材料和试剂

移液器吸头200μl（Sigma-Aldrich，目录号：P5161）＆nbsp;
组织培养瓶F75（75 cm 2 表面积）（TPP Techno Plastic Products，目录号：90075）
组织培养瓶F150（150 cm 2 表面积）（TPP Techno Plastic Products，目录号：90150）
细胞培养瓶F25（25 cm 2 表面积）（Corning，目录号：3055）
组织培养皿35 mm（SARSTEDT，目录号：83.3900）
无菌管50毫升（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
无菌管15毫升（Fisher Scientific，目录号：05-539-12）
血清移液管10 ml（SARSTEDT，目录号：86.1254.001）
透析膜Spectra / Por ® 6（VWR，Spectrum，目录号：734-0646）
昆虫细胞系 Spodoptera frugiperda （Sf9）（Oxford Expression Technologies，目录号：100201）
昆虫细胞系 Trichopulsia ni （High Five）（Tni）（由PhDJ.Pérez-Gil慷慨捐赠，Dpt。生物化学与分子生物学，生物学系，马德里大学Complutense，西班牙马德里）
杆状病毒转移载体pAcGP37A（BD，BD Pharmingen TM ，目录号：21220P）
重组转移载体pAcGP67A-E2 661 ，根据Rodriguez-Rodriguez et al。，2009中描述的方法获得。
Flash BAC GOLD套件（Oxford Expression Technologies，目录号：100201）组成：
1. flash BAC TM DNA
2. 阳性对照转移质粒DNA（表达 lac Z）＆nbsp;
3. Baculofectin II
In -ct-XPRESS TM 无蛋白质的昆虫细胞培养基含L-谷氨酰胺（Lonza，目录号：12-730Q）
Neubauer的计数相机（VWR，MARIENFELD，目录号：631-0696）
庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1264）
TC100 Insect Medium（Lonza，目录号：BE02-011F）
Ni 2 + - 次氮基三乙酸琼脂糖（Ni-NTA琼脂糖）树脂（QIAGEN，目录号：30230）
Tris-Base（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
NaCl（默克，目录号：106404）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：56750）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：03695）
十二烷基硫酸钠盐（默克，目录号：1.13760.1000）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898-1KG）
Bromophenol blue（美国生物，目录号：12370）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：A8887-500G）
N，N'-亚甲基双（丙烯酰胺）（Sigma-Aldrich，目录号：M7279-250G）
过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678-100G）
N，N，N'，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610801）
考马斯亮蓝R-250（西格玛奥德里奇，目录号：B8647）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415-1L）
乙酸（默克，目录号：1000063）
3x蛋白质电泳应用缓冲液（见食谱）
运行电泳缓冲液（见食谱）
蓝染解决方案（见食谱）
漂白液（见食谱）
分离凝胶（见食谱）
浓缩凝胶（见食谱）

设备

移液器
-80°C冰箱
CO 2 水套式孵化器（NuAire，型号：NU-2700 IR Autoflow）＆nbsp;
层流室（Azbil Telstar，型号：BV-100）
实验室离心机（MPW MED.INSTRUMENTS，型号：MPW-223e）
立式显微镜（Nikon Instruments，IZASA，型号：H550S）
5毫升塑料注射器
Mini-PROTEAN ® Tetra电泳系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-8001）
塑料桶（Labotienda，目录号：BTL006）
紫外分光光度计（Shimadzu，型号：UV-1800）
15 L塑料桶用于透析

程序

通过共转染产生重组杆状病毒
1. 用含有庆大霉素的最终浓度为10μg/ ml的2ml Insect-XPRESS TM 培养基中的1.5×10 6 Sf9细胞培养35mm组织培养皿，以形成亚汇合单层。昆虫细胞的数量通过使用Neubauer的相机来确定。
2. 在27°C下在CO 2 培养箱中孵育1小时，以使细胞附着到平板上。
3. 加入以下试剂，在1.5 ml聚苯乙烯管中制备DNA和转染试剂的共转染混合物：
  1. 100μl无血清培养基（TC100）
  2. 来自 flash BAC试剂盒的100 ng病毒DNA
  3. 来自 flash BAC试剂盒的500 ng转移质粒（pAcGP67A-E2 661 重组质粒或 lac Z阳性对照转移载体）
  4. 来自 flash BAC试剂盒的1.2μlbaculoFECTINII
  混合并在室温下放置15分钟。
4. 将5ml不含血清的TC100培养基倒入单层中，轻轻摇动并倾析成废物，洗涤细胞单层两次。每个35毫米培养皿中加入1毫升不含血清的TC100培养基。如果将细胞维持在无血清培养基中，则不必洗涤单层细胞。在这种情况下，从35毫米培养皿中取出并丢弃1毫升培养基。
5. 将转染混合物（111.2μl）加入35mm培养皿中。
6. 在27°C下在CO 2 培养箱中孵育过夜而不摇动。
7. 将含有10μg/ ml庆大霉素的1ml Insect-XPRESS TM 培养基加入35mm培养皿中。
8. 在CO 2 培养箱中于27℃孵育4天而不摇动。
9. 通过将培养基倒入15ml无菌容器中收获含有重组病毒的培养基。在实验室离心机中以325 x g 离心15分钟。收集上清液，置于4℃冰箱中避光保存。如需长期储存，请将容器保存在-80°C。
重组病毒的扩增
注意：一旦获得纯化的重组杆状病毒，必须进行扩增才能获得重组蛋白。
1. 每25cm 2 表面积种子2×10 6个 Tni昆虫细胞，并在27℃下孵育1小时。
2. 每25cm 2 表面积（Flask F25,1ml; Flask F75,3ml; Flask F150,6ml）加入1ml含有重组病毒的上清液。
3. 在27℃下在CO 2 培养箱中孵育1小时，搅拌非常缓慢（每10分钟摇动烧瓶）以保持细胞单层的水合，并使接种体积最小。＆nbsp;
4. 将相关体积的Insect-XPRESS TM 培养基与10μg/ ml的庆大霉素一起加入烧瓶中（Flask F25，直到5ml; Flask F75，直至10ml; Flask F150，直至30ml）。
5. 在没有搅动的情况下在CO 2 培养箱中于27℃孵育5天。
6. 将上清液收集在15或50ml无菌管中以回收扩增的重组病毒，并在实验室离心机中以325 x g 离心15分钟。
7. 使用上清液进行第二轮扩增。将上清液转移到单独的无菌管中并重复步骤B2至B6。通常，两轮或三轮扩增对于大规模感染足以允许表达目的重组蛋白。
HCV E2 661 蛋白的产生和纯化
1. 制备10个150cm 2 表面积的烧瓶，其中8-10×10 6个 Tni昆虫细胞在含有10mg / ml庆大霉素的20ml培养基中培养1小时。在没有搅拌的情况下在CO 2 培养箱中加热27°C。
2. 除去培养基，每瓶加入6ml含有重组E2 661 杆状病毒的上清液。
3. 在27℃下在CO 2 培养箱中孵育1小时，同时进行非常缓慢的搅拌（每10分钟摇动烧瓶）以保持细胞单层的水合，具有最小体积的接种物。
4. 加入24ml含有庆大霉素的Insect-XPRESS TM 培养基，每瓶10μg/ ml。
5. 在27°C孵育5天。
6. 收集上清液并在325 x g 下离心15分钟。
7. 在15L塑料桶中对20L（10L，2x）50mM Tris-HCl，pH 8.0,300mM NaCl缓冲液透析上清液（300ml，10个烧瓶，30ml）。
8. 将上清液加载到预先用50mM Tris-HCl，pH 8.0,300mM NaCl缓冲液平衡的2ml Ni-NTA-琼脂糖柱上。
9. 向顶部加入20-40ml 50mM Tris-HCl，pH8.0,300mM NaCl，10mM咪唑缓冲液洗涤柱子，让溶液流入烧杯中以收集废物。洗涤直至280nm处的光密度低于0.03。通过使用UV分光光度计测定280nm处的吸附。
10. 通过加入10-30ml 50mM Tris-HCl，pH 8.0,300mM NaCl，30mM咪唑洗涤柱，直至280nm处的光密度低于0.03。
11. 通过加入50mM Tris-HCl，pH 8.0,300mM NaCl，200mM咪唑洗脱E2 661 蛋白质。收集1-1.2毫升的馏分。在1.5毫升Eppendorf或玻璃管中。通常10-12管足以洗脱;因此，建议操作员在1毫升后更换管子进行手动收集。＆nbsp;
12. 通过在紫外分光光度计中测量每个部分在280nm处的光密度来检测蛋白质。
13. 通过SDS-PAGE检查重组E2 661 蛋白的纯化步骤。为了检查蛋白质的纯度，从每个200mM咪唑级分每孔加载20μl样品。在考马斯蓝染色后，通过在48kDa处出现独特的分离条带来测试重组E2 661 的纯度。
14. 在单个级分中收集含有显着量（280nm处的光密度高于0.3）的纯E2 661 蛋白质的级分。
15. 用50mM Tris-HCl，pH 8.0,300mM NaCl缓冲液透析E2 661 蛋白质。＆nbsp;
获得纯重组蛋白E2 661 的方案如图1所示。注意步骤A不包括在方案中。

图1.产生重组蛋白E2 661
的方案
SDS-PAGE（蛋白质电泳）
注：在He（2011）和Yan（2011）中描述了进行SDS-PAGE的更详细的协议。
1. 准备电泳系统。
2. 准备分离凝胶（见配方5）。＆nbsp;
3. 用巴斯德吸管混合并沉淀到凝胶支架中。
4. 准备浓缩凝胶（见食谱6）。＆nbsp;
5. 用巴斯德吸管混合并沉积在分离凝胶的顶部。
6. 将10μl3x蛋白质电泳应用缓冲液（参见配方1）加入20μl样品中。
7. 在95°C加热5分钟。
8. 加入浓缩凝胶中。
9. 在室温下以每个凝胶25mA开始运行电泳缓冲液（参见配方2）中的电泳，直到标记物到达凝胶末端。
10. 在室温下将凝胶在考马斯蓝染色溶液（参见配方3）中孵育10分钟。
11. 将凝胶在漂白液中孵育（参见配方4）以检测蛋白质。

数据分析

对应于PAGE-SDS凝胶的标准纯化方法的结果显示在图2中。泳道2,3和4显示用10mM（泳道2）和30mM（泳道3和4）咪唑缓冲液洗涤步骤，其中一些与Ni-NTA-琼脂糖柱弱附着的污染蛋白被消除。可以看出，蛋白质E2 661 保留在柱中，并且仅在使用200mM咪唑缓冲液时洗脱（图2，泳道5和6）。如凝胶所示，重组蛋白是纯的。

图2.重组蛋白E2 661 的纯化步骤的SDS-PAGE。（1）分子量阶梯; （2）用10mM咪唑缓冲液洗涤; （3,4）用30mM咪唑缓冲液洗涤; （5,6）用200mM咪唑缓冲液洗脱E2 661 蛋白质。

食谱

3x蛋白质电泳应用缓冲液
Tris 150 mM，pH 7.6
EDTA 6 mM
3％（w / v）SDS
30％（v / v）甘油
0.06％（w / v）溴酚蓝
15％（v / v）β-巯基乙醇
运行电泳缓冲液
Tris 0.025 M，pH 8.3
甘氨酸0.192M，含0.1％SDS
蓝染解决方案
0.3％（w / v）考马斯亮蓝R-250
45％（v / v）甲醇
10％（v / v）乙酸＆nbsp;
漂白液
7.5％（v / v）乙酸
20％（v / v）甲醇
分离凝胶
650μlH 2 O
1.82ml Tris 1M，pH 8.8
2.5毫升丙烯酰胺 - 双丙烯酰胺，30％
55μlSDS10％
12μl0.075％TEMED
14μl0.02％（w / v）过硫酸铵
浓缩凝胶
2.0％丙烯酰胺 - 双丙烯酰胺，4％
55μlSDS10％
8μl0.075％TEMED
8μl0.02％（w / v）过硫酸铵

致谢

这项工作得到了西班牙MinisteriodeEducaciónyCiencia的资助BFU 2006-13033和SANTANDER / COMPLUTENSE PR26 / 16-20271研究项目的支持。

利益争夺

作者声明存在任何利益冲突或竞争利益。

参考

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他，F。（2011）。 Laemmli-SDS-PAGE。 Bio-protocol Bio101：e80。
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