材料和试剂

Samco Extra Fine-tip聚乙烯转移移液器（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific TM ，Molecular BioProducts，目录号：231）
1.5 ml微量离心管（Eppendorf，目录号：0030125150）
5毫升聚苯乙烯圆底管（流式细胞仪管）（Corning，Falcon ®，目录号：352008）
Flow-Count Fluorospheres（Beckman Coulter，目录号：7547053）＆nbsp;
铝箔
Hank的平衡盐溶液（HBSS +钙+镁）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14025076）
Hank的平衡盐溶液（HBSS，无钙，无镁）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14175095）
胶原酶P（Roche Molecular Systems，目录号：11213857001）（2 mg / ml原液）
DNase I（Roche Molecular Systems，目录号：11284932001）（10mg / ml原液）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％），酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25300054）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：1009141）
RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11875119）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A7906-500G）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
LIVE / DEAD TM 可固定的近红外死细胞染色试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：L10119）
人类TruStain FcX TM （BioLegend，目录号：422302）
Brilliant Violet 510 TM 抗人CD45抗体克隆HI30（例如，BioLegend，目录号：304036）
藻红蛋白（PE）小鼠抗人CD19抗体克隆HIB19（例如，BD，目录号：555413）
PE-CF594小鼠抗人CD16克隆3G8（例如，BD，目录号：562320）
Alexa Fluor ® 700抗人CD14抗体克隆M5E2（例如，BioLegend，目录号：301822）＆nbsp;
Brilliant Violet 605 TM 抗人CD4抗体克隆OKT4（例如，BioLegend，目录号：317437）
Brilliant Violet 650 TM 抗人CD3抗体克隆OKT3（例如，BioLegend，目录号：317323）
FITC抗人CD8a抗体克隆RPA-T8（例如，BioLegend，目录号：301006）
PerCP / Cy5.5抗人CD56（NCAM）抗体克隆HCD56（例如，BioLegend，目录号：318322）
Brilliant Violet 785 TM 抗人HLA-DR抗体克隆L243（例如，BioLegend，目录号：307642）
消化液I（见食谱）
消化液II（见食谱）
FACS缓冲液（见食谱）
1％PFA（见食谱）

设备

涡旋
台式离心机
计时器
FACS流式细胞仪（BD，型号：LSRFortessa TM ，4激光）
常规细胞培养箱（37°C / 5％CO 2 ）

软件

FlowJo版本10.1.0（FlowJo LLC，https：//www.flowjo.com）
BD FACSDiva TM 软件

程序

活检准备
1. 在知情的捐赠者同意下获得16号人体肾活检核心（见注1）。＆nbsp;
2. 在处理之前测量肾活检核心的长度。注意测量;它用于确定免疫细胞群的绝对数量（如“注释”部分所述）。
3. 将肾脏活组织检查核心部分（约1-5 mm）置于1.5 ml微量离心管中的0.25 ml消化液I（参见食谱）中。
4. 在37°C孵育总共15分钟。在7分钟时，在15分钟结束时，用Samco移液管轻轻地上下移液几次，以机械解离细胞。上面列出的Samco移液器的直径有利于这种分离。
5. 在4℃下低速离心（600 x g ）5分钟以沉淀细胞。
6. 收获上清液用于分析来自活组织检查的可溶性产物。立即等分并储存在-80°C直至需要（见注2）。
7. 加入0.5 ml消化液II（参见配方）并在37°C下孵育10分钟。在此期间的开始和结束时，用Samco移液管轻轻地上下移液几次以机械解离细胞。
8. 加入0.5ml含钙的细胞培养基（例如，RPMI 1640培养基）以中和胰蛋白酶（见注3）。在这一点上，应该用最小的细胞团块完全消化活组织检查。但是，如果使用足够的组织，可能会留下不含细胞的白色纤维索。这符合Samco移液器吸头，易于拆卸。
9. 将得到的细胞在600℃下在4℃下离心5分钟。去除上清液。
抗体标记细胞
1. 在PBS中稀释LIVE / DEAD TM 可固定的近红外死细胞染色1：4。
2. 将细胞重悬于0.5ml PBS中，并加入0.5μl稀释的LIVE / DEAD TM Fixable Near-IR Dead Cell Stain（最终浓度1：4,000;参见注释4）。
3. 在冰上染色15分钟。
4. 通过加入0.5ml FACS缓冲液（参见配方）洗涤细胞，在4℃下以600μL离心5分钟并除去上清液。
5. 将细胞沉淀重悬于100μlFACS缓冲液中。
6. 在加入感兴趣的抗体之前，将5μlHumanTruStain FcX TM （参见注释5）加入到FACS缓冲液中的100μl细胞中（在室温下5分钟）。＆nbsp;
7. 准备抗体主混合物进行表面染色（见下面的面板;注释6-8）。
8. 将抗体主混合物添加至细胞，涡旋5秒并在冰上孵育30分钟。
  注意：此面板可根据感兴趣的细胞进行修改，也可包括活化标记物，趋化因子受体或其他感兴趣的分子。
9. 加入0.5 ml FACS缓冲液洗涤细胞，在4℃下以600 x g离心5 min，除去上清液。
10. 将细胞在1％PFA中固定至最终体积为270μl，并转移到聚苯乙烯FACS管中（见注释11）。用铝箔覆盖并保持冰/冷藏直至采集。应在四天内在流式细胞仪上分析细胞。如果在两小时内完成采集，则可以在没有固定的情况下运行细胞。
11. 在分析之前，立即加入30μlFlow-Count荧光球（见注12）。
12. 通过流式细胞仪分析。
流式细胞仪
1. 在流式细胞仪上设置补偿。＆nbsp;
2. 获取整个样本。

数据分析

识别和分析感兴趣的细胞。使用FlowJo分析样品。
1. 在单个活的CD45 + 免疫细胞中，门首先设置在多形核（增加的SSC）和单核细胞上。
2. 多形核细胞进一步门控为中性粒细胞（CD16 +）或嗜碱性粒细胞/嗜酸性粒细胞（CD16 - ）。
3. 单核细胞群被门控成单核细胞和淋巴细胞。基于其增加的侧向散射和CD14的表达，将单核细胞与淋巴细胞分离。
4. 淋巴细胞群进一步门控为B细胞（CD19 + ）和T细胞（CD3 + ）细胞。 CD19和CD3均为阴性的细胞（双阴性）通过CD56（NK细胞）或HLA-DR（DC;见图1）的表达进一步门控进入NK细胞亚群和DC。
使用Flow-Count荧光球计算细胞数（见注14）。

图1.用于通过流式细胞术鉴定人肾组织中免疫细胞亚群的门控策略。流式计数荧光球被识别并门控为前向散射（FSC）/侧的独特10μm珠子群散射（SSC）图。单个活的CD45 + 单核细胞（MNC）和粒细胞在FSC / SSC图上门控。基于低侧散射和不存在CD14表达，将总淋巴细胞与粒细胞和单核细胞区分开。通过分别表达CD3和CD19，将总淋巴细胞进一步分离成T细胞或B细胞。基于CD56强度和CD16表达鉴定NK亚群，CD56 bright 和CD56 dim NK细胞。 DC被门控为谱系（CD3，CD14，CD19，CD56） - HLA-DR + 细胞。 A.健康的肾脏活检组织; B.患病（炎症）肾脏活检组织。用于鉴定患病肾组织中免疫细胞亚群的门控策略在炎性AKI和CKD活检组织中是相同的。

笔记

获取人体组织需要获得适当的伦理委员会的批准，并征得捐赠者的书面知情同意。在使用人体组织时，必须遵循适当的生物安全措施（PC2设施）。活组织检查应从手术室运送到含有10％FBS冰上RPMI培养基的实验室。应在活组织检查的12小时内分离免疫细胞。
在第一次组织解离步骤后收集的收获的上清液可用于评估间质内的细胞因子和趋化因子。我们通过细胞计数珠阵列和ELISA评估了上清液中的炎症蛋白。
由于胰蛋白酶被二价阳离子（钙和镁）抑制，当制备消化溶液II时，胰蛋白酶在没有钙或镁的HBSS中稀释。然后通过加入含钙的细胞培养基中和胰蛋白酶。
LIVE / DEAD TM 可固定的近红外死细胞染色试剂盒用于确定细胞的活力。近红外荧光活性染料通过与细胞表面和细胞内部的游离胺结合而起作用，膜受损。活细胞表现出降低的荧光强度，因为染料只能与细胞表面胺结合。荧光强度的差异允许活细胞容易地与死细胞区分开。
人TruStain FcX TM 用于阻断非特异性结合在一些白细胞（例如单核细胞，粒细胞，B细胞和树突细胞）上表达的Fc受体的抗体。人TruStain FcX TM 通过阻断FcR介导的Ig Fc结合而不干扰抗体介导的人细胞特异性染色而起作用。
重要的是要认识到一些抗原可能在组织解离过程中被切割。因此，我们建议对您评估的抗原进行消化测试。这通过用选择的抗体组染色已经历解离过程的外周血单核细胞（PBMC）并将其与未处理的PBMC进行比较来进行。在表位丢失的一些情况下，针对相同抗原的不同表位的抗体克隆的改变可能是有用的。
抗体浓度对于起始≤5×10 5 5 细胞群是最佳的。不要超过此细胞数量，因为它会降低结合效率。但是，为了获得最佳结果，我们建议您滴定抗体并测试它们与您组中其他抗体的相容性。
对于抗体染色步骤，使用预冷却的溶液;这将防止细胞表面上的抗体加帽和非特异性细胞标记。
PBMC用于在流式细胞仪上设置补偿。为了制备单色补偿对照管，PBMC用组中列出的单个抗体染色（步骤16）并在冰上孵育30分钟。然后用0.5ml FACS缓冲液洗涤PBMC，在4℃下以600μl离心5分钟，并重悬于300μl1％PFA中。在流式细胞仪上获取每个补偿对照管，使用BD FACSDiva TM 软件精确计算每种荧光染料组合的自动补偿值。由于仪器之间的差异（包括激光强度和检测器灵敏度），流式细胞仪之间的补偿值会有所不同。
来自活组织检查组织的未标记细胞可用作对照以消除分析中的自发荧光。
对于绝对细胞数的计算，极端重要的是在最终洗涤后将细胞重新悬浮至总体积为270μl。为实现此目的，在吸出上清液后，我们最初添加100μl的1％PFA以重悬细胞。我们通过调节移液管上的体积来测量所得体积，直到所有液体在一次操作中从管中取出（这通常在140-170μl之间）。然后我们添加剩余体积的1％PFA以使精确的最终体积为270μl。
在使用Flow-Count荧光球时，遵循制造商的建议非常重要。必须适当地重悬氟磷球以确保等分试样反映产品插入物上指示的特定浓度。这很重要，因为样本中的生物细胞与荧光球的比率用于确定绝对细胞计数。为了重悬，将氟离子涡旋10-12秒;不建议使用较长的涡旋时间以避免形成过多的气泡。在分析之前添加荧光球，确保准确地将所需体积移液到样品中。荧光球也必须与测试样品充分混合。建议通过将FACS管保持在管高度的50％并在流式细胞术分析之前立即涡旋5秒来进行此操作。
Flow-Count荧光球可以在488 nm激发时在525 nm至700 nm的荧光发射范围内检测，或者通过FSC与SSC相比检测到，如图1所示。在此方法中，我们在离散珠子群周围紧密围绕，基于在FSC与SSC分析中确定的10μm大小
每个门控免疫细胞群的绝对数量可以使用制造商推荐的样本中的生物细胞与Flow-Count荧光球的比率来确定。这可以归一化为起始组织的体积，以允许比较多个样本之间的绝对数量。简而言之，使用以下公式计算靶细胞群的浓度（以细胞/μl计）：

计数的目标细胞总数/计算的氟离子总数x流量计氟离子浓度（在产品说明书上注明）x稀释因子

然后将每个靶细胞群的浓度乘以总样品体积以获得绝对计数。然后通过将绝对细胞计数除以肾组织的体积（cm 3 ），将绝对细胞计数标准化为每cm 3 肾组织的细胞数，其计算方法如下：

πr 2 x活检组织长度（cm）

其中，16号活检的半径（r）为0.08厘米。
给出了来自图1B的CD45 + 白细胞的绝对数量的代表性计算。
注意：处理0.5cm 16号人肾活检核心用于流式细胞术分析，计数29197个CD45 + 白细胞和29535个荧光球（库存浓度为968个氟离子/μl）。
所描绘的流式细胞术门控图是供体依赖性的并且是高度可变的。
通过利用与以下荧光染料结合的抗体，在我们实验室的扩展组中评估了其他标记物：别藻蓝蛋白（APC），Brilliant Violet 421 TM ，Brilliant Violet 711 TM 和PE -Cy7。

食谱

消化液I（立即准备和使用）
0.125毫升HBSS（+钙+镁）
0.125ml胶原酶P（最终浓度1mg / ml）
0.5μlDNaseI（最终浓度20μg/ ml）
消化液II（立即准备和使用）
10μl胰蛋白酶-EDTA（0.05％），酚红
490μlHBSS（无钙，无镁）
FACS缓冲液（在4°C下长期准备和储存）
1x PBS（1升）
5克BSA粉末（最终浓度0.5％）
200毫克叠氮化钠（最终浓度0.02％）
1％PFA
1x PBS（1升）
10克多聚甲醛
通过在搅拌下加热至60℃并加入1-2滴1M NaOH以帮助多聚甲醛溶解来制备PFA溶液。分装并储存在-20°C

致谢

作者要感谢组织捐赠者和临床医生。这项工作由昆士兰州病理学，皇家布里斯班和妇女医院（RBWH）研究基金，肾脏研究基金会和国家健康与医学研究委员会（NHMRC）项目拨款GNT1099222资助。所有作者均声明不存在利益冲突或任何形式的竞争利益。

参考

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