材料和试剂

圆底玻璃管（尺寸：16 x 100 mm）（AGC Techno Glass，IWAKI，目录号：TST-SCR16-100），带螺旋盖（AGC Techno Glass，IWAKI，目录号：9998CAP415-15）
圆底玻璃管（尺寸：12 x 75 mm）（AGC Techno Glass，IWAKI，目录号：9831-1207）
聚丙烯离心管：
15毫升（AS ONE，VIOLAMO，目录号：1-3500-21）
50毫升（Corning，Centristar，目录号：430829）
聚丙烯微量离心管：
1.5毫升（FUKAE KASEI，Watson，目录号：131-415C）
1.5 ml（Safe-Lock试管，Eppendorf，目录号：0030 120.086，用于加热SDS-PAGE样品）
2.0毫升（FUKAE KASEI，Watson，目录号：132-620C）
聚碳酸酯超速离心管（Beckman Coulter，目录号：343778）
移液器吸头（Quality Scientific Plastics）：
1-200μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：110-96RSNEW）
100-1,000μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：111-NXL-R100S）
血清移液管（Costar stripette）：
5毫升（康宁，目录号：4487）
10毫升（康宁，目录号：4488）
Immunune-Blot聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Bio-Rad Laboratories，目录号：1620177）
色谱纸（Whatman 3MM Chr，GE Healthcare，目录号：3030-672）
聚苯乙烯容器（180 x 90 x 45 mm）（AS ONE，目录号：1-4698-09）
黑色96孔条板（Black Combiplate 8，Labsystems，目录号：95029450）
注意：此产品已停产。
Parafilm（Bemis，目录号：PM996）
1,2-二油酰 - sn - 甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）（50毫克/毫升氯仿，Avanti Polar Lipids，目录号：850375C）
注意：储存在-30°C。
来自鸡蛋的SM（Avanti Polar Lipids，目录号：860061P）
注意：储存在-30°C＆nbsp;
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
注意：储存在-30°C。
L-α-磷脂酰乙醇胺-N-（丽丝胺罗丹明B磺酰基）（铵盐）（Rhod PE）（氯仿中1mg / ml，Avanti Polar Lipids，目录号：810146C）
注意：将溶液转移到带螺帽的圆底玻璃管中。用封口膜密封盖子以避免蒸发。避光，在-30°C下储存。用主要物质的分子量（1275.678g / mol）计算的近似摩尔浓度：0.8mM。
氯仿（Wako Pure Chemical Industries，目录号：038-02601）
注意：氯仿具有挥发性和肝毒性。因此，当使用氯仿及其混合物时，必须在通风橱中使用它们或使用替代设备来处理化学品安全。
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：19-2410-4）
乙醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：057-00456）
水（超纯水，例如，Milli Q）
用于血细胞凝集抑制试验的UV灭活RuV颗粒（RuV抗原）（Denka Seiken，目录号：310071）
注意：储存在-30°C。用1 ml /小瓶水重建后，在4°C下储存并在3天内使用。＆nbsp;
氯化钙二水合物（CaCl 2 •2H 2 O）（NACALAI TESQUE，目录号：06731-05）
Tris缓冲盐水（10x，pH 7.4）（TBS）（NACALAI TESQUE，目录号：35438-81）
用于哺乳动物细胞和组织提取物的蛋白酶抑制剂混合物（100x）（NACALAI TESQUE，目录号：25955-11）
5-（N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基）-2,4,6-三碘-N，N'-双（2,3-二羟基丙基）间苯二甲酰胺（Nycodenz）（Sigma-Aldrich，目录号：D2158）
十二烷基硫酸钠（SDS）（NACALAI TESQUE，目录号：02873-75）
甘油（Wako Pure Chemical Industries，目录号：075-00616）
二硫苏糖醇（DTT）（NACALAI TESQUE，目录号：14112-94）
Bromophenol blue（Wako Pure Chemical Industries，目录号：029-02912）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（NACALAI TESQUE，目录号：35434-21）
甘氨酸（NACALAI TESQUE，目录号：17109-64）
盐酸（HCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：080-01066）
30％（w / v） - 丙烯酰胺/双混合溶液（37.5：1）（NACALAI TESQUE，目录号：06144-05）
过氧二硫酸铵（APS）（NACALAI TESQUE，目录号：02627-34）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（NACALAI TESQUE，目录号：33401-72）
预染蛋白质标记物如PINK预染色蛋白质梯子（NIPPON Genetics，目录号：MWP02）和ExcelBand TM 3色常规范围蛋白质制造商（SMOBIO Technology，目录号：PM2500）
脱脂牛奶（BD，Difco，目录号：232100）
聚氧乙烯（20）脱水山梨糖醇单月桂酸酯（吐温20）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：167-11515）
山羊抗RuV病毒粒子（株HPV-77）多克隆抗体（Acris Antibodies，目录号：BP1061）
注意：储存在4°C。长时间储存，等分并储存在-30°C。
小鼠单克隆抗山羊/绵羊IgG-过氧化物酶抗体（Sigma-Aldrich，目录编号：A9452）
注意：储存在4°C。对于长时间储存，等分并储存在-30°C。
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（Merck，目录号：WBKLS0500）
氯仿/甲醇（19/1，v / v）
0.2M CaCl 2
1 M DTT
在50％（v / v）乙醇中的1％（w / v）溴酚蓝
10％（w / v）SDS
1M Tris-HCl pH 8.8
1M Tris-HCl pH 6.7
10％（w / v）APS
20％（w / v）Tween 20
注意：储存在4°C。使用前检查细菌或真菌污染。
脂质原液
TBS（见食谱4）
2x TBS（见食谱5）
80％（w / v）Nycodenz / TBS（见食谱6）
30％（w / v）Nycodenz / TBS（见食谱7）
3x SDS样品缓冲液（见配方8）
注意：分装并储存在-30°C＆nbsp;
10％（w / v）聚丙烯酰胺分离凝胶溶液（见配方9）
5％（w / v）聚丙烯酰胺堆积凝胶溶液（见配方10）
10x Tris / Glycine（见食谱11）
电极缓冲液（见配方12）
转移缓冲区（见食谱13）
TBS-T（见食谱14）
5％（w / v）脱脂牛奶/ TBS-T（见食谱15）
2％（w / v）脱脂牛奶/ TBS-T（见食谱16）

设备

微量移液器耐有机溶剂分配（NICHIRYO，型号：Nichipet EX Plus II，目录号：00-NPLO2-20,00-NPLO2-200,00-NPLO2-1000）＆nbsp;
Pipet-Aid XP移液器控制器（Drummond Scientific，目录号：4-040-101-J）
涡旋混合器（Delta混合器，TAITEC，型号：Se-08）
带水浴的氮气蒸发器（Nakajima seisakusho，Co.，Ltd.，定制）
通风柜配有活性炭过滤网（道尔顿，型号：DC-183-100）＆nbsp;
探头式超声波处理器（Hielscher Ultrasonics，型号：UP50H）
微型冷冻离心机（例如，KUBOTA，型号：3520）
电子天平（Shimadzu，LIBROR，型号：EB-340HW; Mettler-Toledo International，型号：ML802 / 52）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima TM TLX，带TLS-55转子）
用于微量离心管的块加热器（Nippon Genetics，Fast Gene TM ，型号：FG-02N）
pH计（TOA Electronics，型号：HM-30S）＆nbsp;
微波炉（TOSHIBA，型号：ER-225）
用于SDS-PAGE的蛋白质电泳装置（例如，BIO CRAFT，型号：BE-S28用于宽微型凝胶）
Western印迹装置（例如，Bio-Rad Laboratories，Criterion TM 印迹用于宽微型凝胶，目录号：1704070）
电源（ATTO，型号：AE-8450，用于SDS-PAGE; Bio-Rad Laboratories，型号：250 / 2.5，用于Western印迹）
管旋转器（SCINICS，型号：RVM-101）
互惠（TAITEC，型号：Personal-11）和/或跷跷板（TAITEC，型号：Wave-SI）振动器
化学发光成像系统（ATTO，型号：WSE-6200H LuminoGraph II）
微孔板读板机（BMG LABTECH，型号：FLUOstar Optima）

软件

ImageSaver 6 for Windows（ATTO Co.）作为WSE-6200H LuminoGraph II的图像采集软件
用于Windows的CS Analyzer 4（ATTO Co.）作为图像分析软件
Microsoft Excel 2016（Microsoft Corp.）作为电子表格软件
GraphPad Prism 7（Graph Pad Software）作为图形绘制软件

程序

脂质体的制备
除非另有说明，否则在室温下进行所有操作。当使用含有荧光标记的脂质的样品时，在整个过程中尽可能保护它们免受直射光的影响。
1. 为了制备由DOPC / SM /胆固醇/ Rhod PE以8：2：3：0.05的摩尔比组成的2x浓缩脂质体，制备每种脂质在有机溶剂中的储备溶液，然后在适当体积的每种储备溶液中混合。圆底玻璃管，以获得最终量：1.6μmolDOPC，0.4μmolSM，0.6μmol胆固醇和10nmol Rhod PE（图1A）。对于其他组合物的脂质体，适当改变放入玻璃管中的脂质量（表1）。
  
  表1.2x浓缩脂质体的脂质组合物。每种脂质体含有等量的磷脂。 DOPC用作基质磷脂，因为磷脂酰胆碱是质膜中最丰富的磷脂类型。脂质体A（8/2/3）的DOPC / SM /胆固醇的摩尔比与先前关于鞘磷脂特异性毒素溶素的研究中使用的脂质体的摩尔比相同（Ishitsuka和Kobayashi，2007）。脂质体A和A'的组成相同。＆nbsp;
  
  a 溶于氯仿/甲醇（19/1，v / v）; b 溶于氯仿;蒸发后，每个玻璃管加入1毫升 c 。
2. 使用设置在通风橱中的氮气蒸发器在氮气下在浴温35-40℃下完全蒸发有机溶剂。蒸发至少20分钟后，在玻璃管的底部形成脂质膜（图1B）。
3. 用1ml TBS-Ca将所得脂质膜再水化（图1C）。要制备不含钙离子的脂质体，请使用TBS代替TBS-Ca。
  
  图1.脂质体的制备。 A.蒸发前脂质溶液的混合物; B.蒸发后形成的脂质膜; C.用TBS-Ca再水化的脂质膜; D.超声处理后的脂质悬浮。
4. 用探针型超声波仪在混合水（无冰）中冷却，将混合物超声处理20-30分钟。对于UP50H超声波处理器，设置幅度为80％，占空比为50％。
  注意：混合物在开始时看起来很混浊。在30分钟（对于脂质体A）或20分钟（对于具有其他组合物的脂质体）超声处理后，混合物变得透明。每10分钟超声处理使管子涡旋，以恢复溅在管子内壁上的液体。
5. 将脂质悬浮液转移至1.5ml微量离心管中。
6. 使用微量冷冻离心机在25℃下以15,000 离心10分钟离心脂质悬浮液，以从超声波尖端沉淀脂质聚集体和碎片。
7. 将上清液转移到新的1.5ml微量离心管中，并在相同条件下再次离心。重复离心直至形成不可见的颗粒。
8. 将上清液转移到新的1.5ml微量离心管中，并将该级分作为2x浓缩的脂质体级分在4℃下储存。避光，3天内使用。
Nycodenz密度梯度离心
使用Nycodenz密度梯度分级评估RuV抗原和脂质体之间的相互作用。该实验的示意图如图2所示。除非另有说明，否则在室温下进行所有操作。使用前将所有试剂加热至室温。要省略每次反应中的钙离子，请使用基于TBS的试剂代替基于TBS-Ca的试剂。

图2. Nycodenz密度梯度分级的示意图
1. 将以下组分混合在聚碳酸酯超速离心管中：
  42μl水
  75μl2xTBS-Ca
  3μl100x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
  30μlRuV抗原
  （总体积：150μl）
  注意：＆nbsp;
  1. RuV抗原必须最后加入。在添加RuV抗原之前和之后通过移液充分混合。＆nbsp;
  2. RuV抗原含有由制造商作为添加剂添加的牛血清白蛋白。它的浓度没有透露。
2. 将步骤A8中制备的150μl2x浓缩脂质体级分加入混合物中，并通过移液管充分混合。
3. 将混合物孵育1小时，避光。
4. 通过移液将反应混合物（300μl）与300μl80％（w / v）Nycodenz / TBS-Ca混合以获得均匀溶液。所得溶液含有40％（w / v）Nycodenz。
5. 用300μl30％（w / v）Nycodenz / TBS-Ca覆盖40％（w / v）Nycodenz溶液，小心不要将它们混合。
6. 用300μlTBS-Ca覆盖30％（w / v）Nycodenz溶液，注意不要将它们混合。
7. 称重每个管和摆动桶。通过在管中加入TBS-Ca，将两组管子和桶的平衡重量放在TLS-55转子中，以0.01克的比例对角放置。
  注意：虽然铲斗的重量最初是由制造商匹配的，但铲斗需要在重量上保持平衡，因为它们会随着时间的推移而磨损。
8. 将每根管子小心地放入摆动桶中。
9. 小心地将水桶吊入TLS-55转子，然后将转子安装在Optima TLX超速离心机中。
10. 将样品以55,000rpm（259,000 x g max ）在25℃下离心5小时。
11. 小心地从铲斗上取下每根管子。
12. 使用具有1-200μl尖端的P-200微量移液管从梯度顶部收集50μl等分试样。始终将移液管尖端的点设置在水面下方（≤1mm），并以圆周运动缓慢吸取溶液，小心不要吸入空气。＆nbsp;
13. 将两个50μl等分试样在1.5ml微量离心管中混合（即，~100μl/管）。尽管可以使用微量移液管同时取100μl等分试样，但作者建议使用50μl等分试样：更容易控制短移液冲程，从而降低干扰梯度的风险。将每个样品分级成12个级分。当最后一部分的体积小于100μl时，用TBS-Ca将体积调节至~100μl。
  注意：事先使用100μl水，在1.5 ml管上标记约100μl线用于最后一部分。
14. 将30μl每种级分转移到1.5ml微量离心管中，然后与15μl3xSDS样品缓冲液混合。储存在-30℃直至SDS-PAGE分析。 15μl所得溶液含有10％（10μl）的每种收集的级分。
15. 用56μlTBS-Ca稀释24μlRuV抗原，然后与40μl3xSDS样品缓冲液混合。储存在-30℃直至SDS-PAGE分析。 15μl所得溶液含有3μlRuV抗原，其对应于输入每个超速离心管的那些抗原的10％。将残余部分（约70μl/管）储存在4°C直至测量荧光。
SDS-PAGE和Western印迹分析
使用标准SDS-PAGE分析收集的级分中的RuV颗粒的分布，然后对RuV蛋白进行Western印迹分析。除非另有说明，否则在室温下进行所有操作。
1. 参见SDS-PAGE的基本方案（He，2011）。根据制造商的说明，使用蛋白质电泳仪的凝胶浇铸装置制备10％（w / v）聚丙烯酰胺分离凝胶。＆nbsp;
2. 类似地，准备5％（w / v）聚丙烯酰胺堆积凝胶。
3. 将凝胶装配到电泳装置中并倒入电极缓冲液。
4. 使用块加热器在步骤B14和B15中在95℃下制备的用于SDS-PAGE分析的样品加热5分钟，然后冷却至室温。在25℃下以15,000 x g 旋转约10秒。
5. 每个泳道加入15μl所得样品。类似地加载5μl预染色的分子标记物。
6. 根据制造商的说明，以100-200 V常数进行电泳。
7. 电泳后，将凝胶置于干净的容器中，并使用倒置或跷跷板振荡器在转移缓冲液中摇动10分钟。用甲醇预湿PVDF膜并类似地摇动它。
8. 设置一层三明治，包括色谱纸，凝胶和膜，浸泡在转移缓冲液中。
9. 将三明治放入装有转移缓冲液的Western印迹装置的腔室中。
10. 根据制造商的说明，在4℃的冷室中以100V恒定电泳将蛋白质从凝胶转移至膜30分钟。
11. 将膜置于干净的容器中，用5％（w / v）脱脂乳/ TBS-T浸泡1小时，同时摇动。
12. 在TBS-T中将膜洗涤三次，每次5分钟。
13. 将膜置于干净的容器中，加入1：4,000稀释的一抗（山羊抗RuV多克隆抗体）和2％（w / v）脱脂乳/ TBS-T。
14. 将膜在4℃下孵育过夜，同时摇动。
15. 在TBS-T中将膜洗涤三次，每次5分钟。
16. 将膜置于干净的容器中，加入1：4,000稀释的二抗（HRP-缀合的小鼠抗山羊/绵羊IgG）和2％（w / v）脱脂乳/ TBS-T。
17. 将膜孵育1小时，同时摇动。
18. 在TBS-T中将膜洗涤三次，每次10分钟。
19. 根据制造商的说明，通过将膜与Immobilon Western Chemiluminescent HRP底物或等效试剂一起孵育来产生信号。
20. 根据制造商的说明，使用WSE-6200H LuminoGraph II图像分析仪检测信号。
荧光测量
基于Rho PE的荧光强度分析收集的级分中脂质体的分布。在测量前将收集的级分和2x浓缩的脂质体级分加热至室温。
1. 将50μl每种收集的级分（相当于每种级分的50％）和2x浓缩的脂质体级分（相当于总输入的33％）转移到96孔黑色微孔板的孔中。
2. 使用FLUOstar Optima酶标仪在544 nm激发和终点模式下590 nm发射，根据制造商的说明测量每个孔中Rhod PE的荧光强度，无抖动功能。＆nbsp;
3. 以excel文件格式保存结果。

数据分析

使用图像采集和分析软件可视化收集的部分中的RuV蛋白。 RuV E1（两种包膜糖蛋白之一）和衣壳蛋白的表观分子量分别为58-65kDa和33-38kDa。图3显示了在各种脂质体存在或不存在下，Nycodenz密度梯度分级分离的E1和衣壳蛋白的分布。 RuV颗粒似乎存在于含有两种蛋白质的级分中。致密级分（级分10-12）仅含有衣壳蛋白，表明这些级分中不存在RuV颗粒。尽管在不存在脂质体的情况下RuV颗粒主要在级分6中检测到（图3F），但是在由DOPC / SM /胆固醇组成的脂质体存在下它们转变为级分4（图3A和3A'）。当从反应中省略钙离子时，未观察到向较低密度的转变（图3E），表明RuV颗粒以钙依赖性方式与脂质膜相互作用，与先前的研究一致（Dubé等人< / em>，2014）。此外，当从脂质体中省略SM或胆固醇时，不再观察到这种转变（图3B和3C），并且使用仅由DOPC组成的脂质体（图3D），表明RuV颗粒与脂质膜之间的钙依赖性相互作用。在膜中需要SM和胆固醇。在图3中，显示了与原始文章（Otsuki et al。，2018）中描述的单独实验的结果。从三个独立的实验中获得了类似的结果。

图3.在Nycodenz梯度上RuV蛋白的分布。 RuV抗原（紫外线灭活的RuV颗粒）在有或没有脂质体组合物的情况下，在钙的存在（+）或不存在（ - ）下孵育离子然后在Nycodenz梯度上进行脂质体浮选测定。通过蛋白质印迹分析检测每个级分中的病毒E1和衣壳（C）蛋白。除了图F之外，每个图的字母代码对应于表1中描述的脂质体的字母代码，其表示没有脂质体的结果。所示的值是每μlRuV抗原加入的每种脂质体级分中DOPC，SM和胆固醇（Chol。）的量（nmol）。所有脂质体还含有0.05nmol（每μlRuV抗原）的Rhod PE。星号表示牛血清白蛋白，它是RuV抗原的添加剂。显示了两组独立的离心实验：一组，上四组（A-D），另一组，下三组（A'-F）。在相同条件下（在高灵敏度模式下曝光10分钟）进行图像获取，并且将图像的对比度调整到相同的程度（将上限值设置为40,000并且将下限值设置为零）。图A和A'代表使用具有相同脂质组成和相同实验程序的脂质体的单独实验的结果。在该测定中，病毒蛋白的分布相似，但它们的总体信号强度在实验中变化。尽管整体信号强度不是该测定的主要问题，但这种可变性的可能原因是每种凝胶中的转移效率不稳定。
使用图像分析软件定量衣壳蛋白并确定每个级分中蛋白质的回收率。为此目的，E1蛋白不适合，因为作为RuV抗原的防腐剂添加的大量牛血清白蛋白在输入级分的蛋白质印迹上基本上与E1蛋白重叠。衣壳蛋白的总回收率在约10％至约70％之间变化，实验可能是由于Western印迹分析的半定量性质和/或在超速离心期间或之后蛋白质的降解。我们没有发现脂质体的类型与衣壳蛋白的回收之间存在任何相关性。
为了检查脂质体的分布，使用荧光强度数据计算在每个级分中回收的Rhod PE的％。图4显示了密度梯度级分中脂质体的分布。无论脂质组成如何，在顶部和第二部分中回收大部分脂质体（~70％或更多）。由于漂浮的脂质体不能完全回收，因此在整个分级过程中少量的它们（<10％）保留在水性表面上并在最后的部分中回收。在图4中，显示了与原始文章（Otsuki et al。，2018）中描述的单独实验的结果。从三个独立的实验中获得了类似的结果。

图4.脂质体在Nycodenz梯度上的分布。使用Rhod PE的荧光强度监测脂质体的分布。数值表示为从梯度的每个部分回收的Rhod PE的总荧光强度的百分比（％）。字母代码对应于表1中描述的脂质体。

笔记

Avanti Polar Lipids，Inc。（ https://avantilipids.com/ ）的主页为初学者提供脂质处理信息。
Axis-Shield Density Gradient Media的主页，Alere Technologies AS的品牌（ http://www.optiprep.com/）提供有关Nycodenz的一般信息。
RuV颗粒的峰位置在实验之间大部分是可再现的，但是可以根据各个实验条件的微小差异而变化。因此，应直接比较待比较的样品，离心和分级。

食谱

注意：除非另有说明，以下配方中使用的水是超纯水。

DOPC储备液（5 mg / ml）
1. 将1ml DOPC（50mg / ml，在氯仿中）放入带有螺帽的圆底玻璃管中
2. 用9毫升氯仿/甲醇（19/1，v / v）稀释
3. 用封口膜密封盖子以减少溶剂的蒸发
4. 储存于-30°C并在使用前温热至室温
注意：为了获得DOPC和SM（见下文）储备溶液的摩尔浓度，根据Rouser等人确定溶液中磷的浓度。（1966）。
SM原液（5 mg / ml）
1. 称取50毫克SM（粉末）并放入带有螺帽的圆底玻璃管中
2. 将SM溶于10毫升氯仿/甲醇（19/1，v / v）中
3. 用封口膜密封盖子以减少溶剂的蒸发
4. 储存在-30°C。使用前温热至室温
胆固醇储备溶液（2mg / ml，计算的摩尔浓度：5.17mM）
1. 称取20毫克胆固醇（粉末），放入带螺帽的圆底玻璃管中
2. 将胆固醇溶于10毫升氯仿/甲醇（19/1，v / v）中
3. 用封口膜密封盖子以减少溶剂的蒸发
4. 储存在-30°C。使用前温热至室温
TBS
25mM Tris-HCl pH 7.4
137 mM NaCl
2.68 mM KCl
1. 将2.5ml 10x TBS加入50ml离心管中
2. 用水填充至25毫升并充分混合
为了制备含有1 mM CaCl 2 （TBS-Ca）的TBS，在加水前加入125μl0.2M CaCl 2
储存在4°C
2x TBS
在2 ml微量离心管中用1.6 ml水稀释400μl10xTBS
为了制备2x TBS-Ca，加入20μl0.2MCaCl 2 （终浓度：2mM）并充分混合
储存在4°C
80％（w / v）Nycodenz / TBS
1. 将8克Nycodenz用热水溶解在15毫升离心管中注意：需要时间将少量Nycodenz溶解在少于10毫升的水中。使用通过微波预热的热水并密集混合。偶尔用热自来水加热管子。如果出现难以熔化的团块，请在浴式超声波仪中通过超声破碎它们。
2. 加入1毫升10倍TBS，加水至10毫升。充分混合并在4°C下储存。
3. 使用前，将适量的溶液转移到2.0毫升的微量离心管中，加入1/100体积的100倍蛋白酶抑制剂混合液。好好混合。
为了制备80％（w / v）Nycodenz / TBS-Ca，还加入1/200体积的0.2M CaCl 2 （终浓度：1mM）并充分混合
30％（w / v）Nycodenz / TBS
1. 将3克Nycodenz溶解在15毫升离心管中的热水中
2. 加入1毫升10倍TBS
3. 用水填充至10毫升并充分混合。储存在4°C
4. 使用前，将适量的溶液转移到2.0毫升的微量离心管中，加入1/100体积的100倍蛋白酶抑制剂混合液。好好混合
为了制备30％（w / v）Nycodenz / TBS-Ca，还加入1/200体积的0.2M CaCl 2 （终浓度：1mM）并充分混合
3x SDS样品缓冲液
1. 将以下组分混合在15毫升离心管中：
  4.5毫升甘油（终浓度：30％（v / v））
  2.25毫升1M DTT（终浓度：150 mM）
  在50％（v / v）乙醇中加入1.5ml 1％（w / v）溴酚蓝（终浓度：0.1％[w / v]）
  2.81毫升1M Tris-HCl pH 6.7（终浓度：187.5 mM）
2. 使用管旋转器溶解0.9g SDS（终浓度：6％[w / v]）
3. 用水补充至15毫升并充分混合
4. 储存于-30°C并在37°C温热，以在使用前溶解SDS
10％（w / v）聚丙烯酰胺分离凝胶溶液
1. 将以下组分混合在50毫升离心管中：
  8.28毫升水
  11.25ml 1M Tris-HCl pH 8.8（终浓度：375mM）
  10毫升30％（w / v） - 丙烯酰胺/双混合溶液
  300μl10％（w / v）SDS（终浓度：0.1％[w / v]）
  300μl10％（w / v）APS（终浓度：0.1％[w / v]）
2. 加入15μlTEMED（终浓度：0.05％[v / v]）并充分混合
3. 立即倒入凝胶铸造设备
注意：这个体积足以容纳两个宽的迷你凝胶。
5％（w / v）聚丙烯酰胺堆积凝胶溶液
1. 将以下组分混合在15毫升离心管中：
  6.92毫升水
  1.25ml 1M Tris-HCl pH 6.7（终浓度：125mM）
  1.67毫升30％（w / v） - 丙烯酰胺/双混合溶液
  100μl10％（w / v）SDS（终浓度：0.1％[w / v]）
  100μl10％（w / v）APS（终浓度：0.1％[w / v]）
2. 加入10μlTEMED（终浓度：0.1％[v / v]）并充分混合
3. 立即浇铸在分离凝胶上
注意：此体积足以容纳两个宽的迷你凝胶。
10x Tris / Glycine
1. 将121g Tris和576g甘氨酸溶于约3L水中
2. 用水充满4升并充分混合
3. 在室温下储存
电极缓冲器
1. 用约800毫升水稀释100毫升10倍Tris /甘氨酸
2. 加入10毫升10％（w / v）SDS
3. 用水补充至1升并充分混合
4. 在室温下储存
转移缓冲区
1. 用1.4L水稀释200ml 10x Tris /甘氨酸
2. 加入400毫升甲醇并充分混合
3. 保持在冰上或4°C
注意：加水前不要将甲醇加入10x Tris /甘氨酸中。混合物变混浊。
TBS-T
1. 用少于900毫升的水稀释100毫升10倍TBS
2. 加入5毫升20％（w / v）吐温20，使最终浓度为0.1％（w / v）
3. 用水补充至1升并充分混合
4. 储存于4°C并在使用前温热至室温
5％（w / v）脱脂牛奶/ TBS-T
使用管式旋转器将2.5 g脱脂牛奶溶解在50 ml离心管中的50 ml TBS-T中
注意：将管混合至少1小时以完全溶解。在使用当天做好准备，并在4°C下储存。在2天内使用。
2％（w / v）脱脂牛奶/ TBS-T
用管式旋转器将1克脱脂牛奶溶解在50毫升TBS-T的50毫升离心管中。
注意：将管混合至少1小时以完全溶解。在使用当天做好准备，并在4°C下储存。在2天内使用。

致谢

该协议已在Otsuki et al。，2018中使用。该研究得到了AMED-CREST（日本医学研究与开发机构，进化科学与技术核心研究机构）的KH资助，授权号：JP18gm0910005）。该协议改编自Busse 等人的工作（2013）。作者声明他们没有利益冲突。

参考

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