材料和试剂

质粒，引物和细胞
1. p.UTA.2.0空（Addgene，目录号：82446）
2. p.UTA.2.0 miR 19b-3p（Addgene，目录编号：82442）
3. 测序引物：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：500px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>psiCHECK2-R
  CGAGGTCCGAAGACTCATTT
  T7 Universal Primer
  TAATACGACTCACTATAGGG >
4. HEK293细胞
其他材料
1. 移液器提示＆nbsp;
  1. 1,000μl过滤嘴（SARSTEDT，目录号：70.762.211）
  2. 100μl过滤嘴（SARSTEDT，目录号：70.760.212）
  3. 10μl过滤嘴（SARSTEDT，目录号：70.1116.210）
2. 1.5 ml微量离心管（Eppendorf，目录号：G_0030108116）
3. 2.0毫升微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.695.200）
4. 24孔板（Greiner Bio One International，目录号：662160）
5. 5毫升聚苯乙烯圆底管（Corning，Falcon ®，目录号：352052）
6. PCR管0.2 ml（SARSTEDT，目录号：72.737.002）
7. Parafilm（Sigma-Aldrich，Bemis，目录号：P7793-1EA）
8. HEK293人胚肾细胞系（ATCC，目录号：CRL-1573 TM ）
9. One Shot ® TOP10化学感受器 Escherichia coli （Thermo Fisher Scientific，目录号：C404010）
10. 寡核苷酸的有义和反义链（下面有更多信息）
11. 凝胶提取试剂盒（QIAquick凝胶提取试剂盒，QIAGEN，目录号：28704）
12. Gibco TM Opti-MEM TM （+ L-谷氨酰胺，+酚红）（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985047）
13. Lipofectamine ® 2000（赛默飞世尔科技，目录号：11668027）
14. NotI限制酶（New England Biolabs，目录号：R0189S）
15. XhoI限制酶（New England Biolabs，目录号：R0146S）
16. EcoRI（New England Biolabs，目录号：R0101S）
17. HindIII（New England Biolabs，目录号：R0104S）
18. 质粒DNA Midiprep试剂盒（QIAquick Plasmid Midi Kit，QIAGEN，目录号：10023）
19. QIAprep Spin Miniprep Plasmid mini试剂盒（QIAGEN，目录号：27104）
20. 多聚甲醛4％溶液（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-281692）
21. T4 DNA连接酶试剂盒（New England Biolabs，目录号：M0202S）
22. T4多核苷酸激酶（PNK）（New England Biolabs，目录号：M0201S）
23. 琼脂糖（Carl Roth，目录号：3810.3）
24. PBS（PAN-Biotech，目录号：P04-36500）
25. 胰蛋白酶-EDTA（PAN-Biotech，目录号：P10-023100）
26. DMEM（Thermo Fisher Scientific，Life Technologies，目录号：41965062）
27. 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Life Technologies，目录号：10500-064）

设备

移液器
冰箱
琼脂糖凝胶电泳室
BD LSR II流式细胞仪（BD，型号：LSR II）
1. YFP：激光488 nm和550LP-BP575 / 26滤光片
2. CFP：激光408 nm和BP450 / 50（太平洋蓝）
台式冷冻微量离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus TM Fresco TM 21，目录号：75002555）
通用离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus TM Megafuge TM 16，目录号：75004230;转子：Thermo Fisher Scientific，型号：TX-150，目录号：75005701 ）
凝胶文件系统（INTAS Gel iX Imager）（INTAS Science Imaging Instruments，型号：FACE）
NanoDrop TM 2000（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 2000，目录号：ND-2000）
Thermoblock（Eppendorf，型号：ThermoStat Plus，目录号：5352 000.010）
热循环仪（Labcycler Sensoquest）
Vortexer（科学工业，型号：Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）

软件

BD-FACSDIVA（BD Biosciences）
R（ https://www.r-project.org ）
R studio（ https://www.rstudio.com ）
Bioconductor（ https://www.bioconductor.org ）
串行克隆（ http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html ）

程序

该协议描述了两个块（图2），一个指定了如何生成具有miRNA响应元素的报告质粒，而第二个块概述了来自FACS的数据收集和R环境中的处理，第二个块包括使用的门和简化的代码产生分析功能。

图2.程序方案。双报告质粒用XhoI和NotI线性化，并与退火的寡核苷酸连接。适当的寡核苷酸连接消除了质粒中两个EcoRI限制性位点之一;因此，使用内切核酸酶限制筛选阳性克隆。对克隆进行测序和转染后，通过流式细胞术测量荧光强度，并使用R编程语言处理原始数据以产生分析功能。

寡核苷酸设计和退火
在这里，我们描述如何使用miR-451a作为例子制备具有1个microRNA结合位点的p.UTA.2.0质粒。
注意：我们在这里使用完美的miRNA互补性，但可以使用内源性3'UTR。
1. 设计和订购寡核苷酸作为单独的链（我们的寡核苷酸从Sigma-Aldrich订购）（表1）。
  
  表1.使用XhoI和NotI设计寡核苷酸
2. 在0.2ml PCR管中制备以下反应以使寡核苷酸退火（表2）。
  
  表2.寡核苷酸退火和磷酸化＆nbsp;
3. 在37℃下在热循环仪中孵育1小时，然后在95至25°C的斜坡中冷却5分钟（5°C / min）。
  注意：
  1. 或者，您可以加热寡核苷酸，让它们在室温下冷却几个小时。
  2. 通常不需要磷酸化;但是如果质粒去磷酸化则需要它。
  3. 您可以使用单个寡核苷酸作为对照，检查寡核苷酸是否通过运行2％琼脂糖凝胶退火。通常我们会跳过这一步，之后就没有问题。
4. 将退火的寡核苷酸储存在-20℃或进行连接步骤。
p.UTA.2.0质粒线性化
1. 在1.5 ml微量离心管中准备消化（表3）。相应地扩大以进行多次反应。
  
  表3.质粒p.UTA.2.0的消化空白＆nbsp;
  
  虽然不是必需的，但我们建议将NotI和XhoI分开控制。
  通常不需要去磷酸化;然而，它降低了连接后的背景（见下文），在这种情况下，退火的寡核苷酸需要被磷酸化。
2. 涡旋短暂混合。
3. 快速旋转管子以收集底部的液体。
4. 将混合物在37°C孵育至少1小时。
  注意：可以进行过夜孵化。
5. 在1％琼脂糖凝胶中进行反应。
6. 切下5,131 bp的条带并将其转移到干净的微量离心管中。
7. 使用QIAquick凝胶提取试剂盒按照制造商的方案从凝胶中提取DNA。
8. 测量DNA浓度。
9. 准备50 ng /μl等份的线性化质粒。
连接p.UTA.2.0和退火的寡聚双链体
1. 根据表4在1.5 ml微量离心管中准备结扎。相应地按比例放大以进行多次反应。
  
  表4.连接反应p.UTA.2.0和退火寡核苷酸＆nbsp;
2. 短暂地涡旋。
3. 快速旋转管子以收集管子底部的液体。
4. 将混合物在16°C孵育至少2小时。
  注意：可在4°C下进行过夜孵育。
5. 转变成你最喜欢的感受态细胞。
筛选阳性克隆
注意：
1. 为了检查正确的寡核苷酸插入，我们进行了内切核酸酶限制以区分空克隆（没有miRNA反应元件）和阳性克隆。由于插入位点（XhoI和NotI）含有消化后消失的EcoRI位点，如果寡核苷酸缺乏EcoRI序列，则这是正确的。
2. 我们一起使用HindIII和EcoRI：空载体产生四个条带（3,992; 1,010; 732; 111）和阳性克隆三个（3,292; 1,736; 111）。
3. 由于我们的质粒缺乏填充序列，我们可以区分背景和部分消化的DNA;因此，我们强烈建议您进行此筛选测试（图3）。
4. 可以从Addgene页面检索序列（ http://www.addgene.org/82446/）。
  
  图3.质粒方案和限制性位点。使用HindIII和EcoRI限制性位点筛选阳性克隆。注意XhoI和NotI之间的EcoRI位点，区分插入的寡核苷酸和重新连接背景。
1. 使用QIAprep Spin Miniprep培养细菌培养物并分离质粒。
  注意：使用自制溶液分离质粒也是可以的。
2. 在1.5ml微量离心管中制备消化反应（表5）。在进行多次反应时相应地放大。
  
  表5.筛选阳性克隆的消化反应＆nbsp;
3. 短暂涡旋并旋转以收集管底部的液体。
4. 将混合物在37℃孵育1小时。
5. 在1％琼脂糖凝胶中加入混合物。
6. 可视化琼脂糖凝胶。
7. 分析你的克隆。
  图4描绘了包含几个空克隆的实验结果，所述空克隆可能源自质粒的不完全消化。
8. 准备转染质量的DNA。
  
  图4.筛选反应预期结果。 A和B. 计算机空白和阳性（插入miRNA靶标）质粒的DNA凝胶电泳。 C.来自筛选反应的琼脂糖DNA凝胶电泳，其显示一个阳性克隆（泳道2）和三个没有插入物的空载体（泳道4,6,8）。未消化的对照（泳道1,3,5,7）。
转染p.UTA.2.0质粒
该转染方案针对使用Hek293细胞的24孔板进行了优化;我们在HeLa，HTC116和SH-SY5Y中评估了该方案。它表明神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）不适用于该测定，因为启动子不足以产生适当的分析功能。
1. 在24孔板中接种HEK293细胞（每孔约100,000个细胞）。
2. 在37°C和5％CO 2 孵育18-24小时。
3. 如下准备DNA样本（我们建议每个实验单位至少重复三次。相应地放大）：
4. 按如下方法制备Lipofectamine ® 2000试剂：
5. 将DNA溶液（步骤E3）以1：1的比例添加到Lipofectamine ® 2000试剂（步骤E4）中。
6. 在室温下孵育混合物至少20分钟。
7. 将DNA-lipofectamine混合物滴加到细胞中。
8. 在37°C和5％CO 2 孵育72小时。
流式细胞仪的样品制备
1. 从井中丢弃培养基。
2. 用PBS（约500μl）洗涤1次。
3. 每孔加入100μl胰蛋白酶。
4. 在37℃和5％CO 2 下孵育5分钟。
5. 加入400μlDMEM培养基+ 15％FCS。
6. 将细胞悬浮液转移至FACS管。
7. 在300 x g 下离心5分钟。
8. 丢弃上清液。
9. 加入1毫升PBS。
10. 在300 x g 下离心5分钟。
11. 重复步骤F9和F10两次。
12. 丢弃上清液。
13. 简要地旋转下来。
  注意：此时可以记录单元格而不进行修复。
14. 加入100μlPBS。
15. 加入100μlPFA4％（多聚甲醛4％）。
16. 在4°C孵育30分钟。
17. 如前洗涤三次（步骤F9和F10）。
18. 加入200μlPBS。
19. 用封口膜密封FACS管。
20. 储存在4°C（冰箱）。
  注意：固定单元格最多可存储1周，而不会影响传输函数的输出。

数据分析

数据采集
以下步骤描述了选通过程，以及如何使用R导出要分析的FCS文件（假设读者具有流式细胞仪数据采集的基本知识）。我们使用BD LSR II仪器进行测量，仪器带有用于YFP的过滤器550LP-BP575 / 26（PE）和用于CFP的BP450 / 50（太平洋蓝）。
1. 分析你的消极对照。
2. 使用FSC.A和FSC.H散点图设置单个单元格（此处称为P1或单个单元格）。
3. 使用FSC.A和SSC.A散射选择主要细胞群。（在这里称为P2或主要人口）。
4. 使用直方图可视化定义YFP阳性细胞（此处称为P3或YFP阳性细胞）。（图5和视频1）
  注意：图5和视频EmptyFACSdiva（视频1）显示了我们用于模拟控件的门，以及我们在采集软件上保留的布局。
  
  图5.负控制采集（屏幕截图）。面板显示用于HEK293细胞的门：单峰的散点图（FSC.A与FSC.H），大小和复杂性（FSC.A vs. SSC.A）; PE.A（550LP-BP575 / 26）的直方图和散点图，以及CFP和YFP的输出（Scatter plot PE.A vs. Pacific blue）。
  
  视频1. FACS Diva采集非转染阴性对照。小组显示用于HEK293细胞的门：单峰的散点图（FSC.A与FSC.H），细胞群（FSC.A vs SSC.A），PE.A（550LP-BP575 / 26）的直方图和散点图，以及CFP和YFP的分析输出（Scatter plot PE.A vs. Pacific blue）。
5. 运行p.UTA.2.0空向量并创建一个门，其PE的相对荧光单位为10,000，直到x轴的末端。（在这里称为P4或采集门）（图6）。
  
  图6.空载体对照获取截图。面板显示用空载体转染的HEK293细胞的门（p.UTA.2.0为空）。单峰的散点图（FSC.A与FSC.H），主要细胞群（FSC.A与SSC.A），PE.A（550LP-BP575 / 26）的直方图和散点图，以及分析输出CFP和YFP（散点图PE.A与太平洋蓝色）。
6. 从P4人群中获取1,000到3,000个事件。
  注意：我们使用P4群体作为采集门，以获得高YFP强度的足够数据点，减少分析函数的散射，这对回归分析至关重要。
7. 阅读你的样品。
  图6和7显示了用p.UTA.2.0 Empty和p.UTA.2.0 miR 19b-3p转染的HEK293细胞的采集组。
  
  图7. p.UTA.2.0 miR 19b-3p采集截图。小组显示用于HEK293细胞的门：单峰的散点图（FSC.A与FSC.H），大小和复杂性（FSC.A与SSC.A）; PE.A（550LP-BP575 / 26）的直方图和散点图，以及CFP和YFP的输出（Scatter plot PE.A vs. Pacific blue）。
8. 以FCS格式2.0导出P3门（图8）。
  注意：P3包括所有YFP阳性细胞。我们使用P4作为停止门来提高分析功能的质量。通常，我们还会保存整个数据集以供记录。
  
  图8. FACS-Diva导出数据屏幕截图。导出P3（包括P4的YFP阳性细胞）群体的FCS格式2.0，屏幕截图举例说明了用于FCS文件的导出选项。
数据处理和绘图
这是一个简化的代码，可以有效地分析为实验室科学家编写的UTA分析细胞计数，并且编程经验最少或没有。示例FSC文件和以下步骤中使用的代码包含在数据代码.zip 和视频2描述了每个步骤。
视频2.工作室数据分析

使用R环境从Raw FCS文件生成分析函数的分步指南：
1. 使用R脚本“Analysis_Functions.R”文件在同一文件夹中找到FCS文件（仅包含YFP阳性群体）。
2. 在R中，设置您的工作目录。
  的 setwd （“/路径/ toyour / FCSfiles /文件夹”）
3. 调用“Analysis_functions_4.0.R”文件中的函数。
  的来源（ “Analysis_functions_4.0.R”）
4. 创建一个包含FCS文件名称的向量，在这种情况下只是包含YFP正面事件的文件，在本例中数据是P3种群（包括P4）。
  fileNames＆lt; - Sys.glob （“* _ P3.fcs”）
5. 创建您的工作清单。
  以下行将创建一个R对象（List），其中包含FCS文件的所有分析函数。您将bin.data函数应用于工作目录中的每个文件;这意味着列表中的每个对象都对应于FCS文件或实验单元。每个FCS处理对象都有：
  1. 原始数据（CFP，YFP，比率，折叠）。
  2. Bin数据（分析功能）。
  3. Bin CFP和YFP将用于分析函数生成。
  4. 每个CFP箱的CFP / YFP比率。
  5. 每个箱子折叠压制。这只是另一种看待镇压的方式;这意味着CFP被压制为100％。
  6. 四分位数中位数，最大值和最小值的描述性统计数据。
  函数＆lt; - lapply （fileNames，函数（x） bin.data.FscH （x，bin.size = 0.05））
  
  这是一个基本R循环：它接受fileNames（FCS文件）上的每个元素，并在它们上应用bin.data.function来创建列表。第一个参数定义向量（包含FCS文件标签），第二个参数包含bin.data.FscH函数，您可以在其中修改bin大小。
6. 写下FCS文件的名称，将它们分配到列表中并将其写入文本文件中。
  
  table_names＆lt; - data.frame （fileNames）
  write.table （table_names，“List_Index.txt”）
  名称（功能）＆lt; -fileNames
  
  List_Index.txt文件包含列表中的FCS文件及其索引的名称;我们建议使用硬拷贝来绘制数据。
7. 在R中绘制分析函数（图9）。
  
  plot.miR （函数，fil_num = c （2,4,6,8），control = 1，ylim = c （1， 8），l_y = 8，
  Leg = c （“空”，“miR 148a 3p”，“miR 19b 3p”，“miR 24 3p”，“miR 29a 3p”），main =“miRNA”，col.m = c （“黑色”，“蓝色”，“红色”，“绿色3”，“紫色”），
  cex = 0.7，mu.cex = 0.3）
  plot.miR （函数，fil_num = c （3,5,7），control = 1，ylim = c （1,8），l_y = 8，
  腿= c （“空”，“miR 15a 5p”，“miR 21 5p”，“miR_28_3p”），main =“miRNA”，col.m = c （“黑色”，“蓝色”，“红色”，“绿色3”，“紫色”），
  cex = 0.7，mu.cex = 0.3）
  
  List_Index.txt文件包含列表中的FCS文件及其索引的名称;我们建议您在绘制数据时使用它的硬拷贝。表6描述了每个论点。
  
  图9.从plot.miR函数输出的分析函数。 HEK293细胞用几种miRNA传感器转染，通过流式细胞术获得并读取。在R环境中分析了FCS 2.0文件。
  
  表6.绘图的函数参数。 miR ＆nbsp;
可选步骤：
您还可以使用R图生成PDF：
1. 创建PDF设备：
  
  pdf （“YourName.pdf”，3.18,6.75）
  
  pdf函数需要引号中文件的名称，在这种情况下，“YourName.pdf”不要忘记扩展名，而第二个和第三个参数分别是图的宽度和高度。
2. 运行您的绘图代码（不止一个是可能的，不要指望R-studio绘图布局上的任何输出）。
  
  plot.miR （函数，fil_num = c （2,3,4,5），control = 1，ylim = c （1， 8），l_y = 8，
  腿= c （“空”，“miR_148a_3p”，“miR_15a_5p”，“miR_19b_3p”，“miR_21_5p”），主要=“983”，col.m = c （“黑色”，“蓝色”，“红色”，“绿色3”，“紫色”），
  cex = 0.7，mu.cex = 0.3）
3. 关闭PDF。
  
  dev.off （）
  您还可以使用其他软件绘制数据，使用以下函数，您将创建所有列表的CSV文件，第一列包含每个YFP bin的日志值，其他列包含每个元素的CFP值在列表（功能）中，带有FCS文件的名称。
4. 使用导出功能。
  
  导出（函数，fileNames，“Output.csv”）
  
  Export函数需要包含bin数据的列表，需要包含FCS文件名称的向量，这与用于定义图表索引的名称相同，第三个参数是CSV文件的名称。
数据解释和统计分析。
为了解释并从分析函数中获得进一步的见解，您可以使用之前使用的分子滴定模型提取信息（Mukherji et al。，2011; Lemus-Diaz et al。，2017）（图10）。

图10. miRNA诱导调节的滴定模型该miRNA诱导调控模型描述了可用于翻译的游离mRNA。在没有miRNA的情况下，细胞分别以K R 和γ r 的速率转录和降解mRNA。在存在miRNA的情况下，可用于翻译的游离mRNA取决于miRNA-mRNA（r *）复合物，其形成取决于接通率（K on ）和miRNA浓度。然后出现两条相互排斥的路径。它可以诱导mRNA降解（在γ r * 速率下）或分解成其组分（在K off 速率下）。

该模型描述了mRNA的miRNA滴定，其中转录的mRNA与miRNA（r *复合物）相互作用，该miRNA由复合物的K 和K off 统治，这取决于miRNA。 mRNA中的互补和靶位点。以下等式描述了mRNA的变化（可自由翻译）和r *：
公式1

公式2

在这种情况下，总miRNA浓度是游离miRNA分子加上r *复合物中包含的miRNA：
公式3

假设没有从miRNA-mRNA复合物发生翻译，并且仅从游离RNA（r）发生翻译，（r）的稳态解决方案如前所述（Mukherji et al。，2011; Lemus -Diaz et al。，2017）：
公式4

在哪里，

可以使用app（模拟miRNA功能）进行模拟。有关说明，请参阅Lemus-Diaz 等人的补充材料（2017）。
＆NBSP;使用分析函数作为输入（Excel或R），您可以使用等式4的非线性回归估计参数θ和λ，而θ对应miRNA浓度λ与miRNA的结合相关。这些例子的估计参数可以在Lemus-Diaz 等人的补充信息中找到。＆nbsp;（2017）。
＆NBSP;我们为这里描述的报告者验证了这个模型，并展示了参数（θ和λ）如何用于剖析miRNA活性，以miRNA的定位为例。由分析函数推断（Lemus-Diaz et al。，2017，图6）。此外，使用这个模型，我们描述了三个分类变量（低，中，高功能组）来轻松解释输出（Lemus-Diaz et al。，2017，图2）。
在图9中呈现的数据中，miR 24-3p，miR 29a-3p可归类为低功能性; miR 148a-3p和miR 21-5p为中期;并且miR 21-5p和miR 19b-3p具有高度功能性。然而，作为任何定性数据，这种分类是任意的，因此我们建议使用估计参数并使用它们来比较miRNA功能（Lemus-Diaz et al。，2017，图3和4）。

致谢

这项工作得到了哥廷根神经科学，生物物理学和分子生物科学研究生院（DFG授予GSC 226/2）的部分支持，L.T是IMPRS分子生物学的硕士生。该协议改编自Mukherji et al。，2011和Lemus-Diaz et al。，2017;术语分析流式细胞术采用Denzler 等人，，2016。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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