材料和试剂

3毫升一次性移液管（Bioland Scientific，目录号：TPP02-11）
离心瓶250毫升（Fisher Scientific，目录号：05-564-1）
制造商：Thermo Fisher Scientific，目录号：3141-0250。
用冰桶
25 G 5/8针（Fisher Scientific，目录号：14-826AA）
制造商：BD，目录号：305122。
1毫升注射器（BD，目录号：309659）
18 G针（Fisher Scientific，目录号：14-826-5G）
制造商：BD，目录号：305195。
50 ml注射器（Fisher Scientific，目录号：14-955-461）
铅笔
推针（Staples，目录号：480117）
面罩（Cellucap Manufacturing，目录号：1826EL）
碘擦（Dynarex，目录号：B003U463PY）
蛋架/盒子（提供含胚蛋，或者当您购买常规/未经加工的鸡蛋时，您可以从杂货店获得常规鸡蛋）
鸡胚鸡蛋（48个鸡蛋，9-10天）（Charles River，目录号：10100332）
Duco ®水泥多用途家用胶水（ITW Consumer，Duco Cement，目录号：62435）
仙台病毒库存（ATCC，目录号：VR-105或目录号：VR-907）
具有Ca 2 + 和Mg 2+ 的PBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：14040133）
70％乙醇
Bleach（Essendant，产品目录号：CLO30966CT）
0.5 M EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：R1021）

设备

移液器（200μl和1,000μl;任何产品都很好）
生物安全柜（如果是BSL2级别，任何类型都可以）
1 L量筒（赛默飞世尔科技，目录号：3664-1000）
蛋孵化器（最多41个鸡蛋;农场创新者，带自动蛋转子的数字循环空气孵化器，型号：4250）
冰箱/ 4°C冷室
高速离心机，带250毫升瓶的固定角转子（Beckman Coulter，型号：Avanti ® J-E）
声波水浴（Skymen清洁设备，型号：JP-008）
手电筒（Defiant，目录号：HD15FL04-3或Caliburn Lighting，目录号：PISTOL-TRIPOD-RCH）＆nbsp;
剪刀（世界精密仪器，目录号：14192-G）
镊子（World Precision Instruments，目录号：501974）

程序

第10天蛋蛋糕
通过蛋清消除不育和可育的死蛋，用铅笔标记胚胎的位置和空气细胞（图1）。你需要一个黑暗的房间和集中的光源。活胚胎的最佳证据是发育良好的血管。
注意：鸡蛋培养箱的容量为41个鸡蛋。如果您有更大容量的鸡蛋孵化器（例如，160个鸡蛋），您可以订购180个鸡蛋，并处理160个鸡蛋。

图1.带有气囊的鸡蛋。通过对光（左）可视化气囊。沿着气室边缘画一条线（左图中的箭头），并在黑暗的房间里用强光照下铅笔在胚胎的位置标记X（右）。
注意：这是常规/非胚胎蛋的一个例子。在第10天，你会看到一个胚胎是一个略带黑色的斑点和红色的血管（右），在胚胎的蛋中进行光照。
第10天尿囊接种
在生物安全柜中，将无菌的仙台病毒原种稀释至无菌PBS中的浓度为1×10 6 pfu / ml，其中Ca 2+ 和Mg 2+ < / SUP>。接种物为0.2ml，含有2×10 5 p pfu。将病毒管放在冰上。
1. 用70％乙醇擦拭蛋的顶部（气室侧）。
2. 用碘擦拭鸡蛋顶部并让其干燥。
3. 用酒精浸泡推针在与胚胎位置相对的位置和气囊边缘下方10 mm的位置（图2）。
  注意：血管通常不会到达该区域（气囊边缘下方10 mm）。尿囊液不会从穿孔中漏出。
  
  图2.带有穿孔的鸡蛋。在气囊边缘下方10 mm处与胚胎相对的位置用推针打孔。
4. 将25 G 5/8针头插入刀柄，输送0.2 ml接种物。不要注入任何空气。
5. 用Duco水泥密封孔，让其干燥。
6. 将鸡蛋送回培养箱，打开翻转器。
  注意：鸡蛋孵化器包含每四个小时翻蛋的功能，使蛋黄重新定位于壳外，使胚胎发育安全。
第12天蛋蛋糕
在一天结束时给鸡蛋上蜡，标记并丢弃死鸡蛋。将所有现场的放在冰箱/冷藏室。不要堆叠它们，因为它们需要快速冷却以适当收缩血管。将鸡蛋放在寒冷的夜间，然后在第二天处理。
第13天收获尿囊液
从这一步骤开始，所有程序都需要在生物安全柜中进行。建议戴口罩，因为病毒会在人体内引起轻微的呼吸道症状。使用剪刀和镊子切断覆盖气囊的外壳。打破壳膜，避免在50 ml注射器上用18 G针头破坏卵黄或血管，并吸入尿囊液（淡黄色）（图3）。从一个大的鸡蛋通常可以收集10-15毫升。注意蛋黄（非常黄色）和蛋白（白蛋白：透明且非常粘稠）（图4）。具有病毒接种的蛋黄和蛋白在外观和气味方面与来自杂货店的常规/未发芽蛋没有任何差别。如果一个鸡蛋看起来很讨厌（即，蛋白看起来很白或淡黄色，和/或很臭），这是鸡蛋中细菌生长的现象，鸡蛋应该在立即漂白后扔掉（消毒）。将收集的尿囊液立即置于冰上的离心管（250 ml）中。
注意：在第13天，蛋黄不容易看见。血管不会到达气囊，冷却后的鸡蛋冷却后会缩小;红细胞和外壳会随着澄清而旋转出来，而不是问题。然而，膜片将与病毒共同纯化。因此，避免去除膜片。

图3.如何打开鸡蛋。 A.在气囊上打开一个洞。 B.用剪刀剪切外壳，但在气囊线的内侧稍微切割。 C.暴露的空气细胞和完整的壳膜。 D.用镊子完全剥离和去除壳膜; E.用18G针头和50ml注射器收集壳膜和胚胎（图中的蛋黄）之间的尿囊液。
注意：这是一个非胚胎蛋的例子。在实际病毒传播过程中，你会看到胚胎而不是黄色蛋黄。

图4.收集的尿囊液。尿囊液透明或略带浑浊，带黄色调。
通过离心浓缩SeV
1. 在冰上将尿囊液收集到250ml离心瓶（最大体积225ml）中。平衡瓶。
2. 将转子以2,600 x g 旋转25分钟以除去壳。不要使用刹车。
3. 将液体倒入装有2毫升0.5 M EDTA的新鲜离心瓶中。这将使颗粒更容易在以后重新悬浮。
4. 以27,000 x g 旋转转子90分钟以获得1 st 颗粒。将液体倒入量筒中进行体积测量，并在立即漂白后丢弃液体。
5. 使用2-3ml一次性移液管将沉淀重悬于含有1mM EDTA的冷PBS（具有Ca 2 + 和Mg 2 + ）中。将多个瓶子冷凝成一个瓶子。需要进行大量冲洗以重新悬浮第一颗粒。用冷PBS（含Ca 2+ 和Mg 2 + ）和1 mM EDTA将体积增加至约200 ml。
  注意：步骤E5和E6的目的是将多个颗粒组合成一个颗粒。如果您没有很多瓶子，则不需要这些步骤。
6. 以27,000 x g 旋转转子90分钟以获得第二颗粒。立即漂白后倒出液体并丢弃。
7. 用1mM EDTA将沉淀重新悬浮于约2ml冷PBS（具有Ca 2 + 和Mg 2 + ）中。再用8-10毫升冲洗剩余物，然后装入管中。
8. 超声处理（40kHz频率和35W超声功率）在室温下在声波水浴中最终悬浮2分钟以破坏病毒块。
9. 将其等分并在-80℃下冷冻。制作并冷冻两个小等分试样以测试病毒滴度。

笔记

该协议需要适当的设施（生物安全级别2）和经批准的机构生物安全委员会（IBC）协议。

致谢

Yamashita博士得到美国心脏协会科学家发展基金会（17SDG33660947）和加州大学洛杉矶分校（UCLA）临床和转化科学研究所（CTSI）资助（UL1TR001881）的支持，并得到加州大学洛杉矶分校CTSI KL2资助（KL2TR001882）和雪松的支持。 -Sinai CTSI临床学者补助金。我们要感谢Steven Emancipator博士在Yamashita博士职业发展早期的指导和John Nedrud博士之前的合作。该协议改编自我们以前的工作（Yamashita et al。，2007; Chintalacharuvu et al。，2008）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Chattopadhyay，S.，Fensterl，V.，Zhang，Y.，Veleeparambil，M.，Yamashita，M。和Sen，G。C.（2013）。干扰素调节因子3介导的细胞凋亡在仙台病毒持续感染的建立和维持中的作用。 J Virol 87（1）：16-24。
Chattopadhyay，S.，Marques，J.T.，Yamashita，M.，Peters，K.L.，Smith，K.，Desai，A.，Williams，B.R。和Sen，G.C。（2010）。通过IRF-3介导的Bax激活诱导病毒性凋亡。 EMBO J 29（10）：1762-1773。
Chattopadhyay，S.，Yamashita，M.，Zhang，Y。和Sen，G。C.（2011）。 IRF-3 / Bax介导的细胞凋亡途径，由病毒细胞质RNA和DNA激活，抑制病毒复制。 J Virol 85（8）：3708-3716。
Chintalacharuvu，S.R.，Yamashita，M.，Bagheri，N.，Blanchard，T.G。，Nedrud，J.G.，Lamm，M.E.，Tomino，Y。和Emancipator，S.N。（2008）。 T细胞因子极性作为免疫球蛋白A（IgA）糖基化的决定因素和实验性IgA肾病的严重程度。 Clin Exp Immunol 153（3）：456-462。
Fensterl，V.，White，C.L.，Yamashita，M。和Sen，G.C。（2008）。小鼠p56家族蛋白功能和诱导的新特征。 J Virol 82（22）：11045-11053。
Fukumi，H.，Nishikawa，F。和Kitayama，T。（1954）。引起血细胞凝集的小鼠致肺炎病毒。 Jpn J Med Sci Biol 7（4）：345-363。
Hermesh，T.，Moltedo，B.，Moran，T。M.和Lopez，C.B。（2010）。呼吸道病毒感染期间骨髓白细胞的抗病毒指导。细胞宿主微生物 7（5）：343-353。
Hermesh，T.，Moran，T。M.，Jain，D。和Lopez，C.B。（2012）。粒细胞集落刺激因子在呼吸道病毒感染期间保护小鼠。 PLoS One 7（5）：e37334。
Ishida，N。和Homma，M。（1978）。仙台病毒。 Adv Virus Res 23：349- 383。
Ishii，H。和Matano，T。（2015）。使用仙台病毒载体开发艾滋病疫苗。疫苗 33（45）：6061-6065。
Karron RA，C。P.（2007）。 Parainfluenza病毒（第5版）。宾夕法尼亚州费城：Lippincott Williams和Wilkins。
Kuroya，M.和Ishida，N。（1953）。新生儿病毒性肺炎（仙台类型）。 II。分离出一种具有血凝素活性的新病毒。 Yokohama Med Bull 4（4）：217-233。
Parker，J.C.，Whiteman，M。D. and Richter，C.B。（1978）。近交和远交小鼠品种对仙台病毒的易感性和实验室啮齿动物的感染率。感染免疫 19（1）：123-130。
Saga，K。和Kaneda，Y。（2015）。基于溶瘤性仙台病毒的癌症病毒疗法：近期进展。 Oncolytic Virother 4：141-147。
Yamashita，M.，Chattopadhyay，S.，Fensterl，V.，Saikia，P.，Wetzel，J.L。和Sen，G.C。（2012a）。表皮生长因子受体对Toll样受体3信号传导至关重要。科学信号 5（233）：ra50。
Yamashita，M.，Chattopadhyay，S.，Fensterl，V.，Zhang，Y。和Sen，G.C。（2012b）。与TRIF无关的TLR3信号分支。 J Immunol 188（6）：2825-2833。
Yamashita，M.，Chintalacharuvu，S.R.，Kobayashi，N.，Nedrud，J.G.，Lamm，M.E.，Tomino，Y。和Emancipator，S.N。（2007）。仙台病毒诱导的IgA肾病模型中的先天免疫反应分析。 Contrib Nephrol 157：159-163。
Yamashita，M.，Millward，C.A.，Inoshita，H.，Saikia，P.，Chattopadhyay，S.，Sen，G.C。和Emancipator，S.N。（2013）。抗病毒先天免疫干扰足细胞功能。 J Innate Immun 5（3）：231-241。