材料和试剂

Fisherbrand TM 无菌100 mm x 15 mm聚苯乙烯培养皿（Fisher Scientific，Fisher Scientific TM ，目录号：FB0875713）
Costar ® TC处理的6孔板（Corning，目录号：CLS3506）
15毫升锥形管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
无菌独立包装5毫升移液器（SARSTEDT，目录号：86.1253.001）
带有26 G针头的无菌1 ml注射器（Fisher Scientific，目录号：14-829-6A）
制造商：BD，目录号：305537。
10 ml注射器（Thermo Fisher Scientific，目录号：S7515-10）
BD Precisionglide ®注射器针头，23号，L3 / 4英寸（BD，目录号：305143）
BD Precisionglide ®注射器针头，18号，L 1英寸（BD，目录号：305195）
细胞过滤器，70μm，无菌（Corning，目录号：352350）
50毫升锥形管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
一次性硼硅酸盐玻璃管16 mm x 125 mm（Globe Scientific，目录号：1515）
LysM特异性Pck1敲除小鼠（Pck1 MC-KO 小鼠）
注意：小鼠是通过将Pck1 flox / flox 小鼠与表达Cre重组酶的LysM-Cre +/-转基因小鼠杂交而产生的。控制LysM启动子。 Pck1 flox / flox 小鼠用作对照。所有小鼠都处于C57Bl / 6J背景中。根据凯斯西储大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC），将所有动物饲养在温度控制的设施中，光照/黑暗周期为12小时。
来自 Escherichia coli 026：B6的脂多糖（Sigma-Aldrich，目录号：L8274）
IL-4，不含动物成分，重组，以 E表示。大肠杆菌（Sigma-Aldrich，目录号：SRP3211）
乙醇溶液70％，分子生物学等级（Fisher Scientific，Fisher Bioagents TM ，目录号：BP8201500）＆nbsp;
FBS（胎牛血清）（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：03-600-511）
Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖，丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11995065）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10570063）
L-谷氨酰胺GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25030081）
重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（PeproTech，目录号：315-02）
葡萄糖（西格玛奥德里奇，目录号：G8270）
来自 E的脂多糖（LPS）。大肠杆菌 02：B6（Sigma-Aldrich，目录号：L8274）
白细胞介素-4（IL-4）（PeproTech，目录号：214-14）
[ 13 C] - 琥珀酸[双（2-乙基己基）磺酸钠（琥珀酸 - 13 C 4 ]]（98％）（Sigma -Aldrich，目录编号：719269）
[ 13 C] - 苹果酸（Sigma-Aldrich，目录号：750484）
[ 13 C] - 柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：492078）
甲醇HPLC（Sigma-Aldrich，目录号：1005706）
BSTFA + 10％TMCS-Regisil ®（Regis Technologies，CAS：25561-30-2; 75-77-4）
N-甲基-N-（叔丁基二甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（TBDMS）（Sigma-Aldrich，目录号：394882-25ML）
注意：如果使用TMCS作为衍生物，请参阅参考文献Yang et al。，2008a; Kombu等，2011; Ko et al。，2018。＆nbsp;
乙酸，冰川（认证ACS）Fisher化学（Fisher Scientific，目录号：A38-212）
制造商：Thermo Fisher Scientific，Thermo ScientificTM，目录号：FLA38212。
甲醇，Optima TM LC / MS级，Fisher Chemical（Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：A456-1）
水，Optima TM LC / MS级，Fisher Chemical（Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：W64）
QuickStart TM Bradford蛋白质分析试剂盒1（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000201）
产生巨噬细胞分化培养基（MDM）（见食谱）
5％乙酸/甲醇/水（1：1）萃取缓冲液（见食谱）＆nbsp;
LPS储备液（见食谱）
IL-4储备液（见食谱）

设备

Kelly镊子，箱锁，直钢（Grainger，目录号：4WPD9）
无菌细胞刮刀（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：08-100-241）
GC样品瓶盖，9 mm（Agilent Technologies，目录号：5182-0717）
GC样品瓶，2 ml（Agilent Technologies，目录号：5181-3375）
Thermo Scientific TM Nalgene TM 聚丙烯分度圆柱体（Fisher Scientific，目录号：08-572D）
制造商：Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：N36620100。
Dumont镊子＃5（精细科学工具，目录号：11252-20）
Dumont镊子＃55（精细科学工具，目录号：11255-20）
Dumont forceps AA（精细科学工具，目录号：11210-20）
组织培养罩（Thermo Fisher Scientific，目录号：51022482）
冷藏式台式离心机，适用于15-50 ml锥形管（Eppendorf，型号：5430R）
37°C，5％CO 2 水夹套培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：3110）
P20移液器（Gilson，产品目录号：F123600）
P200移液器（Gilson，目录号：F123601）
P1000移液器（Gilson，产品目录号：F123602）
用于组织的均质器（IKA，型号：T25数字ULTRA-TURRAX ®，目录号：0003725001）
干式加热器（VWR，目录号：75838-282）
Frigidaire 13.8立方米。英尺。 Frost Free立式冰柜（The Home Depot）＆nbsp;
大系列，单门，铰链式高压灭菌器（综合灭菌器系统，型号：LR-36E）
基本实验室抽油烟机（Labconco，型号：2246500）＆nbsp;
倒置光学显微镜（Leica Microsystems，型号：DM IL LED）
GC-MS（Agilent Technologies，型号：5973-MSD）配备Agilent 6890 GC系统＆nbsp;
DB-17MS毛细管柱，30 m x 0.25 mm x0.25μm（安捷伦科技）

程序

骨髓源性巨噬细胞的分离和分化及稳定同位素孵育
1. 从小鼠股骨和胫骨收获骨髓
  1. 准备巨噬细胞分化培养基（MDM）（参见食谱）。将培养基在37°C水浴中预热30分钟，然后收获骨髓。＆nbsp;
  2. 用CO 2 窒息和颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并将小鼠置于含有100％乙醇的烧杯中。＆nbsp;
  3. 在组织培养罩中使用无菌剪刀，夹住皮肤并从小鼠身体的下部去除皮肤。
  4. 用放在100％乙醇烧杯中的剪刀从鼠体上取下腿（图1）。＆nbsp;
  5. 去除所有剩余的头发和皮肤。去除骨骼周围的肌肉和脂肪。将骨头置于100％乙醇中5分钟。将8毫升MDM倒入无菌的100毫米×15毫米聚苯乙烯培养皿中。用培养基将骨头从100％乙醇转移到培养皿中。＆nbsp;
  6. 在膝关节处将股骨与胫骨和腓骨分开。小心不要打破骨头。＆nbsp;
  7. 切断骨头的每一端，如图1所示。在一个带有培养基的培养皿中，每个鼠腿应该共有3个骨头。
    
    图1.从小鼠胫骨，腓骨和股骨中分离骨髓。对小鼠实施安乐死。 A.图像说明切割和移除腿部的位置。 B.用于分离骨髓的小鼠腿部切割位置的示意图。在第1位切割腿（红色虚线）。然后从腿上去除毛发，皮肤和肌肉。然后在红色虚线处切割骨骼，按照指示的顺序隔离骨骼（编号2,3,4和5）。请注意，每个骨骼都在内侧和远侧切割。
  8. 用巨噬细胞分化培养基（MDM）填充26 G针头/ 1 ml注射器（参见配方）。将针尖放入骨中，从骨的两端冲洗骨髓（图2）。这样做是为了股骨，腓骨和胫骨。重复从骨头中冲出骨髓，直到骨头变白。
    
    图2.冲洗骨骼。：一种。图像显示骨骼中的骨髓隔室。 B和C.股骨前（B）潮红和（C）潮红（见视频1）。
    
    视频1.冲洗骨骼以去除骨髓
  9. 收集MDM中的细胞并将其通过70μm细胞过滤器进入无菌锥形管。这样可以去除可能污染细胞的碎片（参见视频2）。
    
    视频2.清除隔离细胞中的碎片
  10. 在1,950 x g 下将细胞在4℃下旋转5分钟。计数细胞并用巨噬细胞分化培养基（MDM）重悬沉淀，以便可以将5×10 6个细胞和MDM接种到6孔板的每个孔中。
  11. 将板在37℃和5％CO 2 下孵育7天。使用新制造的媒体每三天更换一次媒体。
2. 巨噬细胞分化为M1或M2
  当BMDM几乎汇合时（第7天），用新的MDM替换。为了使巨噬细胞极化，我们使用脂多糖（LPS）或白细胞介素-4（IL-4）。
  1. 对于经典的M1激活：以100ng / ml的剂量添加脂多糖（LPS）（10μl储备溶液到4ml MDM中）并孵育4小时。
  2. 对于经典的M2激活：将40ng / ml剂量的白细胞介素-4（IL-4）（1.6μl储备溶液加入4ml MDM）中孵育4小时。
3. 使用U- 13 C葡萄糖进行代谢研究
  1. 用不含葡萄糖，10％活性炭剥离的FBS，100 ng / ml LPS，5 mM U- 13 的培养基替换分化的巨噬细胞（已经用LPS或IL-4处理）中的MDM C葡萄糖（富含99.98％）并在37℃下孵育过夜。我们这样做是因为被调查的基因 Pck1 在禁食状态下被激活，因此我们去除了葡萄糖和胰岛素。＆nbsp;
  2. 第二天，收集媒体和细胞。要收集媒体，请移走一半的媒体。保留1毫升培养基用于测量同位素富集。为了收集细胞，刮去孔以去除细胞。吸取细胞和剩余的培养基并放入锥形管中。在1,950 x g 下将细胞在4℃下旋转5分钟，并将沉淀重悬于50μl的1x PBS中。通过Bradford测定法节省20μl用于测量蛋白质浓度。在-20°C冷冻样品以裂解细胞。蛋白质浓度用于代谢物分析中的标准化。细胞用于通过GC-MS分析。在我们的案例中，我们将细胞送到凯斯西储大学小鼠代谢表型中心（MMPC）进行GC-MS分析。
  3. Bradford检测：根据制造商的指示进行检测（快速入门 TM Bradford蛋白质分析）。我们使用2mg / ml BSA作为标准。移取20μl重悬的细胞到1.5ml Eppendorf管中，并从Quick Start TM Bradford Protein Assay中加入1ml 1x Dye试剂。混合样品并在室温下孵育5分钟。将样品放入比色杯中。将分光光度计设置为595 nm。用空白样品（100μl水和1ml 1x染料试剂）将仪器归零。测量BSA标准品和未知（巨噬细胞）的吸光度。从标准曲线确定样品中蛋白质的量（如果2μl样品的等分试样产生相当于250μg/ ml蛋白质的595nm值，则细胞样品将具有2.5mg / ml的蛋白质浓度）。
  4. 对于Pck1 MC-KO 巨噬细胞的研究，将细胞送至Case Western Reserve大学小鼠代谢表型中心（MMPC）进行GC-MS分析。以下部分显示了LPS激活的巨噬细胞中代谢物研究的实例。该实施例研究的目的是比较LPS处理24小时后Pck1 MC-KO （实验）和Pck1 fl / fl （对照）巨噬细胞中的代谢物。
使用气相色谱质谱（GC-MS）分析柠檬酸循环（CAC）和相关中间体（如柠檬酸盐，琥珀酸盐和苹果酸盐）
1. 细胞样品制备
  简而言之，这种方法利用甲硅烷基化试剂与醇，酸和胺的快速反应形成甲硅烷基衍生物（Yang et al。，2008a and 2008b; Kombu et al。， 2011; Zhang et al。，2015）。商业甲硅烷基化试剂可以组合使用以加速反应，以及与受阻基团反应。例如，N，O-双（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）和三甲基氯硅烷（TMCS）的混合物形成TMS衍生物，或N-甲基-N-（叔丁基二甲基甲硅烷基） - 三氟乙酰胺（MTBSTFA）的混合物和可以使用叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMS）形成TBDMS衍生物（Yang et al。，2008a and 2008b; Kombu et al。，2011; Zhang et al 。，2015）
  1. 对于分析物的绝对定量，如前所述（Ko et al。，2018）：将50μl细胞加入选定的内部参考标准品，例如~5 nmole的每种代谢物[ 13 < / sup> C 6 ]柠檬酸盐，[ 13 C 4 ]琥珀酸盐，和/或[ 2 H <子> 4 ] - 3-羟基戊二酸。
    注意：内部参考标准的选择取决于所使用的前体示踪剂，使得示踪剂的M +标记与添加的标记标准没有干扰;最好使用非内源性参考标准，如三卡巴酸。＆nbsp;
  2. 用3-5ml 5％乙酸的甲醇/水（1：1）提取缓冲液（在冰上冷却）在冰浴上均化细胞2分钟。
  3. 将匀浆在670 x g 下在4℃下离心30分钟。将上清液倒入玻璃试管中并保存在冰上并立即处理
    注意：可将上清液在-80°C冷冻，直至测定GC-MS。
  4. TMSC / TBDMS衍生化程序：将步骤B1b和B1c中收集的100-200μl上清液移液到16mm×125mm一次性硼硅酸盐玻璃管中。
  5. 在氮气下完全干燥（图3）。
    
    图3.氮气干燥器
  6. 通过添加70μl衍生化TBDMS试剂（在吡啶基溶剂中）并在加热块上在80°C加热1小时来反应（图4）。
    注意：可能在室温下反应过夜。
    
    图4.带有衍生化管的加热块
  7. 转移到GC插入物和盖子（图5）;按照概述（Yang et al。，2008a和2008b; Kombu et al。，2011; Zhang et al。，2015）。
    
    图5.放入GC管中的样品
2. GC-MS分析
  1. 使用配备Agilent 6890 GC系统的Agilent 5973-MSD和DB-17MS毛细管柱（30 m x 0.25 mm x0.25μm;可使用60 m）分析TMSC或TBDMS衍生物。质谱仪在电子碰撞模式（EI）或氨化学电离模式（CI）和每种分析物的选择性离子监测（SIM） m / z 下操作;当应用稳定同位素时，监测M0-M + m / z 的SIM（Yang et al。，2008a和2008b; Kombu et al。，2011; Zhang et al。，2015）（图6）。
    
    图6.本协议中使用的GC-MS设备
  2. GC-MS运行后，计算曲线下琥珀酸盐，柠檬酸盐和苹果酸盐的面积以及与内标的比率（表1）。在背景校正后，使用以下公式计算MPE％：
    MPE％= [（ 13 C标记为M1至M +，对于每种CAC中间体）x（ 13 C标记+未标记） - 1]×100（表1）
    
    表1.从 13 C-葡萄糖到柠檬酸盐，琥珀酸盐和苹果酸盐的富集摩尔百分比的计算。 M0，M1到M3是根据标记的细胞内代谢物的比例计算的未标记的并且参照提取的细胞的细胞内体积进行校正（Feldberg et al。，2009）。％MPE计算为％m2 = [（ 13 C标记为M1至M +，对于每种CAC中间体）x（ 13 C标记+未标记） - 1] x 100.

数据分析

对于实验设计，对每个样品进行一式三份的稳定同位素研究。一式三份被认为是n = 1.所有实验总共进行n = 6次。
基于标记的细胞内代谢物与未标记的比例计算M1至M3的MPE，并参照提取的细胞的细胞内体积进行校正（Feldberg 等人，2009）。％MPE计算为MPE％= [（ 13 C标记为M1至M +，对于每种CAC中间体）x（ 13 C标记+未标记）]×100。
对于统计分析，我们使用GraphPad Prism。为了比较两个数据集（Pck1 flox / flox 和Pck1 MC-KO 小鼠），我们进行了学生 t - 测试（图7）。

图7.葡萄糖对LPS活化巨噬细胞中枢代谢的贡献。从Pck1 flox / flox 和Pck1 MC-KO 小鼠分离的BMDMs在LPS存在下与[U- 13 C]葡萄糖一起温育16小时，并进行GC-MS计算 13 C对M2的贡献-CAC。值代表每组n = 6的平均值±SEM。 * P ＆lt;与Pck1 flox / flox 组相比为0.05。

笔记

由于每次运行的变化，内部标准是必要的。对于该实验，样品（每组n = 6）全部同时在GC-MS上运行以减少变化。
每只动物一次一个地进行BMDM的分离。例如，对一只Pck1 flox / flox 小鼠实施安乐死，解剖腿并从股骨胫骨和腓骨冲洗骨髓。将细胞保持在冰上冷。然后对下一只动物实施安乐死，依此类推。将细胞保持在冰上直至收集到所有骨髓。
在电镀BMDM之前预热了培养基。
为了研究需要快速更新的信号通路（例如，M1激活中的TLR4信号传导或M2激活中的IL-4R信号传导）的启动，建议用更高剂量的刺激物处理细胞（例如，100ng / ml LPS或20ng / ml IL-4）在30分钟内;使用同位素确定代谢途径（例如，柠檬酸循环和相关中间体），用较低剂量的刺激物孵育16-24小时（例如，20 ng / ml LPS建议使用10 ng / ml IL-4）。
巨噬细胞在激活期间经历形态学变化。与具有圆形形状的未刺激的巨噬细胞相比，LPS处理的巨噬细胞在刺激24小时内显示出类似煎饼的形状。另一方面，IL-4处理的细胞促进细胞伸长。
从骨髓中分离的细胞将在24小时-48小时内粘附到组织培养板上。 MDM含有M-CSF，可使骨髓细胞分化为巨噬细胞。如果细胞继续漂浮在培养基中，可能会污染细胞。如果发生这种情况，您将需要新鲜培养基并重新分离骨髓细胞。

食谱

产生巨噬细胞分化培养基（MDM）
将500毫升无菌Dulbecco's改良Eagle培养基（DMEM）与：
混合将55ml 10％胎牛血清（FBS）加入DMEM中 5毫升1x谷氨酰胺到DMEM
5毫升1x青霉素 - 链霉素（10,000 U / ml Pen，10 mg / ml Strep）
将5μg巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）加入500ml DMEM中
5％乙酸的甲醇/水（1：1）萃取缓冲液（在冰上冷却）
加入50毫升甲醇到50毫升dH 2 O制成甲醇/水，制成100毫升
在单独的量筒中，将5ml乙酸与95ml上述制备的甲醇/水混合
LPS库存解决方案
在无菌水和等分试样中补充至40μg/μl
储存在-80°C
IL-4储备液
在无菌水和等分试样中补足至100μg/μl
储存在-80°C

致谢

案例MMPC得到NIH资助U24 DK76174的支持。关于Pck1 MC-KO 小鼠的完整研究已经发表（Ko et al。，2018）。

利益争夺

作者声明他们与本文的内容没有利益冲突。

伦理

所有动物实验均由凯斯西储大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

参考

Feldberg，L.，Venger，I.，Malitsky，S.，Rogachev，I。和Aharoni，A。（2009）。用于代谢组分析的代谢物的双重标记（DLEMMA）：用于鉴定和相对定量的新方法通过双同位素标记和液相色谱 - 质谱分析代谢物。 Anal Chem 81（22）：9257-9266。
Ko，C.W.，Counihan，D.，Wu，J.，Hatzoglou，M.，Puchowicz，M.A。和Croniger，C.M。（2018）。删除 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1（Pck1）基因的巨噬细胞更具促炎性的表型。 J Biol Chem 293（9）：3399-3409。
Kombu，R。S.，Brunengraber。 H.和Puchowicz，M。A.（2011）。使用气相色谱 - 质谱法分析柠檬酸循环中间体。在：Metz ，TO（Ed。） Metabolic Profiling：Methods and Protocols。 Humana Press 147-157。
Yang，L.，Kasumov，T.，Kombu，R。S.，Zhu，S.H.，Cendrowski，A.V.，David，F.，Anderson，V.E.，Kelleher，J.K。和Brunengraber，H。（2008a）。肝脏糖异生和柠檬酸循环的代谢组学和质量同位素分析：II。代谢物标记模式的异质性。 J Biol Chem 283（32）：21988-21996。
Yang，L.，Kombu，R。S.，Kasumov，T.，Zhu，S.H.，Cendrowski，A.V.，David，F.，Anderson，V.E.，Kelleher，J.K。和Brunengraber，H。（2008b）。肝脏糖异生和柠檬酸循环的代谢组学和质量同位素分析。 I.糖异生与卡波氏病之间的相互关系;由氨基氧基乙酸酯和酮酸形成甲氧肟酸酯。 J Biol Chem 283（32）：21978-21987。
Zhang，Y.，Zhang，S.，Marin-Valencia，I。和Puchowicz，M。A.（2015）。饮食诱导的酮症大鼠脑中葡萄糖向氧化代谢的碳分流减少。 J Neurochem 132（3）：301-312。