，工作温度为25°C。
2. 对于体内实验，使用以下参数获取条件
  1. 考虑到体内实验中 31 P NMR信号的广泛性，没有必要优化垫片。在没有锁定信号的情况下进行实验。
  2. 90°射频脉冲角;光谱宽度= 20,000 Hz;采集时间= 0.4秒; 31 P频率偏移= 3,900 Hz。没有解耦（考虑到 31 P-NMR峰体内核磁共振实验的广泛性没有用： 1 H去耦不会影响峰的线宽）。
  3. 20秒的扫描间延迟（自旋晶格弛豫时间T1的5倍）给出完全弛豫的光谱（Quiquampoix 等人，，1993）。这是用于定量分析 31 P-NMR谱中鉴定的化学代谢物的非常重要的参数。更低的扫描间延迟不允许实际量化。
  4. 扫描180次，总累积时间为1小时。
  5. 使用10 Hz指数函数对零谱进行切趾，零填充至16 K点。
  6. 相位和基线校正。
  注意：使用该方案获得的体内光谱的实例可以在Torres-Aquino等人中看到。（2017）。
3. 对于体外实验，使用以下参数获取条件
  1. 菌丝体样品中10％的D 2 O作为锁定信号。
  2. 90°射频脉冲角;光谱宽度= 9,600 Hz;采集时间= 0.84秒; 1 H在采集时间内使用华尔兹-16脉冲序列在4KHz的场强下解耦。 31 P频率偏移= 4,900 Hz; 1 H频率偏移= 170 Hz。
  3. 4秒扫描间延迟。在这些实验中，范围是基于信号化学位移鉴定磷酸化的真菌代谢物，而无需定量。如果需要定量，则使用20秒扫描间延迟，如体内研究。
  4. 足够数量的累积以获得可接受的信噪比。
  5. 使用2 Hz指数函数对光谱进行切趾，并将零填充至16 K点
  6. 相位和基线校正。
  注意：使用该方案获得的体外光谱的实例可以在Torres-Aquino等人中看到。（2017）。

数据分析

Pi和polyP的NMR峰面积相对于MDP毛细管的NMR峰面积表示，对于所有实验都是相同的，并且任意固定为1.如果比较几种处理，使用Kolmogorov Smirnov检验测试数据的正态性，并在必要时，在分析之前将数据转换为平方根或log10，以满足ANOVA的假设。为了比较治疗效果，使用ANOVA分析，然后使用Tukey的真实显着性差异。对于 31 P-NMR测量，如ANVA之前的Legendre和Legendre（1998）所述，转化百分比数据（arcsin√x）。

笔记

由于真菌在液体培养基中的生长可能会有所不同，我们准备多达4个额外的培养瓶接种真菌，以丢弃那些生长不良的培养瓶。＆nbsp;
如果您需要负责核磁共振设施单位的科学家的帮助，您可能必须让他们相信自制灌注核磁共振管用于体内研究的安全性。在NMR光谱仪外用该装置启动几个不同的实验，以检查没有液体泄漏。
如果使用较低磁场的NMR光谱仪，则必须增加累积的数量。
灌注NMR管中的含氧液体介质的流动是两种不希望的现象之间的折衷：（i）太低的流量不足以使细胞充分氧化和（ii）过高的流量将导致气泡形成在生物样品的基质中导致光谱分辨率降低。后一种效应通常不会低于10 ml min -1 （Lee和Ratcliffe，1983）。

食谱

微量元素（1,000毫升）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：250px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>MnSO 4 •H 2 O
3.08克
ZnSO 4 •7H 2 O
4.41克
H 3 BO 3
2.82克
CuSO 4 •5H 2 O
0.98克
Na 2 MoO 4 •2H 2 O
0.29克
将ddH 2 O加入1,000 ml，在4°C下储存＆nbsp;
矿物盐基溶液（各100毫升）
硫胺素溶液（100毫升）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：250px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>硫胺素-HCl
0.01克
N6完全液体溶液（1,000毫升）
1. 在1L烧杯中加入约500ml去离子水和以下体积的矿物质基础溶液：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：250px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>KNO 3
  6毫升
  NaH 2 PO 4
  1毫升
  MgSO 4
  1毫升
  KCl
  4毫升
  CaCl 2
  0.5毫升
  柠檬酸铁铵
  0.5毫升
2. 加入0.2毫升微量元素和0.5毫升硫胺素溶液
3. 将体积调至1L并检查应调节至5.5的pH值
4. 最后，加入5克D-葡萄糖并摇匀直至完全溶解
5. 将此解决方案分配到玻璃罐中
固体N6完全液体溶液（1,000毫升）
取两个1升玻璃瓶：
1. 加入7.5g琼脂，并在每个瓶中倒入500ml液体N6培养基
2. 通过在121℃下高压灭菌20分钟对培养基灭菌
3. 将冷却的培养基（55-60°C）倒入直径90 mm的培养皿中
相互作用介质（3,000毫升）
1. 在3L烧杯中加入约1.5L去离子水和以下体积的矿物基础溶液：＆nbsp;
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：350px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>MgSO 4
  0.6毫升
  CaCl 2
  1.5毫升
  MES（终浓度为5 mM）
  3.2克
  TRIS（终浓度为5 mM）
  1.82克
2. 用去离子水完成3L并用1N H 2 SO 4 将pH调节至5.5
3. 将1.5升培养基倒入2升玻璃瓶中，并通过高压灭菌消毒（20分钟，121℃）

致谢

这项研究由INRA（法国）通过授予Adeline Becquer和CONACYT（墨西哥）授予博士学位的青年科学家合同提供支持。玛格丽塔托雷斯 - 阿基诺获得奖学金。该协议改编自我们以前的工作（Torres-Aquino et al。，2017）。作者声明他们没有利益冲突。

参考

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Becquer，A.，Torres-Aquino，M.，LeGuernevé，C.，Amenc，L.K.，Trives-Segura，C.，Staunton，S.，Quiquampoix，H。和Plassard，C。（2017b）。在培养的外生菌根真菌和植物之间建立共生界面，以跟踪真菌磷酸盐代谢。 Bio-议定书 7（20）：e2577
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