材料和试剂

微量离心管，1.5 ml，透明（BioExpress，目录号：C-3260-1）
二氧化硅膜旋转柱（Epoch Life Science，EconoSpin TM ，目录号：1920-250）
TempPlate非裙边96孔PCR板，薄型，自然（USA Scientific，目录号：1402-9500）
96孔板实心白（康宁，目录号：3912）
96孔板透明平底（康宁，目录号：3596）
Bradford试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3059-100G）
Tris（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
超纯ADP（Cell Technology，目录号：ADP100-2）
电子。大肠杆菌多磷酸激酶（PPK）（用于表达和纯化大肠杆菌 PPK，参见Gray et al。，2014）
二硫苏糖醇（DTT），＆gt; 99％纯度，无蛋白酶（Gold Biotechnology，目录号：DTT25）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771-1KG）
95％v / v乙醇
QuantiLum ®重组荧光素酶（Promega，目录号：E1701;等分试样的精确浓度可能不同）
N otes：
1. 准备酶的等分试样并储存在-80°C的小玻璃瓶中。
2. 解冻并在每次实验中使用酶。
3. 丢弃所有未使用的产品。
4. 不要进行冻融循环。
硫氰酸胍（Sigma-Aldrich，目录号：G6639-250G）
二氧化硅（Sigma-Aldrich，目录号：S5631）
NaCl（Fisher Scientific，目录号：S271-10）
EDTA（Fisher Scientific，目录号：BP120-500）
HEPES（pH 7.5）（Fisher Scientific，目录号：BP310-100）
硫酸铵（Fisher Scientific，目录号：A702-500）
Tricine缓冲液（pH 7.8）（Sigma-Aldrich，目录号：T0377）
MgSO 4 （赛默飞世尔科技，目录号：M63500）
叠氮化钠（MP Biomedicals，目录号：210289125）
Luciferin（Biotium，目录号：10101-1）
甘氨酰甘氨酸（pH 7.8）（MP Biomedicals，目录号：210185610）
双蒸<子> 2 0
盐酸（Fisher Scientific，目录号：A144212）
GITC裂解缓冲液（见食谱）
Glassmilk（见食谱）
新洗（NW-）缓冲液（见食谱）
洗脱缓冲液（见食谱）
PPK缓冲液（见食谱）
荧光素酶反应缓冲液（见食谱）
Luciferin工作解决方案（见食谱）

设备

Eppendorf移液器：100-1,000μl，20-200μl，2-20μl，1-10μl
Thermomixer（Eppendorf，型号：5350）
微量离心机（Eppendorf，型号：5415D）
孵化器37°C（VWR，型号：1555）
-80°C冰箱（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：Innova ® U725，目录号：U9440-0002）
具有发光读数功能和进样器模块的Fluostar Omega板读数器（BMG Labtech，目录号：0415-102）
pH计
涡流混合器
冰箱（4°C）

软件

Fluostar Omega控制和评估软件（BMG Labtech，目录号：1300-501）

程序

该方法非常适用于从革兰氏阴性PPK细菌中提取和定量polyP，包括 P.铜绿假单胞菌，在压力下积累polyP，例如，亚致死浓度的次卤酸或营养饥饿（有关生长和压力处理的详细信息，请参阅Ault-Riché等。，1998; Groitl et al。，2017）。

准备用于提取polyP的样品
注意：由于GITC被认为具有中度毒性，因此请保留单独的GITC废液容器以便提示和流通。
1. 收集足以产生100-300μg总细胞蛋白的细菌细胞（OD 600 = 1时约1 ml的铜绿假单胞菌培养物），并将细胞分解为13,000 xg ，4°C。
2. 丢弃上清液。
3. 将细胞沉淀重悬于0.25ml GITC裂解缓冲液中。
4. 将样品在Thermomixer中在95°C孵育10分钟而不混合。
5. 取20μl样品测定蛋白质浓度（参见步骤B2）。
6. 冷却至室温后，将样品保存在-80℃，直至进一步操作。由于GITC使包括蛋白酶在内的蛋白质变性，因此降解无关紧要。
  注意：我们总是在7天内处理样品。
确定样品的蛋白质浓度
1. 通过将BSA溶解在GITC裂解缓冲液中至终浓度0,0.25,0.5,1,1.5或2μg/μl来制备标准曲线。
2. 将195μlBradford试剂与5μlBSA标准品或5μl裂解的样品混合，并在室温（RT）下在微量离心管中孵育5-10分钟。每个样品使用一式三份。
3. 将样品转移到具有平底的96孔透明板中，并在Fluostar Omega板读数器中测量595nm处的吸光度。
4. 如数据分析部分所述计算蛋白质浓度。样品将在最后标准化。
提取polyP
1. 从步骤A6解冻样品并涡旋。＆nbsp;
2. 随后添加到样品中：15μl10％w / v SDS，0.5ml 95％v / v乙醇和5μl玻璃乳（参见配方）并在其间涡旋。
3. 将样品转移至二氧化硅膜旋转柱并在微量离心机中以3,000 x g ，RT进行旋转3分钟。请注意，我们观察到流速中的颗粒形成速度高于3,000 x g 。
4. 丢弃流通。
5. 加入0.75毫升NW-Buffer（见食谱）。
6. 在室温下以3,000 x g 旋转3分钟并丢弃流过物。
7. 重复步骤C5和C6。
8. 通过在室温下以11,000 x g 离心3分钟来干燥样品。
9. 将柱子转移到干净的1.5ml微量离心管中。
10. 向柱中加入50μl洗脱缓冲液，在室温下孵育15分钟，并在室温下以11,000 x g 离心3分钟洗脱polyP。
11. 样品可以在-80°C下储存。
  注意：处理应在1-3天内完成。
将polyP转换为ATP
1. 从步骤C11解冻样品并涡旋混合。
2. 根据样品数量准备两个PPK Assay Master Mixes。 Master mix I（ + PPK）包含50 nM的 E.线圈 PPK，而主混合物II（ -PPK）则没有。没有PPK的反应用于校正在该过程中提取的细胞ATP。以下卷是指一个样本所需的数量。
  PPK Assay Master Mix I（+ PPK）（每个样品总共20μl）：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：1100px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>7.5μl
  4倍PPK缓冲液
  0.9μl
  超纯ADP [原料浓度8.4 mM（批次间可能不同）;最终浓度为250μM]
  0.7μl E.大肠杆菌 PPK [原液浓度2.4μM（批次间可能不同）;最终浓度为50 nM]
  10.9μl H _{2 0 < br />
  PPK Assay Master Mix II（-PPK）（每个样品总共20μl）：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：1100px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>7.5μl
  4倍PPK缓冲液
  0.9μl
  超纯ADP超纯ADP [原液浓度8.4 mM（批次间可能不同）;最终浓度为250μM]
  11.6μl
  H _{2 0 < br />}}
3. 将20μlPPKAssay Master Mix I或II与10μl样品混合，上下移液两次。
4. 将反应在37℃下在培养箱中孵育1小时，以使PPK将polyP完全转化为ATP。
5. 通过在热式混合器中将样品在95℃下孵育2分钟来灭活PPK。
6. 在冰上或4℃下冷却样品，然后在11,000 x g 旋转1分钟并继续上清液。
检测ATP
注意：其中大部分是Omega读板器特有的。根据您可用的仪器进行必要的修改。
1. 取10μl等份的PPK消化样品（在 PPK Assay Master Mix I中孵育）和未消化的样品（在 PPK Assay Master Mix II中孵育），并将它们转移到白色平底96孔板的孔。
2. 如下准备荧光素酶反应主混合物并保持在室温下。
  荧光素酶反应混合物（总共10毫升）：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：1100px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>0.5毫升
  20倍荧光素酶反应缓冲液
  10μl
  1 M DTT（终浓度为1 mM）（在冰上解冻）
  1毫升
  荧光素工作溶液（终浓度为100μM）
  1μl
  荧光素酶[原液浓度244μM（批次间可能不同），最终浓度为25 nM]
  8.5毫升
  H _{2 0 注意：反应对温度非常敏感，因此不要将反应主混合物储存在冰上。由于荧光素酶很快失去其活性，因此在制备后15-20分钟内使用反应主混合物。}
3. Omega酶标仪的主要注射器，含2 ml Luciferase Reaction Master Mix。
4. 将Omega读板器的温度设置为25°C，增益设置为3,000（这是OMEGA读板器特有的，可能在其他读板器中有所不同）。
5. 向每个样品注射90μl荧光素酶反应主混合物，混合10秒快速混合并在2-3分钟内测量发光。每个周期的长度取决于样品的数量。
6. 以与未消化的样品相同的顺序测量PPK消化的（用 PPK-Assay Master Mix I孵育）样品（用 PPK-Assay Master Mix II孵育）。在2-3分钟内测量发光。
7. 完成后，用4 ml dH 2 O灌注清洗注射器。

数据分析

计算每个样品中的蛋白质含量：
1. 标准曲线：将测量的吸光度与标准曲线的相应BSA浓度作图。
2. 确定趋势线并计算线性方程。
3. 使用趋势线的等式计算每个样品的蛋白质量。
  注意：样品的蛋白质含量应在100-300μg范围内。必要时稀释。
计算相对于未处理细胞处理的polyP的倍数变化
1. 减去在不存在PPK的情况下孵育的样品的相对发光单位（RLU）值（用 PPK-Assay Master Mix II孵育）从孵育的相同样品的值中减去PPK的存在（与 PPK-Assay Master Mix I一起孵育），通常是第2周期。
  注意：未消化样本的RLU值代表基线。
2. 将每个样品的所得RLU标准化为相应的蛋白质量。
3. 通过将处理后样品的值（即，分别用HOCl，HOBr和HOSCN处理）标准化为未处理的样品，计算每个样品中polyP积累的倍数变化。
  
  图2. P中polyP的提取和定量。铜绿假单胞菌 PA14野生型和Δ ppk 细胞。 PA14野生型（WT）和Δ ppk 细胞生长至对数中期，并与亚致死浓度的HOCl（0.5mM），HOBr（0.15mM）或HOSCN（0.25mM）一起温育2.5小时。然后，通过与玻璃乳结合提取polyP，并在将提取的polyP转化为ATP后通过基于荧光素酶的检测系统进行定量。将得到的量标准化为各样品中的各蛋白质量。相对于未处理的细胞计算polyP水平的倍数变化。实验独立进行至少三次。数据代表平均值±S.D。 [版权所有© 2017，Wiley Online Library（Groitl et al。，2017）]。

笔记

认为polyP短链（<60Pi单位）与较长链的结合效率低于玻璃乳，并且在该提取方法期间很可能丢失。虽然细菌每链产生多达1,000个Pi分子的polyP，但真核生物中polyP的平均链长相当短。对于市售的polyP 45 ，它是不同polyP的混合物，富含polyP链，含有45个磷酸酯残基，我们使用polyP浓度测定polyP的回收率在24％和38％之间。 500 nM和10 mM。与先前描述的方法相比，先前描述的方法允许类似的恢复，然而，基于PPK的检测系统似乎更敏感（Canadell 等人，2016; Ota和Kawano，2017）。
本方案设计用于在用亚致死浓度的次卤酸处理后或在营养物饥饿后从富含培养基中提取和定量polyP（从富含培养基转变为具有低磷酸盐和缺乏氨基酸的基本培养基）。已知这些条件导致大量长链polyP的积累（Ault-Riché et al。，1998; Gray et al。，2014）。对于含有较低polyP水平的样品，可在玻璃奶提取polyP后加入两个额外步骤，以降低PPK反应和/或ATP检测过程中干扰的风险：（i）用腺苷三磷酸双磷酸酶处理降低背景ATP水平，和（ ii）Benzonase处理以去除DNA / RNA（Ault-Riché et al 。，1998）。

食谱

GITC裂解缓冲液（500毫升）
4 M硫氰酸胍
50mM Tris-HCl（pH 7.0）
在室温下存放长达数月的时间＆nbsp;
Glassmilk（25毫升）
注意：结合容量≥100nmol多磷酸盐（以Pi当量计）/μl。 Glassmilk也会结合DNA和RNA。
1. 将5克二氧化硅悬浮在40毫升0.1M HCl中并充分混合
2. 通过在室温下以2,000 x g 离心5分钟来沉淀玻璃奶
3. 去除上清液并重复步骤a和b
4. 用10ml ddH 2 O洗涤沉淀
5. 重复步骤d至少一次并检查pH值（pH值必须为中性）
6. 在室温下储存长达数月
新洗（NW）缓冲液（500毫升）
5 mM Tris-HCl（pH 7.5）
50 mM NaCl
5 mM EDTA
50％v / v乙醇
在室温下储存长达数月
洗脱缓冲液（25毫升）
50mM Tris-HCl（pH 8）
在室温下储存长达数月
PPK缓冲液（4倍）（25毫升）
200 mM HEPES（pH 7.5）
200 mM硫酸铵
20mM MgCl 2
在室温下储存长达数月
荧光素酶反应缓冲液（20倍）（25毫升，在室温下储存几个月）
500 mM Tricine缓冲液（pH 7.8）
100mM MgSO 4
2 mM EDTA
2 mM叠氮化钠
2 mg / ml BSA
在室温下储存长达数月
Luciferin工作溶液（50x 1 ml）
1mM荧光素溶于25mM甘氨酰甘氨酸（pH 7.8）中分装成1 ml等分试样并在-80°C下储存长达数月。

致谢

这项工作由美国国立卫生研究院拨款GM065318和GM116582资助到联合国。 J.-U. D.得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（DA 1697 / 1-1）的博士后奖学金。我们感谢Michael J. Gray博士（阿拉巴马大学）帮助建立分析和富有成效的讨论。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Ault-Riché，D.，Fraley，C。D.，Tzeng，C。M. and Kornberg，A。（1998）。新型检测揭示了在大肠杆菌中调节应激诱导的无机多磷酸盐积累的多种途径。 J Bacteriol 180（7）：1841-1847。
Canadell，D.，Bru，S.，Clotet，J。和Ariño，J。N.（2016）。芽殖酵母中多磷酸盐的提取和定量 Saccharomyces cerevisiae 。 Bio -protocol 6（14）：e1874。\
Dahl，JU，Gray，MJ，Bazopoulou，D.，Beaufay，F.，Lempart，J.，Koenigsknecht，MJ，Wang，Y.，Baker，JR，Hasler，WL，Young，VB，Sun，D。和Jakob ，U。（2017）。抗炎药物美沙拉嗪靶向细菌多磷酸盐积累。 Nat Microbiol 2：16267。
Gomez Garcia，M。R.（2014）。通过尿素-PAGE提取和定量poly P，poly P分析。 Bio-protocol 4（9）：e1113。
Gray，M。J.和Jakob，U。（2015）。多磷酸盐的氧化应激保护 - 老玩家的新角色。 Curr Opin Microbiol 24：1-6。
Grey，MJ，Wholey，WY，Wagner，NO，Cremers，CM，Mueller-Schickert，A.，Hock，NT，Krieger，AG，Smith，EM，Bender，RA，Bardwell，JC和Jakob，U。（2014）。多磷酸盐是一种原始的伴侣。 Mol Cell 53（ 5）：689-699。
Groitl，B.，Dahl，J.U.，Schroeder，J。W.和Jakob，U。（2017）。铜绿假单胞菌抗微生物氧化剂的防御系统。 Mol Microbiol 106（3）：335-350。＆nbsp;
Maisonneuve，E。和Gerdes，K。（2014年）。细菌持久性的分子机制。细胞 157（3 ）：539-548。
Ota，S。和Kawano，S。（2017年）。提取和钼蓝量化 Parachlorella 中磷酸盐和多磷酸盐的总量。生物协议 7（17）：e2539。
Rao，N.N.，Gomez-Garcia，M.R。和Kornberg，A。（2009）。无机多磷酸盐：对生长和生存至关重要。 Annu Rev Biochem 78：605-647。