材料和试剂

注意：除非另有说明，否则所有原液应在室温下保存。

微量离心管（Sigma-Aldrich，目录号：Z336769）
10 cm组织培养皿（Thermo Fisher Scientific，Nunc TM ，目录号：150350）
细胞刮刀（TPP Techno Plastic Products，目录号：99002）
移液器吸头（STARLAB，TipOne ®过滤器吸头，目录号：S1120）
神经干细胞Cor3-1（来自爱丁堡大学的Steve Pollard）
P19细胞（ATCC，目录号：CRL-1825）
蛋白酶鸡尾酒抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：04693116001）
由粉末制备的500mM HEPES-KOH，pH 7.5（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
0.5 mM EDTA，pH 8.0（Sigma-Aldrich，目录号：93283）
由粉末制备的500mM EGTA，pH8.0（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
由粉末制备的5 M NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
由粉末制备的1M MgCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
由粉末制备的1M Tris-HCl，pH 8.0（Sigma-Aldrich，目录号：RDD008）
由粉末制备的1M Tris-HCl，pH 7.5（Sigma-Aldrich，目录号：RDD008）
由粉末制备的1M Tris-HCl，pH 6.8（Sigma-Aldrich，目录号：RDD008）
在去离子水中稀释的50％甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
10％SDS（Sigma-Aldrich，目录号：71736）
用去离子水稀释的10％NP-40（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
用去离子水稀释的10％Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
由粉末（Sigma-Aldrich，目录号：43815）制备的100mM DTT储存在-20℃
PBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010023）
Benzonase 10 ku（Merck，Novagen ®，目录号：70664-3）
α-Tubulin抗体（Abcam，目录号：ab7291）
LaminB（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-6216或Gene Tex，目录号：GTX103292）
组蛋白H3（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录号：ab1791）
E1缓冲液（见食谱）
E2缓冲液（见食谱）
E3缓冲液（见食谱）
E3（benzonase）缓冲液（见食谱）

设备

移液器
Nanodrop（例如，Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 3300）
水浴超声波仪（例如，Diagenode，型号：Bioruptor ®）
冷冻离心机（例如，Eppendorf，型号：5415 R）
旋转平台（例如，Grant Instruments，360°垂直多功能旋转器）

程序

注意：

作为细胞密度的指导，神经干细胞Cor3-1以10 x培养皿和P19细胞的1.5 x 10 6 接种。在10 cm培养皿中以1.0 x 10 6 接种，达到70％-80％汇合。
在开始之前，确保离心机在4°C下冷却。

用室温PBS洗涤细胞一次。
用细胞刮刀在1ml冰冷的PBS中收集细胞，并转移到1.5ml微量离心管中。
在冷冻离心机中于4℃下在130℃下沉淀细胞3分钟。
裂解细胞沉淀用5体积的冰冷E1缓冲液，用于1体积的细胞沉淀。
轻轻上下移液（5次），然后在1,100 x g 4℃下离心2分钟。
将上清液收集在新管（细胞质部分）中。
用与前一步骤（步骤4）相同体积的E1缓冲液轻轻移液重悬沉淀。＆nbsp;
立即在1,100 x g 4℃下离心2分钟。
弃去上清液，用与前一步骤（步骤4）相同体积的E1缓冲液轻轻移液，重悬沉淀。＆nbsp;
将管留在冰上10分钟。
在1,100 x g 4℃下离心2分钟。
丢弃上清液。
通过在2体积的冰冷E2缓冲液中轻轻移液1小时的细胞沉淀重悬沉淀。
在1,100 x g 4℃下离心2分钟。
将上清液收集在新管（细胞核部分）中。
用与前一步骤（步骤13）相同体积的E2缓冲液重悬沉淀。
立即在1,100 x g 4℃下离心2分钟。
注意：通过移液，颗粒现在开始变得更难溶解;可能需要使用大口径尖端。
重悬沉淀，保持用于前一步骤的相同体积的E2（步骤13）。
将管留在冰上10分钟。
在1,100 x g 4℃下离心2分钟。
丢弃上清液。

用于蛋白质印迹分析：

通过在冰冷的E3缓冲液中移液（与步骤4中E1相同的体积）重悬沉淀。
注意：此阶段的颗粒非常粘，应采取预防措施，不要失去它。
在冰浴超声波仪中加热5分钟，最大功率30秒开/ 30秒关闭（即，在Bioruptor上设置H）。
注意：如有必要，应补充冰，以便在水浴顶部保持一层恒定的碎冰。
将所有级分（即，细胞质，细胞核和染色质）在16,000 x g 中于4℃离心10分钟。
将每种上清液转移到新鲜的微量离心管中。
测量蛋白质浓度（例如，Pierce BCA蛋白质分析试剂盒，Thermo Fisher Scientific，使用NanoDrop）并进行蛋白质印迹分析。
注意：核部分的蛋白质浓度可能很低，并且可能需要使用例如三氯乙酸法沉淀蛋白质（参见Paredes-Osses和Hardie，2013）。

用于下拉分析：

将沉淀重悬于冰冷的E3（benzonase）缓冲液中（与步骤4中E1所用的体积相同）。
轻弹管子以分离沉淀物。
以1：1,000稀释度添加benzonase。
将管放在旋转平台上，在室温下以15rpm旋转20分钟。
注意：消化核酸可能需要长达30分钟的孵化。 NP-40可以用0.1％SDS代替以增强反应，但SDS的存在可能会干扰下游应用。
将所有级分在16,000 x g 在4℃下离心10分钟。
将每种上清液转移到新鲜的微量离心管中。
测量蛋白质浓度并进行所需的下拉分析（例如，免疫沉淀或树脂下拉）。

数据分析

Gillotin et al。（2018）（ https://www.nature.com/articles/s41598-018-23056-4.pdf ）。为了评估细胞分级的效率，建议通过蛋白质印迹分析分析α-微管蛋白，LaminB和组蛋白H3的每个级分，分别代表细胞质，核和染色质组分。

食谱

注意：在开始之前准备好所有从原液中新鲜的溶液并保持在冰上。每种溶液都补充了蛋白酶抑制剂混合物，并且应考虑添加特异性抑制剂来研究翻译后修饰（例如，磷酸酶抑制剂，DUB抑制剂）。

E1缓冲区
50mM HEPES-KOH（来自500mM储备溶液，pH7.5）
140 mM NaCl（来自5 M储备溶液）
1 mM EDTA（来自500 mM储备溶液，pH 8.0）
10％甘油（来自50％原液）
0.5％NP-40（来自10％新鲜溶液）
0.25％Triton X-100（10％新鲜溶液）
1 mM DTT（100 mM储备溶液，保存在-20°C）
补充1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
E2缓冲区
10mM Tris-HCl（来自1M储备溶液，pH8.0）
200mM NaCl（来自5M储备溶液）
1 mM EDTA（来自500 mM储备溶液，pH 8.0）
0.5mM EGTA（来自500mM储备溶液，pH8.0）
补充1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
E3缓冲区
500mM Tris-HCl（来自1M储备溶液，pH 6.8）
500 mM NaCl（来自5 M储备溶液）
补充1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
E3（benzonase）缓冲液
50mM Tris-HCl（来自1M储备溶液，pH 7.5）
20 mM NaCl（来自5 M储备溶液）
1mM MgCl 2 （来自1M储备溶液）
1％NP-40
补充1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
准备使用时添加Benzonase（1：1,000稀释）

致谢

插图已经从施维雅医学艺术服务（Les Laboratoires Servier）进行了修改。这项工作在安娜菲尔波特的实验室（剑桥大学）改编自Jason Carroll实验室（剑桥大学）的协议。作者目前得到欧盟地平线2020研究和创新计划资助，资助协议No 713140（Meso_Brain项目， www） .mesobrain.eu ）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Dennis，D.J.，Han，S。和Schuurmans，C。（2018）。 bHLH神经发育，疾病和重编程中的转录因子。 Brain Res S0006-8993（18）30148-3。
Gillotin，S.，Davies，J。D.和Philpott，A。（2018）。亚细胞定位调节Ascl1的泛素化和降解。 Sci Rep 8（1）：4625。
Gillotin，S。和Guillemot，F。（2016）。微染色质免疫沉淀（μChIP）方案，用于对有限量细胞进行实时PCR分析。生物协议 6（12）：e1846。
Paredes-Osses，E。和Hardie，K.R。（2013）。铜绿假单胞菌的细胞分离。生物协议 3（19）：e922。