材料和试剂

1.5毫升微量离心管
培养皿（Thermo Fisher Scientific，Sterilin TM ，目录号：122TS1）
1.5毫升杵（Sigma-Aldrich，目录号：Z359947-100EA）
Tuta absoluta 鸡蛋
注意：卵是从IVIA（Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias）饲养的Tuta absoluta菌落中获得的。该殖民地始于Castellon（西班牙）附近番茄田的成虫。没有商业昆虫/蛋。
番茄叶（ cv。 Micro-Tom）
液氮（商品级）
欧洲细菌琼脂（Conda，目录号：1800）
丙酮（默克，目录号：1000141000，CAS：67-64-1）
牛血清白蛋白（BSA Fraction V）（罗氏，目录号：10 735 078 001）
Bradford试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
三氯乙酸（AppliChem，Panreac，目录号：131067，CAS：76-03-9）
Nα - 苯甲酰基-L-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐（BApNA）（Sigma-Aldrich，目录号：B3133，CAS：21653-40-7）＆nbsp;
pGlu-Phe-Leu对硝基苯胺（Sigma-Aldrich，目录号：P3169，CAS：85901-57-1）
牛胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T1426，CAS：9002-07-7）
木瓜蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：P4762，CAS：9001-73-4）
Nα - 苯甲酰基-L-精氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐（BAAMC）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：SC-301455，CAS：83701-04-6）
NEG-50凝胶（Thermo Fisher Scientific，目录号：6502）
丸水疱（容量：约400μl）（Enantyum 25 mg，Menarini）。
聚乙烯醇（Sigma-Aldrich，目录号：P1763，CAS：9002-89-5）
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：168149，CAS：52-90-4）
抗坏血酸（Duchefa Biochemie，目录号：A0602，CAS：50-81-7）
Tris（Duchefa Biochemie，目录号：T1501.1000，CAS：77-86-1）
蔗糖（AppliChem，目录号：131621.1211，CAS：57-80-1）
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（Sigma-Aldrich，目录号：PVP10，CAS：9003-39-8）
磷酸钠（AppliChem，Panreac，目录号：122018.1210，CAS：7601-54-9）
氯化钙2水合物（AppliChem，Panreac，目录号：131232.1210，CAS：10035-04-8）
蛋白质提取缓冲液（见食谱）
胰蛋白酶测定缓冲液（见食谱）
木瓜蛋白酶测定缓冲液（见食谱）
组织化学洗涤液1（见食谱）
组织化学洗涤液2（见食谱）
组织化学底物溶液（见食谱）

设备

移液器（Gilson，2-20,20-200和100-1,000μl）
生长室（SANYO，型号：MLR 350）
双目立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZ-St）
刷（Staedtler永久型，型号：989 4 BK2）
不锈钢镊子
分光光度计（Eppendorf，型号：6131）
低温恒温器（Thermo Fisher Scientific，MICROM，型号：HM520）
冷藏离心机（Eppendorf，型号：5417R）
荧光显微镜（Leica，型号：DM5000 B）
聚赖氨酸涂层载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：J2800AMNZ）
相机（尼康，型号：D3200）

程序

Tuta absoluta 幼虫冷冻切片（视频1）
视频1. Tuta absoluta幼虫的样品制备和低温恒温切片
1. 将 Tuta absoluta 幼虫收集到1.5 ml管中并在液氮中冷冻。
2. 将少量NEG-50冷冻保护凝胶倒入模具中。使用药丸泡罩作为模具。
3. 将冷冻幼虫放入模具中，并用低温保护凝胶覆盖。
  注意：确保凝胶中没有气泡。
4. 用含有凝胶的幼虫在液氮中冷冻模具，直到除去所有气泡。
5. 从模具中取出冷冻样品。
6. 用NEG-50凝胶覆盖预冷冻低温恒温器标本盘的表面。＆nbsp;
7. 将冷冻样品放在圆盘上并将其放入低温恒温器室中冷冻。
8. 将所有凝胶冷冻后，将样品盘固定在可定向的样品头中。
9. 将截面厚度设置为16μm并继续切片。
10. 一旦它到达昆虫的感兴趣区域并且您能够看到幼虫的消化系统，在聚赖氨酸涂层载玻片上恢复该部分。
酶组织化学
1. 将载玻片与1ml Histochemistry洗涤液1在室温下孵育2分钟以避免大分子扩散。
2. 在冷冻切片上沉积50μl组织化学底物溶液，并在黑暗中于37℃孵育15分钟。
3. 用1ml Histochemistry洗涤液清洗载玻片5次.2。将载玻片保持在-20°C，直到在显微镜下观察它们。您可以在-20°C下将幻灯片保留几天。
总蛋白质提取
1. 将一个 Tuta absoluta 鸡蛋放在新鲜的番茄叶上，在培养皿中用2％琼脂孵育（图1）。
  
  图1.在番茄叶片中发育的第三龄期（L3）的Tuta absoluta幼虫。斑潜蝇幼虫在番茄叶片内饲养和发育，保护免受捕食者和杀虫剂的侵害（相机：尼康D3200）。 />
2. 每天在双目立体显微镜下进行幼虫发育。
  第一龄期（L1）的幼虫具有乳黄色，头部较暗，约1.6毫米。第二龄期（L2）的幼虫长约2.8毫米。在第三龄期（L3），幼虫变得更绿，并且它们的大小增加到4.7毫米。在第四个幼虫龄期（L4），它获得背红色带。在这最后一个幼虫期，它可以达到9毫米（图2）（EPPO，2011）。
  
  图2.不同发育龄期的Tuta absoluta幼虫。 L1：第一龄; L2：第二龄; L3：第三龄; L4：第四龄。在它的发育过程中，幼虫变得更大，并获得绿色。
3. 每次蜕皮后一天，恢复幼虫并通过在液氮中冷冻来处死幼虫。
4. 在1.5ml微量离心管中汇集约40mg每龄幼虫的幼虫。
5. 在液氮中研磨幼虫。
6. 将获得的粉末在200μl冰冷的蛋白质提取缓冲液中均化。
7. 在4℃下以16,200 x g 离心15分钟。
8. 回收上清液，与400μl90％冰冷的丙酮混合，在-20°C孵育2小时。
9. 在4℃下在16,200 x g 离心10分钟并弃去上清液。
10. 用90％冰冷的丙酮洗涤沉淀两次，并将其重悬于100μl的pH8的0.5M Tris缓冲液中。
11. 通过Bradford方法测量粗提物中的蛋白质浓度（Bradford，1976）。
制备胰蛋白酶和木瓜蛋白酶标准曲线
1. 制备胰蛋白酶和木瓜蛋白酶标准品：0.5μg/μl，1.0μg/μl，1.5μg/μl，2.0μg/μl和2.5μg/μl。
2. 将50μg底物添加至标准品（BApNA至胰蛋白酶，PFLNA至木瓜蛋白酶），并分别用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶测定缓冲液将体积补足至100μl。
3. 在37°C孵育30分钟。
4. 用分光光度计测量405nm处的吸光度。
胰蛋白酶和木瓜蛋白酶含量的定量
1. 混合5μg蛋白质提取物，50μg底物和至多100μl胰蛋白酶/木瓜蛋白酶测定缓冲液。
2. 在37°C孵育30分钟。
3. 将管在16,200 离心管在4℃下离心10分钟并回收上清液。
4. 用分光光度计测量405nm处的吸光度。

数据分析

胰蛋白酶和木瓜蛋白酶含量的定量
根据标准曲线计算样品中胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的浓度（图3）。
结果表示为粗提物总蛋白中胰蛋白酶或木瓜蛋白酶样蛋白的百分比（图4）。

图3.胰蛋白酶含量测定的标准曲线。使用不同浓度的商业胰蛋白酶获得标准曲线。

图4.用不同转基因番茄叶饲喂的Tuta absoluta幼虫中的胰蛋白酶含量。胰蛋白酶含量表示为粗提物总蛋白中胰蛋白酶样蛋白的百分比。
酶组织化学
当底物（Nα - 苯甲酰基-L-精氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐：BAAMC）与胰蛋白酶或木瓜蛋白酶样蛋白酶结合时，它发出蓝色荧光。用Leica DM5000显微镜在紫外光下观察荧光（图5）（目标：5x / 0.15 HC PL FLUOTAR，曝光时间：1.8秒，增益：1.5倍）。

图5.酶组织化学：检测Tuta absoluta 幼虫中的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶样酶。 A. Tuta absoluta L3幼虫的冷冻切片。 B.用BAAMC荧光底物孵育的幼虫切片。 C.阴性对照：没有BAAMC底物的幼虫部分。 D.幼虫前肠的细节。 E.幼虫中肠的细节。 F.幼虫后肠和Malpighi肾小管的细节。

食谱

蛋白质提取缓冲液
0.1 M Tris pH 7
0.1％抗坏血酸
0.1％L-半胱氨酸
0.5 M蔗糖
10 mg / ml聚乙烯吡咯烷酮（PVP）＆nbsp;
胰蛋白酶检测缓冲液
磷酸钠缓冲液67mM，pH 7.6
20mM CaCl 2
木瓜蛋白酶测定缓冲液
磷酸钠缓冲液67mM，pH 7.6
5mM L-半胱氨酸
组织化学洗液1
10％聚乙烯醇
磷酸钠缓冲液67mM，pH 7.6
组织化学洗液2
5％聚乙烯醇
磷酸钠缓冲液67mM，pH 7.6
组织化学底物溶液
10％聚乙烯醇
0.5μlBAAMC（20 mg / ml）
2 mM CaCl 2
磷酸钠缓冲液67mM，pH 7.6

致谢

Rim Hamza承认突尼斯高等教育和科学研究部以及欧盟Erasmus Mundus EMMAG计划的奖学金。这项工作部分得到了西班牙经济和竞争力部（MINECO）的拨款BIO2013-40747-R和AGL2014-55616-C3的支持。我们要感谢Drs。 Alberto Urbaneja和MeritxellPérez-Hedo（Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias，CentrodeProtecciónVegetalyBiotecnología，Unidad AsociadadeEntomología，UJI-IVIA）提供 Tuta absoluta 幼虫和MarisolGascón（IBMCP）样品处理方面的技术援助。该方案已在出版物中描述：Hamza 等人（2018）。

利益争夺

作者声明与此工作没有任何利益冲突。

参考

Bradford，M。M.（1976）。利用蛋白质 - 染料结合原理定量微量蛋白质的快速灵敏方法。 Anal Biochem 72：248-254。
EPPO。（2011年）。伊拉克 Tuta absoluta 的第一份报告。 EPPO报告服务4（5）。
Erban，T。和Hubert，J。（2011）。可视化螨虫中肠蛋白质消化 Lepidoglyphus destructor 。 Arch Insect Biochem Physiol 78（2）：74-86。
Hamza，R.，Perez-Hedo，M.，Urbaneja，A.，Rambla，J.L.，Granell，A.，Gaddour，K.，Beltran，J.P。和Cañas，L.A。（2018）。在番茄中表达两种大麦蛋白酶抑制剂可促进内源性防御反应并增强对 Tuta absoluta的抵抗力。 BMC Plant Biol 18（1）：24。
Quilis，J.，Lopez-Garcia，B.，Meynard，D.，Guiderdoni，E。和San Segundo，B。（2014）。编码两种蛋白酶抑制剂的融合基因的诱导表达导致转基因水稻对昆虫和病原体的抗性。 / a> Plant Biotechnol J 12（3）：367-377。
Smigocki，A.C.，Ivic-Haymes，S.，Li，H。和Savic，J。（2013）。 Beta vulgaris 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因赋予的有害生物保护。 PLoS One 8（2）：e57303。