材料和试剂

移液器吸头（Corning，Axygen ®，目录号：T-300）
盖玻片（VWR，目录号：631-0150）
50毫升离心管（Corning，目录号：430828）
15毫升离心管（Corning，目录号：430790）
75 cm 2 烧瓶（Corning，目录号：430641U）
24孔板（Corning，Costar ®，目录号：3524）
40μm细胞过滤器（Corning，Falcon ®，目录号：352340）
10毫升血清移液管（康宁，目录号：4488）
3 kD离心过滤装置（默克，产品型号：UFC500324）
30 kD离心过滤器（Merck，目录号：UFC503024）
用过滤器组装的柱（在GST-标签蛋白质纯化试剂盒中）（Beyotime Biotechnology，目录号：P2262）
0.22μm过滤器（Merck，Millex，目录号：SLGP033RB）
氨苄西林（Sigma-Aldrich，目录号：BP021）
大肠杆菌菌株BL21（DE3）（在1.5 ml低温小瓶中100μl，TIANGEN Biotech，目录号：CB105）
pGEX-4T-2-GST（Obio技术）
20只C57BL / 6出生后第1天小鼠（Charles River Laboratories）没有性别偏好
Dulbecco改良的Eagle's medium-F12（GE Healthcare，Hyclone TM ，目录号：SH30023.01）
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10099141）
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：62971）
DNase1（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：18068015）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：04693132001）
谷胱甘肽Sepharose TM 4B（GE Healthcare，目录号：17043001）
Bicinchoninic acid assay（BCA）试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23225）
青霉素链霉素100x溶液（GE Healthcare，Hyclone TM ，目录号：SV30010）
聚L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）（Sigma-Aldrich，目录号：P1399）
细胞松弛素D（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录编号：ab143484）
皂甙（西格玛奥德里奇，目录号：47036）
抗myc抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：SC789）
Alexa Fluor594山羊抗小鼠IgG（H + L）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11007）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Vector Laboratories，目录号：H-1200）
PBS（ZSGB-BIO，目录号：ZLI-9062）
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021B）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：V900058）
胰蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0042B）
琼脂糖（Biowest，目录号：111860）
凝血酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4648）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
KCl（MODERN ORIENTAL FINE CHEMISTRY，目录号：JC-AR20140011）
Na 2 HPO 4 （北京化工厂，目录号：A1060056）
KH 2 PO 4 （北京化工厂，产品型号：A1049020）
SDS（GE Healthcare，目录号：17131301）
4％多聚甲醛（ALADDIN，目录号：C104188）
Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：V900502）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：B2064）
指甲油（USHINE）
LB培养基（选择板）（见食谱）
LB培养基（1升）（见食谱）
0.01 M PBS（pH 7.4,1 L）（参见食谱）
缓冲液A（pH 7.5）（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf，型号：Research ® plus，目录号：3120000062）
手术器械：眼科剪刀，弯曲眼科钳
干浴（VIVO，目录号：VHD150S）
细胞培养CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：3131）
振动筛（上海Meditry仪器，目录号：THZ-C-1）
离心机（Eppendorf，型号：5430 R）
Rotator（Cole-Parmer，Stuart，目录号：SB3）
4°C Revco TM 高性能实验室冰箱（赛默飞世尔科技，目录号：REC3004V）
立体显微镜（ZEISS，型号：Axio Vert.A1）
超声波处理器（Cole-Parmer，目录号：CN-04714-50）
共聚焦显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP8）
生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，目录号：51026654）
Eppendorf BioPhotometer（Eppendorf，目录号：6133000044）

软件

NIH ImageJ（ http://fiji.sc/ ）
SPSS软件（SPSS 16.0，Chicago，IL）

程序

α-突触核蛋白预先形成的原纤维制剂
1. 将重组人α-突触核蛋白与N末端的myc标签亚克隆至pGEX-4T-2-GST
  1. 对于α-突触核蛋白序列（GenBank：CR457058.1），请参阅补充文件。
  2. 将EcoR IH和Xba I限制酶位点分别加入到α-突触核蛋白-myc 的5'和3'末端，并用于将编码α-突触核蛋白的基因亚克隆到质粒pGEX-4T-2中-GST。
  3. 序列确认正确克隆并分离质粒（pGEX-4T-2-GST-α-突触核蛋白-myc）。＆nbsp;
2. E中蛋白质表达的转化和诱导。大肠杆菌
  1. 在冰上解冻10μl大肠杆菌 BL21（DE3）。
  2. 向细胞中加入1μg-100ng环状质粒DNA（pGEX-4T-2-GST-α-突触核蛋白-myc）并轻轻混合。平行地，用质粒pGEX-4T-2-GST转染BL21作为阴性对照。
  3. 将混合物在冰上孵育30分钟。
  4. 在干浴中在42℃下热冲击60-90秒。
  5. 将细胞在冰上冷却5分钟。
  6. 将细胞铺板到选择板（配方1）上并在37℃下孵育过夜。
  7. 在含有100μg/ ml氨苄青霉素的3ml LB培养基（配方2）中挑取一个单克隆和培养物，并在37℃，250rpm振荡过夜。
  8. 将3ml培养物转移至含有100μg/ ml氨苄青霉素的0.5L LB培养基中，并在37℃，250rpm振荡2-3小时（当OD 600 为0.5-0.7时）。
  9. 将培养物冷却至室温并加入0.1mM IPTG，在室温下以250rpm摇动4-6小时。
3. α-突触核蛋白单体纯化
  1. 通过在4℃下以5,000×g离心15分钟收集细胞并弃去上清液。用冷的10ml 0.01M PBS（配方3）洗涤沉淀物三次。
  2. 用含有80μl25mMEDTA，500μl10mg/ ml溶菌酶，20μl1U/μlDNase1,100μl100mMPMSF和1x蛋白酶抑制剂的冷10ml 0.01M PBS（pH7.4）重悬细胞沉淀。
  3. 在冰上超声处理细胞5分钟（参数：2秒持续时间，2秒间隔，350W）。在Eppendorf离心机中以10,000℃离心，4℃离心25分钟，并将上清液收集到50ml管中。
  4. 将200μl谷胱甘肽琼脂糖珠加入装有过滤器的柱子中，移至4°C冰箱冷却。
  5. 用冷的10ml 0.01M PBS（pH 7.4）在4℃洗涤珠子三次。
  6. 将珠子与细胞裂解物在4℃孵育过夜。
  7. 用冷的10ml 0.01M PBS（pH7.4）洗涤珠子三次。
  8. 加入含有25U凝血酶的3ml 0.01M PBS（pH7.4），在室温下以20rpm在旋转器上从珠中切割α-突触核蛋白4小时。
  9. 将裂解的蛋白质收集在冰上的15ml Falcon管中。
  10. 使用30 kD离心过滤装置去除30 kD以上的蛋白质聚集体。在4℃下以4,000 x g 离心5分钟。收集通过过滤器单元的部分。
  11. 通过0.22μm过滤器过滤灭菌。
  12. 使用3 kD离心过滤装置浓缩α-突触核蛋白。在4℃下以4,000 x g 离心15-25分钟（直至剩余体积达到400μl）。
  13. 加入缓冲液A（配方4）并在4,000 x g 下在4°C离心15-25分钟以更换缓冲液。收集约400μl蛋白质。
  14. 通过BCA测定法测量α-突触核蛋白的蛋白质浓度。蛋白质的产量约为3-5mg / ml，它们将用于计算预先形成的原纤维浓度。将蛋白质样品每200μl等分至500μlEP管中，通过液氮快速冷冻，并储存在-80℃。
4. α-突触核蛋白预先形成原纤维形成
  1. 在37℃，1,000rpm摇动2mg /mlα-突触核蛋白单体5天，得到α-突触核蛋白预形成的原纤维。
  2. 双戴手套。在II类生物安全柜中，在冰上超声处理α-突触核蛋白原纤维（参数：2秒持续时间，2秒间隔，350W）1分钟。最后，使用1％SDS溶液清洁和灭活生物安全柜中的原纤维。
    注意：＆nbsp;
    1. 在-80°C下快速冷冻α-突触核蛋白原纤维以备将来使用。
    2. 1x蛋白酶抑制剂：每50 ml提取液1片。
原代小胶质细胞培养
注意：＆nbsp;
1. 在出生后第1天没有性别偏好的20只C57BL / 6小鼠用于小胶质细胞培养。通过断头处死小鼠。
2. 涂覆烧瓶和平板：在通风橱中，每75 cm 2 烧瓶，或每杯盖24孔板用200μl溶液。轻轻摇动以确保均匀涂覆培养表面。 30分钟后，抽吸除去溶液，用无菌双蒸水彻底冲洗表面3次。让它们在使用前至少干燥两小时。
1. 在剪刀的帮助下解剖大脑，然后将大脑置于含有10ml冷DMEM / F12培养基的10cm 2 培养皿中。
2. 在立体显微镜下剥离脑膜并将脑转移到含有20ml DMEM / F12培养基的50ml Falcon管中。
3. 通过用10ml血清移液管重复移液来解离脑组织。将1毫升尖端放在血清移液管上并移液15次。将200μl尖端放在1 ml尖端上并移液5次。
4. 通过40μm细胞过滤器过滤细胞混合物。
5. 在室温下以400 x g 离心5分钟。
6. 弃去上清液，用含有10％热灭活的胎牛血清，1％青霉素 - 链霉素的DMEM / F12培养基补充物重悬沉淀。
7. 将10ml细胞混合物置于PLL涂覆的75cm 2 烧瓶中，密度为每瓶2.5个脑。
8. 将细胞在37℃下用湿润的5％CO 2 ，95％空气培养箱孵育。
9. 第二天用10ml血清移液管彻底改变培养基，然后每三天更换一半培养基。
10. 两周后，通过在摇床中在37℃下以180rpm摇动2小时从培养基中收获小胶质细胞。
11. 在具有盖玻片的PLL涂覆的24孔板中以每孔5×10 4个细胞铺板小胶质细胞并在实验前培养24小时。
吞噬作用测定
1. 将α-突触核蛋白预先形成的原纤维加入小胶质细胞培养物中，终浓度为200nM，并在37℃下在潮湿的5％CO 2 95％空气培养箱中孵育2小时。
2. 用500μl/孔冷PBS洗去细胞外α-突触核蛋白预先形成的原纤维三次，每次5分钟。
3. 为阻断小胶质细胞吞噬作用，加入终浓度为3μM的细胞松弛素D，并在吞噬作用前孵育1小时。
免疫荧光分析
1. 用0.01M冷PBS洗涤细胞两次。
2. 用PBS中稀释的4％多聚甲醛在室温下固定小胶质细胞30分钟。
3. 用500μl/孔0.01M PBS洗涤细胞3次，室温下5分钟/次。
4. 通过在0.01M PBS中稀释的500μl/孔0.3％Triton TM X-100将细胞渗透5分钟。
5. 弃去Triton TM X-100并用500μl封闭缓冲液/孔（2％牛血清白蛋白，PBS中0.02％皂苷）在室温下封闭1小时。
6. 与小鼠抗myc抗体在4℃孵育过夜（在封闭缓冲液中1：200稀释，每个盖玻片30μl）。
7. 用500μl封闭缓冲液/孔洗涤，10分钟/次，在室温下洗涤3次。
8. 在室温下与二抗Alexa Fluor594山羊抗小鼠IgG（H + L）孵育1小时（在封闭缓冲液中1：200稀释，每个盖玻片30μl）。
9. 用500μl封闭缓冲液/孔洗涤2次，500μl/孔PBS洗涤1次，室温下10分钟/次。
10. 使用5μl含DAPI的安装溶液在载玻片上安装盖玻片。
11. 用指甲油密封盖玻片，并在4°C的黑暗中储存。
12. 通过共聚焦显微镜获取DIC和荧光图像，使用63x油浸镜头（图1），并使用NIH ImageJ分析图像。
  
  图1.α-突触核蛋白被原代小胶质细胞吞噬。α-突触核蛋白预先形成的原纤维由myc抗体（红色斑点）显示，有或没有吞噬作用抑制剂，细胞松弛素D（CD，3μM）。比例尺=10μm。
13. 每个细胞都有轮廓，每个细胞的总荧光强度用于量化α-突触核蛋白的摄取（图2）。
  
  图2.使用ImageJ绘制单个单元格区域。徒手选择工具用于根据DIC图像勾画单元格。

数据分析

ImageJ用于定量α-突触核蛋白摄取。手绘选择工具用于根据DIC图像勾勒出单元格。分析测量用于测量单个小胶质细胞中的总荧光强度。在每个实验中，每种情况都会对大约60个细胞进行分析。
实验独立地进行至少三次。通过SPSS软件（SPSS 16.0，Chicago，IL）分析结果。使用单向ANOVA进行统计分析。 P 值＆lt; P 值差异被认为是显着的。 0.05。

食谱

LB培养基（选择平板，1 L）
酵母提取物5克
琼脂糖15克
NaCl 10克
胰蛋白胨10克
高压灭菌后，加入100μg/ ml氨苄青霉素
LB培养基（1升）
酵母提取物5克
NaCl 10克
胰蛋白胨10克
0.01 M PBS（pH 7.4,1 L）
NaCl 8.0 g
KCl 0.2克
Na 2 HPO 4 1.44 g
KH 2 PO 4 0.24 g
加入无菌蒸馏水至1升
缓冲液A（pH 7.5）
50 mM Tris-HCl
150 mM KCl

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（31471085），北京市自然科学基金项目和北京市教育委员会科研重点项目（KZ201510025023），北京市教育委员会科研共同项目（KM201610025014）的资助。），北京市科学与技术技术委员会（No. Z161100002616007），国家重点研究发展计划（2016YFC1306300），国家自然科学基金重点项目（81527901）。该协议改编自Du 等人（2017）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

Du，C.，Wang，Y.，Zhang，F.，Yan，S.，Guan，Y.，Gong，X.，Zhang，T.，Cui，X.，Wang，X。和Zhang，CX（2017 ）。 Synaptotagmin-11抑制小胶质细胞中的细胞因子分泌和吞噬作用。 Glia 65（10）：1656-1667。
Fu，R.，Shen，Q.，Xu，P.，Luo，J。J. and Tang，Y。（2014）。中枢神经系统疾病中小胶质细胞的吞噬作用。 Mol Neurobiol 49（3）：1422-1434。
Kettenmann，H.，Hanisch，U。K.，Noda，M。和Verkhratsky，A。（2011）。小胶质细胞生理学。 Physiol Rev 91（2）：461-553。
Luk，K.C.，Kehm，V。M.，Zhang，B.，O'Brien，P.，Trojanowski，J。Q. and Lee，V。M.（2012）。病理性α-突触核蛋白的脑内接种在小鼠中引发快速进展的神经变性α-突触核蛋白病。 J Exp Med 209（5）：975-986。
Wolf，S。A.，Boddeke，H。W.和Kettenmann，H。（2017）。生理和疾病中的小胶质细胞。 Annu Rev Physiol 79 ：619-643。