材料和试剂

35毫米和60毫米培养皿（35毫米：Tarsons，目录号：460035; 60毫米：Tarsons，目录号：460061）
吊具（Tarsons，目录号：920081）
99.99％铂丝（Sigma-Aldrich，目录号：267201）
℃。线虫：N2（野生型蠕虫）（明尼苏达大学，Caenorhabditis遗传中心）和 casy-1（tm718）（日本国家生物资源项目）
大肠杆菌 OP50（明尼苏达大学，Caenorhabditis遗传中心）
戊四唑（PTZ）（Sigma-Aldrich，目录号：P6500）
乙醇（乙醇绝对，ACS-ISO级）（默克，目录号：100983）
胆固醇（SRL Sisco Research Laboratories，目录号：54181）
氯化钙二水合物（CaCl 2 •2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）
硫酸镁（MgSO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P5379）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P8281）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
Bacto-agar（HiMedia Laboratories，目录号：GRM026）
Bacto-peptone（SRL Sisco Research Laboratories，Bacto TM ，目录号：95292）
100 mg / ml PTZ原液（见食谱）
5毫克/毫升胆固醇（见食谱）
1 M CaCl 2 原液（参见配方）
1 M MgSO 4 储备液（参见配方）
1 M KPO 4 ，pH 6.0原液（参见配方）
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf，型号：Research ® plus，目录号：2231000224）
2升玻璃锥形瓶（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：2121763）＆nbsp;
高压灭菌器（Equitron-7431 SLEFA）
显微镜（蔡司，型号：Stemi 2000 C）

软件

GraphPad Prism v6（GraphPad软件）

程序

用于 C的常规生长和维护。线虫，见Wormbook章节 C的维护。线虫（Stiernagle，2006）。保持 C.线虫菌株用于在没有污染的平板中的测定中。
在测定前至少一天制备含有3ml培养基的新鲜35mm线虫生长培养基（NGM）平板（参见配方），并在4℃下储存直至使用。
种子常规60毫米NGM琼脂平板用于15μl E的日常维护。在测定前两天，在无菌条件下在细菌培养基中测定大肠杆菌OP50。让板在室温下干燥。
使用由铂丝制成的镐（在Stiernagle，2006中描述）将约20-30个L4阶段野生型（WT），N2和突变体菌株置于接种有 E的60mm NGM板上。大肠杆菌 OP50，让蠕虫在20°C下生长约20小时。
在测定当天，从4°C取出35 mm NGM板并使其达到室温。在板的中心移取300μl100mg/ ml PTZ储备溶液并将其均匀地铺展在整个NGM表面上以获得10mg / ml的终浓度。在盖子关闭的情况下让板干燥35分钟。保持相同数量的不带PTZ的35 mm NGM板可用作实验中的对照。在对照板上涂抹300μl乙醇，以避免因乙醇暴露而导致的行为改变。将板干燥后，加入10μl浓缩的 E滴。在板的中心处将大肠杆菌OP50（通过离心浓缩的过夜培养物）在室温下干燥至少2小时。现在这些板已准备好进行测定。
将来自步骤4的每种基因型的10-15个蠕虫转移到对照和含有PTZ的平板上的食物板上的中心。在室温（~23°C）下将板保持不受干扰30分钟。
观察 C。 30分钟后，线虫。计算平板上动物的总数和 C的数量。线虫表现出前痉挛或“头部痉挛”（图2A）。野生型 C.线虫显示对PTZ暴露没有反应（Thapliyal中的S1电影 et al。，2018）。虽然GABA能突触传递缺陷的突变体显示高度抽搐（Thapliyal中的S2电影 et al。，2018）。人们还可以观察 C.线虫在60分钟的间隔后进行二读（可选）。这些录音也在室温（~23°C）下完成。

图2. casy-1 突变体与WT相比显示出增加的惊厥 C.线虫即可。 casy-1 突变体与WT动物相比，对GABA受体拮抗剂PTZ显示出更高的敏感性。 A.代表性静止框架图像，展示 casy-1 突变体 C. elegan s前痉挛（头部痉挛）和尾部收缩表型。静止帧图像是来自电影的代表帧（7帧/秒）。 B.该图显示了在暴露于10mg / ml PTZ 30分钟和60分钟后显示前部“头部突起”的动物部分。通过在GABA能神经元中表达 casy-1 同种型而不在胆碱能神经元或肌肉中表达，可以完全挽救对PTZ的敏感性。进行至少三次测定（~15 C.elegans /测定）。显示了与WT动物显着不同的值（***表示 P <0.0001，使用双向ANOVA）。数据表示为平均值±S.E.M。图2A和图2B的一部分先前已在（Thapliyal et al。，2018）中发表。
在本实施例中， casy-1 代表细胞粘附分子，据报道其调节GABA能运动神经元中的囊泡运输（Thapliyal 等，，2018）。 casy-1 突变体中突触前末端的GABA释放减少，这可以通过PTZ暴露后突变体的高度抽搐容易地解释。

数据分析

计算 C的百分比。线虫使用下面给出的公式在30和60分钟时间点在每个板上显示抽搐：
软件：GraphPad Prism v6。
使用具有3个重复值的分组图来绘制结果。每次测定使用每种基因型至少10-15个蠕虫。在不同的日子重复该测定两次（总共3次试验）并报告统计的总结，如图2B所示。
统计分析：双向ANOVA用于确定统计 P 值。

笔记

作为避免偏倚的标准科学程序，实验者应该对测试 C的基因型不知情。线虫。理想情况下，实验室的同事可以对这些板进行编号，以防止实验者识别基因型。对于具有视觉表型缺陷的突变体，必须添加具有相似表型缺陷且与研究内容无关的额外突变体系。
C的灵敏度。根据实验条件（室温，湿度等）的变异性或从公司获得的PTZ库存的差异，线虫到PTZ可能会发生变化。但是，实验的整体读数通常保持不变。
在我们的手中，在 C中观察到更多的抽搐变异性。线虫含有染色体外阵列（救援线）。这可能是由于阵列线的差异造成的，不应该归结为一种普遍现象。

食谱

100 mg / ml PTZ Stock Solution
将100毫克PTZ溶于1毫升体积的无水乙醇中在每次实验之前新鲜制备该溶液
5毫克/毫升胆固醇
在100ml 95％乙醇中加入500mg胆固醇，并在室温下在旋转器上旋转混合。解散需要几个小时储存在4°C
1 M CaCl 2 原液
将14.7克CaCl 2 •2H 2 O溶解在100毫升ddH 2 O中并在121℃下高压灭菌15分钟
储存在4°C
1 M MgSO 4 原液
将12.04g MgSO 4 溶解在100ml ddH 2 O中并在121℃下高压灭菌15分钟
储存在4°C
1 M KPO 4 ，pH 6.0储备溶液
1. 在500ml ddH 2中混合108.3g KH 2 PO 4 和35.6g K 2 HPO 4 0
2. 通过添加NaOH将pH调节至6.0，最后将体积补足至1L
3. 将溶液等分并在121℃下高压灭菌15分钟
4. 储存在4°C
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板
1. 在2L烧瓶中，在975ml ddH 2 O中加入3g NaCl，16g Bacto-琼脂和2.5g Bacto-peptone。
2. 在121℃下高压灭菌50分钟
3. 让NGM琼脂冷却至55-60°C。加入1毫升5毫克/毫升胆固醇，1毫升1M CaCl 2 ，1毫升1M MgSO 4 和25毫升1M KPO 4 ，pH 6.0

致谢

该方案改编自Thapliyal 等人（2018）。 ST感谢科学与工业研究理事会（CSIR）的研究生奖学金。 KB是DBT-Wellcome Trust India Alliance的中级研究员，并感谢联盟提供资金支持（资助号为IA / 12/500516）。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突或竞争利益。

参考

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