材料和试剂

材料
1. 6孔细胞培养板（Corning，目录号：3506）
2. 12孔细胞培养板（Corning，目录号：3512）
3. 24孔细胞培养板（Corning，目录号：3524）
4. 移液器吸头（Neptune Scientific，目录号：BT20，BT200和BT1250）
5. 带盖的1.5毫升管（INA•OPTIKA，目录号：ST-0150F）
细胞
1. RK13细胞：这些细胞是北里研究所的礼物。
  注意：这些细胞维持在Eagle含有8％牛血清（BS）的最低必需培养基（MEM）（见食谱）中。
2. Vero细胞：我们先前存在的库存最初来自美国典型培养物保藏中心，并在我们的实验室中维护了20多年。
  注意：这些细胞维持在含有5％胎牛血清（FBS），100单位/ ml青霉素和100μg/ ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。
病毒
1. ＆nbsp;风疹病毒（RuV）TO-336疫苗株（Takeda Pharmaceutical）（Otsuki et al。，2011）
2. RuV RVi / Hiroshima.JPN / 01.03野生型菌株（Otsuki et al。，2011; Sakata et al。，2014）
3. 表达绿色荧光AG1蛋白的重组RuV RVi / Hiroshima.JPN / 01.03菌株（rHS / p150-AG1）（先前在Sakata 等人报道，2014）
4. 表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组麻疹病毒（MeV）和人间质肺病毒（HMPV）（分别为MeV-IC323 / Ed-H-EGFP和HMPV-rJPS02-76EGFP）（之前在Seki 等报道）。，2006和Shirogane et al。，2008）
  注意：
  1. TO-336疫苗株和RVi / Hiroshima.JPN / 01.03野生型菌株在RK13细胞中繁殖。重组rHS / p150-AG1在Vero细胞中繁殖。 MeV和HMPV分别在Vero / hSLAM细胞（Ono等，2001）和Vero / TMPRSS2细胞（Shirogane等，2008）中繁殖。
  2. 病毒在使用前用MEM稀释。＆nbsp;
RuV病毒样颗粒（RuV-VLP）
RuV-VLP，其基因组编码 Renilla 荧光素酶和AG1报告基因，如前所述（Sakata et al。，2014）产生并浓缩，并进行了一些修改（Otsuki et al。，2018）。
试剂
1. Eagle的MEM“Nissui”1（NISSUI PHARMACEUTICAL，目录号：05900）
2. Dulbecco改良的Eagle's培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D5796）
3. Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14190144）
4. 胎牛血清（Biowest，目录号：S1780-500）
5. 牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：16170078）
6. 青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15140122）
7. L-谷氨酰胺（200 mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25030081）
8. 琼脂糖ME（IWAI CHEMICALS，目录号：50013R）
9. 7.5％碳酸氢钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25080094）
10. 来自蜡状芽孢杆菌的鞘磷脂酶（Sigma-Aldrich，目录号：S9396）
11. 中性红溶液（0.33％）（Sigma-Aldrich，目录号：N2889）
12. Renilla 荧光素酶检测系统（Promega，目录号：E2810）
  注意：此试剂盒中包含裂解缓冲液和Renilla荧光素酶检测试剂。
13. MEM（见食谱）
14. 2x MEM（见食谱）
15. 含有2％BS（或FBS）和0.5％（或0.4％）琼脂糖的MEM（参见食谱）
16. MEM含有0.01％中性红和0.5％琼脂糖（见食谱）

设备

微量移液管（Gilson，型号：P10，P200，P1000，目录号：F144802，F123601，F123602）
发光计（Promega，型号：GloMax ® 20/20）
高压灭菌器（TOMY SEIKO，型号：ES-215）
生物安全柜（空气技术）
细胞培养箱（35°C和37°C，5％CO 2 ）（Thermo Fisher Scientific，Forma，型号：310）
荧光显微镜（蔡司，型号：Axio Observer D1）
细胞培养显微镜（奥林巴斯，型号：CKX53）

程序

分析SMase处理对RK13细胞中病毒感染性的影响（图1A）。

图1.实验流程。 A.分析SMase对RK13细胞中病毒感染性的影响。 B.分析SMase对Vero细胞中病毒感染性的影响。 C.分析SMase治疗对VLP感染的影响。
1. 将浓度为250,000个细胞/ ml的3ml RK13细胞悬浮液接种到6孔板的每个孔中。
2. 将细胞在37℃，5％CO 2 的细胞培养箱中孵育。
3. 细胞形成单层后（接种后3-4天），用DPBS洗涤细胞一次，然后加入1ml含有30或150mU / ml SMase或1ml MEM作为未处理对照的MEM。 br /> 注意：较高浓度（> 150 mU / ml）会导致细胞损伤。较低浓度（<30mU / ml）也显示出剂量依赖性效应，但难以为再现结果设定完美的实验条件。
4. 将细胞在37℃，5％CO 2 的细胞培养箱中孵育1小时。
5. 用DPBS洗涤细胞两次。（洗涤后取下DPBS）
6. 加入0.1ml含RuV的溶液，浓度为300-800噬斑形成单位/ ml。＆nbsp;
7. 将细胞与病毒溶液在室温下孵育1小时，每15分钟轻轻搅拌一次。
8. 除去病毒溶液，用MEM洗涤细胞两次以去除未结合的病毒。（洗涤后取下MEM）
9. 加入3ml含有2％BS和0.5％琼脂糖的MEM。
10. 将细胞在35℃，5％CO 2 的细胞培养箱中孵育7天。
11. 加入1毫升含有0.01％中性红和0.5％琼脂糖的MEM。
12. 在35℃，5％CO 2 的细胞培养箱中孵育2至3天。
13. 用肉眼计算斑块的数量（图2）。
  注意：通常，斑块在2天内可见，但孵育3天后它们可能会更清晰。
  
  图2.SKase处理对RK13细胞中RuV感染的影响使用RK13细胞的噬斑测定，其未经处理或在感染前用30或150mU / ml的SMase处理1小时。用TO-336疫苗株（上图）或RVi / Hiroshima.JPN / 01.03野生型菌株（下图）通过中性红染色显示感染后第9天的细胞中的噬菌体（Otsuki 等人。，2018）。
分析SMase处理对Vero细胞病毒感染性的影响（图1B）。
1. 将浓度为300,000个细胞/ ml的1ml Vero细胞悬浮液接种到12孔板的每个孔中。
2. 将细胞在37℃，5％CO 2 的细胞培养箱中孵育。
3. 细胞形成单层后（接种后16-36小时），用DPBS洗涤细胞一次，然后加入0.5ml含有30或150mU / ml SMase或0.5ml DMEM的DMEM作为未处理对照。（洗涤后取下DPBS）
4. 将细胞在37℃，5％CO 2 的细胞培养箱中孵育1小时。
5. 用DPBS洗涤细胞两次。（洗涤后取下DPBS）。
6. 加入0.1ml含有RuV rHS / p150-AG1，MeV-IC323 / Ed-H-EGFP或HMPV-rJPS02-76EGFP的病毒溶液，浓度为300-1000个荧光聚焦形成单位/ ml。＆nbsp;
7. 将细胞与病毒溶液在室温下孵育1小时，每20分钟轻轻搅拌一次。
8. 除去病毒溶液，用MEM洗涤细胞两次以去除未结合的病毒。（洗涤后取下MEM）
9. 加入1ml含有2％FBS和0.4％琼脂糖的MEM。
10. 将细胞在35℃，5％CO 2 的细胞培养箱中孵育6天。
11. 使用荧光显微镜计数表达AG1或EGFP的病灶数量（图3）。
  
  图3.用重组病毒感染的Vero细胞的荧光图像。 Vero细胞用表达绿色荧光蛋白的重组风疹病毒（RuV-rHS / p150-AG1）（左），麻疹病毒（MeV）感染-IC323 / Ed-H-EGFP）（中心）或人偏肺病毒（HMPV-rJPS02-76EGFP）（右）。在感染后6天拍摄图像。比例尺代表50微米。
分析SMase治疗对VLP感染的影响（图1C）。
1. 将浓度为300,000细胞/ ml的0.5ml Vero细胞悬浮液接种到24孔板的每个孔中。
2. 将细胞在37℃，5％CO 2 的细胞培养箱中孵育。
3. 细胞形成单层后（接种后24小时），用DMEM洗涤细胞一次。（洗涤后取下DMEM）
4. 加入0.1ml含RuV-VLP的溶液，浓度为50,000荧光焦点形成单位/ ml。
5. 将细胞与RuV-VLP溶液在4°C（冰上）孵育2小时，每30分钟轻轻搅拌一次。
6. 用DMEM洗涤细胞，将其预冷至4℃，两次。（洗涤后取下DMEM）
7. 加入0.5毫升DMEM。
8. 将细胞在37℃，5％CO 2 的细胞培养箱中孵育。
9. 紧接其后或在20,60或120分钟后，用0.5ml补充有150mU / ml SMase的DMEM替换培养基。
10. 将细胞在35℃，5％CO 2 的细胞培养箱中孵育3天。
11. 用DPBS洗涤细胞一次，加入50μl裂解缓冲液。（洗涤后取下DPBS）
12. 在室温下孵育10分钟。
13. 将细胞裂解物转移到1.5ml管中。
14. 在新的1.5 ml管中制备50μl Renilla 荧光素酶测定试剂，并将10μl细胞裂解液加入含有 Renilla 荧光素酶测定试剂的试管中。
15. 用手指轻弹管即可快速混合。
16. 将管放入发光计中以测量发光。

数据分析

每个测定应一式两份进行以计算斑块或病灶的平均数（或荧光素酶活性的平均值）。测定应独立重复至少三次，以显示样品之间的统计学差异。
每种测定的病毒滴度（或荧光素酶活性）的百分比计算如下：

病毒滴度（或荧光素酶活性）的百分比（％）= A / B×100

其中，A =斑块或病灶的平均数（或荧光素酶活性的平均值），
B =未处理对照中平均斑块或焦点的平均数（或荧光素酶活性的平均值）。

笔记

应仔细计算RuV rHS / p150-AG1在Vero细胞中的病灶，因为RuV rHS / p150-AG1的病灶很小并产生弱荧光（图3）。

食谱

MEM
1. 将9.4g Eagle's MEM“Nissui”1溶于1,000ml dH 2 O中，用高压灭菌器灭菌。
2. 然后在室温下冷却
3. 加入青霉素，链霉素，L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，终浓度分别为100单位/ ml，100μg/ ml，2mM和0.11％。
2x MEM
1. 将9.4g Eagle's MEM“Nissui”1溶于500ml dH 2 O中，用高压灭菌器灭菌，然后在室温下冷却
2. 添加青霉素，链霉素，L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，终浓度分别为200单位/ ml，200μg/ ml，4 mM和0.22％
含有2％BS（或FBS）和0.5％（或0.4％）琼脂糖的MEM
1. 使用高压釜在dH 2 O中熔化1％（或0.8％）琼脂糖，并在设定为40℃的水浴中冷却
2. 将含有4％BS（或FBS）的2x MEM温热至40°C的水浴中
3. 将1％（或0.8％）琼脂糖溶液与相同体积的含4％BS（或FBS）的2x MEM混合，立即使用，或保存在40°C的水浴中
含有0.01％中性红和0.5％琼脂糖的MEM
1. 使用高压釜在dH 2 O中熔化1％琼脂糖，并在设定为40℃的水浴中冷却
2. 将含有4％BS和0.02％中性红的温热2x MEM在水浴中加热至40℃
3. 将1％琼脂糖溶液与相同体积的含4％BS和0.02％中性红的2x MEM混合，立即使用，或保存在40°C的水浴中

致谢

我们感谢Drs。 K. Hanada和K. Saito，生物化学和细胞生物学系，他们的宝贵评论。我们也感谢M. Nagai女士的技术支持。
该协议是针对我们先前在Otsuki 等人发表的论文（2018）开发的，该论文由AMED-CREST在Grant No.JP18gm0910005和JSPS KAKENHI（JP15K08508）下支持。

利益争夺

我们声明我们没有利益冲突。

参考

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