材料和试剂

材料
1. 玻璃显微镜载玻片
2. 猎鹰管
3. 玻璃移液器
4. 玻璃纸膜（纤维素）（Innovia Films，目录号：325P）
5. pH指示条：
  纸DOSATEST，pH 0-14（VWR，目录号：35309.606）
  DOSATEST，pH 7-14（VWR，目录号：BDH35312.607）
植物材料： Arabidopsis thaliana
注意：
1. 我们使用在标准环境温室条件下生长的拟南芥植物，在25°C，必要时补充照明（最佳，通过高压钠生长灯泡），以维持140μmol•m 的条件> -2 •sec -1 ，每天长度为16小时。在我们的经验中，较低的光照水平与较差的花粉萌发水平相关。植物以4：1比例的多用途泥炭基堆肥与园艺蛭石生长。植物质量对于这些实验的一致性至关重要。
2. 为了保持良好的植物生长，我们小心不要在盆中培育高密度或中等密度的幼苗（通常在9厘米直径的盆中培育3-5株植物）。如果可能的话，最好在原地播种，并在幼苗出现时将幼苗稀释到这个较小的数量。＆nbsp;
3. 开花时不要在头顶上浇水，因为以这种方式灌溉会增加开花中的花粉因花粉粒破裂而变得不可靠的可能性。我们通过将盆放在没有孔的塑料种子托盘中并在托盘底部保持最多2厘米的水来确保植物浇水良好。
4. 我们希望在托盘中加入少量（约0.75克）缓释Osmocote肥料，以确保植物有恒定的营养供应。
5. 为了保持一致性，在正确的发育阶段收获花粉进行花粉萌发是非常重要的。只应使用已经进展到开花并且刚开始在主花序轴上发育种子荚（长角果）的植物。最重要的是避免使用已经开始退出花卉生产过程的老植物的花粉（即那些未开放的花蕾比长角果和成熟花朵少的花粉），因为它们的花粉萌发百分比显着下降。 / em>
化学试剂
注意：除非另有说明，否则以下所有内容均保存在室温下。
1. 琼脂糖（例如，分子级，Bioline，目录号：BIO-41025）
2. 硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B9645）
3. 氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
4. 硝酸钙（Sigma-Aldrich，目录号：C1396）
5. 酪蛋白酶水解产物（N-Z-胺A）（Sigma-Aldrich，目录号：C0626），储存于4°C
6. 蒸馏水，高压灭菌水
7. 柠檬酸铁铵（Sigma-Aldrich，目录号：F5879）
  注意：潮湿且光敏，确保存放在密封的防光容器中。
8. γ氨基丁酸（GABA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2129）
9. 肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：I5125），储存在4℃
10. 氢氧化钾
11. 亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S0266）
  注意：储存在4°C;亚精胺具有高度吸湿性和对空气敏感性，因此始终确保盖子密封良好。
12. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
13. 标准解决方案（见食谱）
  1. 蔗糖原液＆nbsp;
  2. 硼酸原液＆nbsp;
  3. 氯化钙储备液
  4. 硝酸钙储备液＆nbsp;
  5. 氯化钾原液＆nbsp;
  6. 酪蛋白酶水解产物储备液＆nbsp;
  7. 柠檬酸铁铵储备溶液
  8. 肌醇原料
  9. 亚精胺原料
  10. GABA股票＆nbsp;

设备

PAP Pen（例如。，Liquid Block Super PAP pen; Daido Sangyo Saitama，Japan）
显微镜载玻片盒
水浴或干热块
温控烤箱
移液器
镊子
手术刀/剃刀刀片
细剪刀
小玻璃烧杯
微波
Photomicroscope，具有多个镜头和相机单元
手提柜台

软件

ImageJ软件

程序

建立体外萌发
1. 该系统的第一个要求是为您将制作的琼脂垫幻灯片设置一个简单的存储盒。为了存储多个幻灯片，我们使用密封良好的显微镜载玻片盒。为了保持潮湿的气氛，我们在盒子的一端插入一小块水润湿的纸巾，远离载玻片放置的位置。这些棉絮由干净的载玻片保留（见图1）。小心不要用水浸透纸张，否则水会流出并损坏载玻片。
  
  图1.由滑动盒制成的湿润室，其中载玻片可以存放在冰箱中，也可以用作培养室，用于花粉萌发和管生长
2. 第二个要求是为载玻片产生一个简单的孵育室（见图1和6）。这可以通过采用可密封的塑料容器或甚至培养皿，在底部放置一层水饱和的薄纸，然后放置平行的玻璃移液管（或玻璃搅拌棒）以产生载玻片的支撑来实现。（将它们提升到薄纸上方）（图6）。同样，可以使用与载玻片存储容器中相同的布置（图1）。在实验之前，我们将其保持在24°C的培养箱中。
3. 为了生成幻灯片，我们首先使用PAP笔在玻璃载玻片表面上绘制一个大约1.5 x 2 cm的外壳（图2）。 PAP笔蜡标记提供的轻微脊部确保当将熔化的琼脂添加到玻璃表面时，它形成整齐的垫而不是流过载玻片。
  
  图2.玻璃载玻片的表面显示使用PAP笔绘制的外壳，允许容纳熔化的琼脂糖培养基
4. 在60-65°C下放置干热块或水浴。使用锋利的手术剪刀，从c的玻璃纸膜上切下矩形。 1.2 x 1.7厘米，以便它们恰好适合琼脂糖垫的区域。
5. 用于在花粉萌发率和花粉管生长之间进行最佳权衡的培养基配方在配方部分中描述。可以在Rodriguez-Enriquez 等人（2013）中找到可以改变花粉萌发百分比和花粉管生长的其他培养基组合（除了所描述的标准溶液之外），这些可以依赖于关于具体需求。
6. 为了制备培养基，将所有储备溶液（不包括肌醇，亚精胺和GABA）与Falcon管中的水混合并充分混合。接下来，加入琼脂糖至终浓度为0.05％（25毫克，5毫升），将具有非常松散盖的Falcon管置于小的耐热玻璃烧杯中，然后在微波炉中以中低功率温和加热。句点（例如，10-30秒爆发）。为了溶解琼脂糖，将盖子拧紧并将管倒置数次以混合。重复几次，直至溶液几乎沸腾，琼脂糖溶解并均匀分布。这也可以通过使用非常小的Pyrex玻璃烧杯并使用玻璃棒搅拌来实现，该玻璃棒对于超过5ml的体积特别有用。注意不要将琼脂糖煮沸，并且在直接从微波炉中取出和操作热液体时要小心。佩戴合适的护目镜和其他防护设备至关重要。
7. 立即将Falcon管放入加热块或水浴中。冷却至块/浴温后，从原液中加入肌醇，亚精胺和GABA。反转几次混合。最后，使用pH指示条通过将条带浸入热溶液中来确定pH值。我们发现培养基的最适pH值取决于生态型。对于Col生态型，我们将pH调节至8.0，而对于Ler生态型，我们将pH调节至7.0。使用稀KOH溶液实现该调节。可能需要几个指示剂测试和少量稀释的KOH溶液以获得正确的pH水平。确保在加入KOH后，在测试pH之前将溶液充分混合，因为溶液相对粘稠。由于添加的KOH溶液的体积小，因此介质组合物没有显着改变。
8. 将Falcon管保留在加热块或水浴中，以确保琼脂糖不会凝固。将载玻片放在非常平坦的表面上，PAP笔标记为朝上。使用1毫升移液管，将足够的Falcon管中含有的熔融琼脂溶液吸移到外壳中，将其填满并制成垫（图3）。琼脂糖将迅速冷却并凝固，它们可以立即使用或储存供以后使用（图1）。
  
  图3.将熔化的琼脂糖培养基移液到外壳（A）中，在凝固后产生琼脂糖垫（B）
  
  如果存放以备后用，请快速放入存储滑动盒（图1）并用保鲜膜彻底密封盒子外部。在4°C的冰箱中，这些载玻片可在制备后长达7天使用。我们建议在幻灯片盒或幻灯片本身上写下准备日期。
  一定不要使用旧的载玻片，因为微生物生长（特别是真菌污染）会严重干扰花粉的生长。当使用存储的载玻片进行接种时（下面的步骤A10-A12），确保在使用前至少1小时从冰箱中取出载玻片盒，以便在室温下达到平衡。为了更快地进行平衡，可将载玻片置于潮湿的室中，放在玻璃上或移液管上，用温水（40-50°C）湿润的薄纸上浸泡15分钟。
9. 如果立即使用载玻片，则需要将玻璃纸矩形放置在琼脂糖垫的表面上以形成花粉的纤维素接触表面。抓住两对镊子之间的玻璃纸，将其固定在边缘，轻轻地与琼脂糖表面接触，然后释放（图4）。从干燥的玻璃纸矩形实现均匀粘附可能是麻烦的，因为它们可以卷曲。这可以通过在使用前将玻璃纸保持在潮湿的室中几分钟来减轻。确保玻璃纸平放在表面上，下面没有任何气泡。通过用镊子的边缘微妙按压，可以轻轻挤出任何形成的气泡。
  
  图4.切割的玻璃纸膜放置在琼脂糖垫表面上
10. 重要的是毫不拖延地用花粉粒接种玻璃纸的表面。要做到这一点，使用刚开始开花的花（c。第1天到第2天，Boavida和McCormick，2007）。重要的是选择开放的花，其中花药刚刚开始释放花粉，因为谷物的产量要大得多。我们发现在早上使用花进行接种总是更好。用钳子（茎）用钳子握住它们，在一个大致的位置轻轻擦拭它们几次到玻璃纸表面（图5）。也可以将花粉从花朵转移到非常精细的画笔上，并用它将花粉沉积在表面上（如果使用画笔，确保在蒸馏水中彻底清洗并在使用后彻底干燥以清洁花粉。任何残留花粉粒的鬃毛。）重要的是开发一种沉积花粉的运动技术，确保花粉不会高度聚集，而是分布在相对均匀间隔的单层中（当然，这从个体实验者到个体不等）实验者。为了有效地做到这一点，我们鼓励用不同技术进行一些测试，并用显微镜检查花粉分布。对于单个垫，我们采取鲜花并系统地将花粉分布在整个表面上（c。12个花，3 x 4行，每张幻灯片通常足够）。|
  
  图5.使用镊子夹持花梗，将花粉涂在玻璃纸表面上，刷花和轻拍花朵
11. 将载玻片移至潮湿的室中，然后放在凸起的支架上或滑动盒中。在将盖子密封并放入24°C的培养箱中时，确保载玻片不会滚落并掉落在潮湿的表面上。
  
  图6.将培养皿中的单个载玻片孵育为湿润室的设置
12. 在1小时内，应该可以看到花粉萌发的开始（图7）。可以从潮湿室中取出载玻片并快速检查并在显微镜下间隔拍照。确保最大限度地缩短潮湿室外的时间，因为载玻片会迅速脱水。例如，我们将载玻片放在潮湿的室内（见图6）到显微镜，以减少对花粉的压力。
  
  图7. 1小时后（A）和6小时后（B）的花粉萌发和管生长。比例尺=100μm。
  
  如果下游分析需要（例如，蛋白质，DNA或RNA提取;显微镜固定），发芽花粉可以很容易地从膜表面清洗。最好通过除去膜并浸入含有几毫升基本生长培养基的小培养皿中来实现，所述基本生长培养基在没有添加琼脂糖的情况下制成。花粉很容易脱落，可以从液体培养基中进一步浓缩，例如在500 x g 下短暂且非常温和地离心30秒。
建立半体内生长
1. 这种方法必须在花药开裂前去除花蕾。这允许在柱头表面上同时沉积所需的花粉。使用细镊子，小心地从未开封的花蕾中取出六个花药，避免对雌性生殖部位造成任何损害。当花药释放花粉或柱头受损时，丢弃花。移除并丢弃此植物上任何其他开放或开放的花朵，放回温室，与其他 A隔离。 thaliana 植物，花朵脱落花粉，以确保不会发生污染其他花粉的污染表面。如果可能的话，留下一夜之间的耻辱进一步成熟。在此期间，任何受损的柱头都会枯萎。然而，为了成功，我们建议在授粉前不要长时间（超过24小时）留下耻辱感。
2. 用所需的花粉授粉去雄花的柱头表面。由于花粉萌发和渗透到柱头组织至少需要1小时（Cheung et al。，2010），因此有必要将其留在授粉的柱头上至少这段时间。当柱头表面与培养基接触时，这降低了花粉粒变得迷失方向的可能性，从而减少了生长到培养基上的花粉管的数量而没有穿透该样式。
3. 按照步骤A1-A10中列出的步骤制作幻灯片。建议事先准备好载玻片。
4. 在用一把镊子轻轻地支撑组织的同时，使用干净，锋利的手术刀片切割与卵巢交界处的样式。使用新鲜锋利的刀片确实有助于成功。在不破碎组织的情况下，将它们水平放置在玻璃纸上（图8）。这种从植物到培养基的转移必须尽快进行，因为这些细小的组织会很快脱水。
  
  图8.授粉，切除的柱头/样式材料在覆盖琼脂糖垫的玻璃纸表面上的定位
5. 最后，尽快遵循步骤A12。
6. 花粉管需要几个小时（最多12小时）从柱头的切割端出现（图9），材料应放在培养基上后定期检查。
  
  图9.过夜发育后半体内系统中的花粉管。从样式的切割末端可以看到广泛的花粉管生长。

数据分析

花粉萌发
使用野生型花粉，我们发现与培养基接触后5小时是测量 o 花粉萌发率的理想时间（Rodriguez-Enriquez et al al。，2013）。这是因为花粉管长度通常处于相对最佳的尺寸，以便于评估花粉是否已经发芽。当它显示出完整的，管状的，相对透明的结构时，我们对花粉粒进行了发芽评分。通过在载玻片表面上随机选择离散的独立区域来实现发芽评分（图7）。拍摄一张幻灯片，第一个字段位于左上角，然后水平移动幻灯片，以便在视野中看到完全不同的视野，并在整个幻灯片上执行此操作直到胶片边缘。然后，垂直移动幻灯片，以便在视图中显示新的非重叠字段，然后再次水平移动。以这种方式重复，可以研究具有来自不同花的花粉的多个视野。选择水平是必要且不可避免的，因为花粉已经非随机地分布在玻璃纸表面上。例如，我们避免分析花粉过于聚集在一起的田地，如图10所示，因为在这些情况下区分离散发芽更难以几乎不可能。开发一种能够产生相对均匀的花粉粒分布的技术非常重要。为了计算发芽花粉粒的数量，可以使用手持计数器直接评分。但是，也可以拍摄该字段以供以后的数据分析。这里，拍摄相同视野但具有稍微改变的焦点的重复图像可以帮助区分由于尺寸和方向而难以解决的发芽事件。我们发现对来自多个田地的300个花粉粒进行分析是足够的（Rodriguez-Enriquez et al。，2013）。

图10.发芽过程中一组致密的花粉粒。比例尺=100μm。
花粉管生长
为了分析花粉管长度体外，我们使用与花粉萌发相同的方法，但田地的图像捕获是必不可少的。在我们之前的工作中，使用ImageJ确定花粉管长度（ https://imagej.nih.gov/ ij / ）软件（Rodriguez-Enriquez et al 。，2013）。使用ImageJ，100个随机选择的花粉管的长度足以产生有用的结果。只有当花粉萌发最小时，我们才使用50个花粉管进行测量。以这种方式的图像捕获和分析对于半体内花粉管生长是潜在可能的。在此，必须在玻璃纸表面上良好地分离母体组织，否则花粉管可能会出现并与其他花粉缠结。已经采用其他方法使用我们的发芽系统测量花粉管长度，例如Rottmann等。（2016）。
动力学分析
它可以测量使用上述技术花粉萌发和花粉管生长动力学，周期性地去除所述滑动件（例如每2小时）从湿室和在显微镜快速记录数据返回到潮湿室中之前。如果要在多个场合重新检查相同的滑块，则最小化潮湿腔室外的时间尤其重要。我们发现，花粉与培养基体外接触后24小时内的测量结果将产生有用的结果。 24小时后，体外花粉管不再生长，质量开始明显下降。
注意：如果结果用于发布，建议在不同日期复制相同的实验，以确保收集的数据具有代表性。此外，在动力学研究中，要小心保持一致;比较生长动力学，使用从潮湿室重复移除的相同载玻片，并使用从同一批次中选择的不同载玻片进行测量，并且仅从潮湿室中取出一次是不合需要的。

笔记

我们设计的方法相对无故障且稳健。有两个因素需要非常谨慎。首先，当对研究中使用的植物材料给予高度重视时，才能获得优异且一致的结果。这是最重要的因素。其次，我们发现，亚精胺对于发芽的有效触发，并且还具有对花粉管生长的效果（Rodriguez的-Enriquez的等人，2013）;小心使用这种易降解的分子是必要的。严格遵守上述程序中的详细说明应为用户提供发布所需的一致结果。

食谱

标准解决方案
10％蔗糖
0.01％硼酸
1 mM CaCl 2
1 mM Ca（NO 3 ） 2
1 mM KCl
0.03％酪蛋白酶水解产物
0.01％柠檬酸铁铵
0.01％肌醇 0.1 mM亚精胺
10 mM GABA
我们使用原液（参见本节末尾）生成5 ml标准溶液，足以用琼脂垫约10-12个载玻片。
1毫升蔗糖原料
50μl硼酸原料
100μl氯化钙原料
100μl硝酸钙原料
100μl氯化钾原料
150μl酪蛋白酶水解产物原料
50μl柠檬酸铁铵原料
10μl肌醇原料
10μl亚精胺原料
100μlGABA原料
蒸馏无菌水至5毫升
1. 蔗糖原液解决方案
  50％（w / v）溶于无菌蒸馏水中
  该溶液可以在冰箱中存放长达4周
2. 硼酸储备液
  1％（w / v）溶于无菌蒸馏水中
  这种解决方案可以存放在冰箱中长达4周
3. 氯化钙原液
  50 mM溶于无菌蒸馏水中
  该溶液可以存放在冰箱中长达8周
4. 硝酸钙储备液
  50 mM溶于无菌蒸馏水中
  该溶液可以存放在冰箱中长达8周
5. 氯化钾储备液
  50 mM溶于无菌蒸馏水中
  该溶液可以存放在冰箱中长达8周
6. 酪蛋白酶水解产物原液
  1％（w / v）溶于无菌蒸馏水中
  该溶液可以在冰箱中存放长达2周
7. 柠檬酸铁铵储备液
  1％（w / v）溶于无菌蒸馏水中
  该解决方案可以在冰箱中存放长达8周，确保排除光线
8. Myo-inositol stock
  50毫克/毫升溶于无菌蒸馏水中该溶液可以在冰箱中存放长达2周
9. 亚精胺原料
  50 mM溶于无菌蒸馏水中
  这种解决方案最适合用于关键实验，但可以在冰箱中存放长达2周
10. GABA股票
  500毫升溶于无菌蒸馏水中
  该溶液可以在冰箱中存放长达2周

致谢

我们感谢Saher Mehdi和Helen Prescott对这项工作的帮助，感谢John Baker对摄影的贡献。我们还感谢研究项目学生Eleanor Barnes和David Jones使用这种技术，并让我们在不同条件下对其有效性有了新的见解。该协议改编自Rodriguez-Enriquez 等（2013）。
没有利益上的冲突。

参考

Boavida，L。C.和McCormick，S。（2007）。温度是决定增加和重现体外花粉萌发的决定因素 Arabidopsis thaliana 。 Plant J 52（3）：570-582。
Cheung，A.Y.，Boavida，L.C.，Aggarwal，M.，Wu，H.M。和Feijo，J.A。（2010）。花粉管在雌蕊中的旅程并对体内过程进行成像双光子显微镜。 J Exp Bot 61（7）：1907-1915。
MacAlister，C.A.，Ortiz-Ramirez，C.，Becker，J.D.，Feijo，J.A。和Lippman，Z.B。（2016）。羟脯氨酸O-阿拉伯糖基转移酶突变体相反改变拟南芥中的尖端生长和 Physcomitrella paten s 。 Plant J 85（2）：193-208。
Qin，Y.，Leydon，A.R.，Manziello，A.，Pandey，R.，Mount，D.，Denic，S.，Vasic，B.，Johnson，M。A.和Palanivelu，R。（2009）。耻辱和风格的渗透引发了花粉管中的新型转录组，指出了对于生长发育至关重要的基因雌蕊。 PLoS Genet 5（8）：e1000621。
Rodriguez-Enriquez，M。J.，Mehdi，S.，Dickinson，H.G。和Grant-Downton，R。T.（2013）。有效体外萌发和管生长的新方法>拟南芥花粉。 New Phytol 197（2）：668-679。
Rottmann，T.，Zierer，W.，Subert，C.，Sauer，N。和Stadler，R。（2016）。 STP10编码高亲和力单糖转运蛋白，并在低葡萄糖条件下诱导花粉管拟南芥。 J Exp Bot 67：2387-2399。
Waterworth，W。M.，Drury，G。E.，Blundell-Hunter，G。和West，C。E.（2015）。拟南芥 TAF1是抗基因毒性应激所需的MRE11相互作用蛋白雄性配子体的生存能力。 Plant J 84（3）：545-557。