材料和试剂

0.2 ml PCR试管（Biosharp，目录号：BS-02-P）
1.5毫升Eppendorf管（Biosharp，目录号：BS-15-M）
移液器吸头（Biosharp，目录号：BS-10-T，BS-200-T，BS-1000-T）
培养皿（NEST Biotechnology，目录号：752001）
能力大肠杆菌DH5α细胞（CWBIO，目录号：CW0808）
pgRNA5质粒（Liu et al。，2017）＆nbsp;
pCas9质粒（Liu et al。，2017）＆nbsp;
琼脂糖（Biowest，目录号：111860）
GoldView I核染色染料（10,000x）（Solarbio，目录号：G8140）
AxyPrep TM DNA凝胶提取试剂盒（Corning，Axygen ®，目录号：AP-GX-250）
胰蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0042）
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
卡那霉素（Solarbio，目录号：K8020）
氯霉素（Fisher Scientific，目录号：BP904-100）
Q5 ®高保真DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0491L）
AxyPrep TM 质粒Miniprep试剂盒（Corning，Axygen ®，目录号：AP-MN-P-250）
Vazyme ClonExpress ® II一步克隆试剂盒（Vazyme Biotech，目录号：C112-01 / 02）
2x EasyTaq PCR SuperMix（+染料）（北京TransGen Biotech，目录号：AS111-11）
Tris base（Solarbio，目录号：T8060）
冰醋酸（国药化学试剂，目录号：10000218）
EDTA（Solarbio，目录号：E8030）
NaCl（国药化学试剂，目录号：10019328）
琼脂（Solarbio，目录号：A8190）
（NH 4 ） 2 SO 4 （Solarbio，目录号：A8821）
K 2 HPO 4 （Solarbio，目录号：D9880）
NaH 2 PO 4 （Solarbio，目录号：S5830）
MgSO 4 •7H 2 O（国药化学试剂，目录号：10013018）
脑心浸液（BHI）（BD，目录号：237500）
吐温80（Solarbio，目录号：T8360）
DL-苏氨酸（DL-Thr）（东京化学工业，目录号：T3105）
甘氨酸（Gly）（Solarbio，目录号：G8200）
葡萄糖（北京定国长生生物技术，目录号：DS063）
柠檬酸三钠（Solarbio，目录号：S8220）
山梨醇（Solarbio，目录号：S8090）
异烟酸酰肼（INH）（西格玛奥德里奇，目录号：I3377）
IPTG（Solarbio，目录号：I8070）
丙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P1880）
Oligo用于ssDNA重组：
AGGTAAGGCGCACACGAGCGACCTTACGAAGAGCAGAGTTAGGCTTGCGAGGGGTGGTGGTGTACACACGGGTGCATACGCCACGACGCT（在Genewiz，中国苏州合成和页面纯化）
用于gRNA质粒构建的引物（在Genewiz，Suzhou，China中合成和页面纯化）：
gRNA-1：AGAGCAGAGTTAGGCTTCTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
gRNA-2：TGCTCTTTCATTGATGGCTGG
gRNA-3：CAGCCATCAATGAAAGAGCAAC
gRNA-4：AAGAAGCCTAACTCTGCTCTTGAATTACACTGTACCTGTTGCGTC
50倍TAE电泳缓冲液（见食谱）
1x TAE电泳缓冲液（见食谱）
LB培养基（见食谱）
LB固体培养基（见食谱）
BHI培养基（见食谱）
NCM培养基（见食谱）
BHIS培养基（见食谱）
LBHIS固体培养基（见食谱）
25毫克/毫升卡那霉素原料（见食谱）
5毫克/毫升氯霉素原料（见食谱）
0.1 M IPTG库存（参见食谱）
500克/升丙酸钠原料（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf，目录号：022575442）
热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：Arktik TM 热循环仪）
水浴（北京永光医疗器械，型号：DZKW-S-4）
NanoDrop（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：NanoDrop TM 2000）
Milli-Q H 2 O分配器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：Barnstead TM GenPure TM 亲，目录号：50131950）
离心机（Eppendorf，型号：5084 R，目录号：5805000696）
电穿孔比色皿（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652082）
-20°C冰箱（Panasonic，目录号：MDF-U548D-C）
pH计（Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific TM accumet TM AB150，目录号：13-636-AB150）
DNA电泳仪（北京刘仪生物技术，目录号：DYY-6C和DYCP-32B）
Electroporator（Eppendorf，型号：Electroporator 2510）
高压灭菌器（三洋，目录号：MLS-3750）

软件

Primer Premier 5（Premier Biosoft International）
sgRNAcas9（Xie et al。，2014）

程序

设计变异策略并准备ssDNA编辑模板
1. 选择将引入突变的目标位置。上传目标区域的序列（目标位置上游和下游分别为23 mer，总共47 mer）和 C的基因组序列。谷氨酸到sgRNAcas9软件（Xie et al。，2014）来设计gRNA并评估潜在的脱靶位点。
2. 选择一个没有潜在脱靶位点的正确gRNA，并确保目标突变位置位于其种子区域（图1中的绿色字母）或PAM序列的“GG”区域（图1）。
  
  图1.原型间隔区，PAM位点和ssDNA的设计。 A.在前导链中引入带有原型间隔区和PAM序列（5'-NGG-3'，蓝色字母）的突变（红色字母） of C.谷氨酸基因组。 B.在 C的滞后链中用原型间隔区和PAM序列（5'-NGG-3'，蓝色字母）引入突变（红色字母）。谷氨酸基因组。目标突变位置应位于PAM序列的种子区域（绿色字母）或“GG”区域。 ssDNA（90 mer）编辑模板应与后随链互补。
3. 分别使用目标位置上游和下游的40-50mer设计90mer ssDNA。确保90 mer ssDNA与后随链互补（图1）。
  注意：先前的研究表明，与后随链互补的ssDNA导致更高的重组效率（Binder等，2013）。根据Kalinowski等人发表的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组序列。（2003），基因组的双向复制始于dnaA基因（cg0001）附近的所提出的oriC序列，并且在计算的复制末端附近以约1.6Mb结束。因此，对于位于0-1.6 Mb的基因，只需复制基因组序列以获得滞后链序列。对于位于1.6-3.3Mb的基因，基因组序列的反向互补序列是滞后链序列。
4. 合成PAGE纯化的ssDNA（每次转化使用10μg）。
构建质粒pgRNA-target
为了构建表达特定gRNA所需的质粒pgRNA-靶，用先前设计的靶间隔序列替换pgRNA5的原始20bp间隔序列（图2）。使用Vazyme ClonExpress ® II一步克隆试剂盒构建质粒（该克隆技术基于同源重组和PCR片段5'和3'末端15-20 bp的重叠序列）需要）。在引物中添加20bp间隔区序列并使用20bp间隔区序列作为重叠。详细程序如下：

图2.质粒pgRNA-target的构建
1. 设计构建质粒pgRNA靶标的引物。
  引物gRNA-1：20 bp间隔序列+ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
  引物gRNA-2：TGCTCTTTCATTGATGGCTGG（永久序列）
  引物gRNA-3：CAGCCATCAATGAAAGAGCAAC（永久序列）
  引物gRNA-4：20 bp间隔序列的反向互补+ TGAATTACACTGTACCTGTTGCGTC
2. 使用pgRNA5作为模板，通过PCR扩增片段A（3421bp）和片段B（2812bp），引物分别对gRNA-1 / gRNA-2和gRNA-3和gRNA-4进行扩增。
  1. 使用Q5 ®高保真DNA聚合酶的PCR程序：
  2. 通过1x TAE电泳缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，然后使用AxyPrep TM DNA凝胶提取试剂盒（Corning，Axygen ）进行凝胶提取。将纯化的PCR产物保存在-20°C直至使用。
    注意：GoldView I核染色染料（10,000x）用于DNA染色。根据制造商的说明，GoldView I应避光保存并在室温下储存。对于100 ml琼脂糖凝胶溶液，使用10μlGoldViewI Nuclear Staining Dyes（10,000x）。
3. 构建pgRNA-靶质粒
  1. 使用Vazyme ClonExpress ® II一步克隆试剂盒构建pgRNA-靶质粒。重组反应混合物（20μl）含有60-120ng片段A，60-120ng片段B，4μl5xCE II缓冲液，2μlExnaseII。将反应混合物在37℃下在热循环仪中孵育30分钟并立即将其置于冰上。
  2. 转化100μl化学感受态 E.具有10μl重组产物的大肠杆菌菌株DH5α（确保感受态细胞的转化效率> 10 7 cfu /μg）。将转化混合物在含有卡那霉素（25μg/ ml）的LB固体培养基上铺板。将板在37℃孵育过夜。
  3. 使用对20bp间隔区序列特异的上游引物和位于质粒骨架上的下游引物gRNA-5（AGTCTTTCGACTGAGCCTTTCG）通过PCR验证转化体。通过PCR产生的预期片段的大小约为150bp。
  4. 使用AxyPrep TM Plasmid Miniprep Kit培养正确的菌落并提取质粒。将纯化的pgRNA-靶质粒保存在-20℃直至使用。
CRISPR / Cas9介导的ssDNA重组在 C中。谷氨酸
CRISPR / Cas9介导的ssDNA重组工程的程序如图3所示。

图3. CRISPR / Cas9介导的ssDNA重组工程的程序
1. 转换 C.谷氨酰胺与pgRNA-靶质粒
  准备 C的感受态细胞。根据前面描述的方案（Ruan et al。，2015），谷氨酸和转化质粒。
  1. 激活 C.通过在LBHIS固体培养基上于30℃培养24小时来获得谷氨酸杆菌菌株。
  2. 从单个菌落接种20ml BHI培养基（在100ml摇瓶中）的预培养物，并在30℃下剧烈摇动（220rpm）孵育过夜。
  3. 将过夜培养物稀释至含有0.46％INH，0.11％吐温80,1.11％DL-Thr和3.59％Gly的NCM培养基（100ml）中的OD 600nm 0.3，并在30℃下孵育。剧烈摇动（220rpm）直至OD 600nm 值达到0.9-1.0（ ca。 5-6h）。
  4. 将培养物在冰上冷却15分钟，并通过在4℃，4,000 x g 离心10分钟收获细胞。
  5. 弃去上清液，将沉淀重悬于50ml冰冷的无菌10％甘油中。将重悬浮的细胞在4℃，4,000 x g 离心10分钟。重复此洗涤步骤四次。
  6. 丢弃尽可能多的上清液。立即将细胞沉淀重悬于0.4ml冰冷的无菌10％甘油中，并将重悬的细胞分成100μl等分试样。
  7. 向感受态细胞中加入0.5-1μgpgRNA-靶质粒（最多5μl），并将混合物转移到2mm电穿孔杯（Bio-Rad Laboratories）中。在2.5kV，5毫秒的电穿孔后，立即将1ml BHIS培养基加入到比色皿中，将混合物转移到1.5ml管中，并将管在46℃下孵育6分钟。然后在30℃下将管在剧烈摇动（220rpm）下孵育2小时。
  8. 将50-100μl混合物涂布在含有25μg/ ml卡那霉素的LBHIS固体培养基上。将板在30℃孵育24-36小时。转化体是 C.谷氨酸（pgRNA-target）菌株。
2. 转换 C.谷氨酰胺（pgRNA-target）与pCas9质粒和ssDNA
  1. 准备 C的感受态细胞。谷氨酸（pgRNA-target）。按照上述步骤，除了将1g / L丙酸钠加入NCM培养基中以诱导RecT重组酶表达。
  2. 转换 C.谷氨酸（pgRNA-靶）感受态细胞，含1-2μgpCas9和6-15μg合成ssDNA（总体积高达10μl）。在2.5kV电穿孔5毫秒后，立即将1ml BHIS培养基加入到比色皿中，将混合物转移到1.5ml管中，并在46℃下孵育管6分钟。然后在30℃下将管在剧烈摇动（220rpm）下孵育5-6小时。
  3. 通过在5,000 x g 下离心1分钟收集细胞。除去上清液，用100μlBHIS培养基重悬细胞。将所有细胞涂布在含有25μg/ ml卡那霉素，5μg/ ml氯霉素和0.01mM IPTG的LBHIS固体培养基上。将板在30°C孵育48-72小时，直到出现菌落。
3. 屏幕编辑突变体
  设计一个引物对，分别位于突变位点上游和下游约200 bp处（图4）。通过使用菌落PCR和上述引物对扩增靶片段。通过Sanger测序对PCR产物进行测序以验证是否引入了突变并且未引入其他意外突变。
  注意：根据我们的经验，编辑效率超过80％。因此，筛选5个菌落可以确保获得编辑过的突变体。
  对于菌落PCR，使用10μl移液管尖端挑取一个菌落，并将其与PCR反应混合物混合以引入DNA模板。
  菌落PCR程序使用2x EasyTaq PCR SuperMix（+染料）：
  
  图4.通过Sanger测序验证突变体
质粒固化
为了从编辑的细胞中去除pCas9和pgRNA-靶质粒，将编辑的菌落接种到100ml不含抗生素的BHI培养基中，并在30℃，220rpm下培养12小时。将100μl培养物转移到不含抗生素的100ml新鲜BHI培养基中，并在30℃，220rpm下培养12小时。再重复此步骤。稀释培养物并在不含抗生素的LBHIS固体培养基上涂布100μl。挑选10至20个分离物并接种含有和不含25μg/ ml卡那霉素（或5μg/ ml氯霉素）的LBHIS固体培养基。在30℃下培养板过夜。在不含有25μg/ ml卡那霉素的LBHIS固体培养基和含有5μg/ ml氯霉素的LBHIS固体培养基上生长的分离株已经被编辑质粒治愈。
注意：根据我们的经验，质粒固化菌株的效率约为25％。

数据分析

为了验证基因组编辑事件，通过菌落PCR扩增靶区域，随后对PCR产物进行测序。将参考序列（野生型）与测序结果对齐以分析是否通过CRISPR / Cas9介导的ssDNA重组工程引入了靶突变。编辑效率=正确突变体的数量/否。测试的殖民地。
注意：在CRISPR / Cas9介导的ssDNA重组工程后，平板上可能会出现一些异常大的菌落（图5）。根据我们的经验，这些异常大的菌落很可能是假阳性，在编辑过程中会失去cas9表达质粒。

图5.通过CRISPR / Cas9介导的ssDNA重组工程获得的转化体。以红色周期标记的菌落是所谓的异常大菌落。

为了测定编辑质粒pCas9和pgRNA-target的缺失，从不含抗生素的LBHIS固体培养基中挑取10至20个分离物，并接种含有和不含25μg/ ml卡那霉素（或5μg/ ml氯霉素）的LBHIS固体培养基。对编码质粒已经治愈了对卡那霉素和氯霉素敏感的分离物。质粒固化的效率=没有质粒的菌落数/ No。测试的菌落数。

食谱

50倍TAE电泳缓冲液
242克Tris base
57.1毫升冰醋酸
100毫升EDTA，pH 8.0
添加Milli-Q H 2 O至总体积为1L
在室温下储存
1x TAE电泳缓冲液
20毫升50倍TAE
980ml Milli-Q H 2 O
在室温下储存
LB媒体
10克NaCl
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
添加Milli-Q H 2 O至总体积为1L
高压灭菌消毒
LB固体培养基
1 L LB介质
18克琼脂
高压灭菌消毒
冷却至约60°C。如果需要抗生素，则此时加入抗生素
BHI媒体
37克脑心浸液（BHI）
10 g（NH 4 ） 2 SO 4
0.2克K 2 HPO 4
0.3g NaH 2 PO 4
0.5g MgSO 4 ·7H 2 O
将pH调节至7.2
将H 2 O添加到总体积为1 L
高压灭菌消毒
NCM媒体
含有0.46％INH，0.11％吐温80,1.11％DL-Thr和3.59％Gly
1. NCM媒体
  17.4g K 2 HPO 4
  11.6克NaCl
  5克葡萄糖
  5克胰蛋白胨
  1克酵母提取物
  0.3克柠檬酸三钠
  0.05g MgSO 4 7H 2 O
  91.1克山梨醇
  将pH调节至7.2
  将H 2 O添加到总体积为1 L
  高压灭菌消毒
2. 使用灭菌的NCM培养基制备INH，DL-Thr和Gly溶液
  23克异烟酸酰肼（INH）
  5.5克Tween 80
  55.5g DL-苏氨酸（DL-Thr）
  179.5克甘氨酸（Gly）
  添加灭菌的NCM培养基至总体积0.2L
  过滤灭菌
3. 将0.8L NCM培养基与0.2L INH，DL-Thr和Gly溶液混合
BHIS媒体
18.5克BHI
91克山梨醇
将pH调节至7.2
将H 2 O添加到总体积为1 L
高压灭菌消毒
LBHIS固体培养基
5克胰蛋白胨
5克NaCl
2.5克酵母提取物
18.5克BHI
91克山梨醇
18克琼脂
将pH调节至7.2
将H 2 O添加到总体积为1 L
高压灭菌消毒
冷却至约60°C。如果需要抗生素，则此时加入抗生素
25毫克/毫升卡那霉素原料
250毫克卡那霉素
将Milli-Q水加入10毫升
过滤灭菌
储存在-20°C
5毫克/毫升氯霉素原料
50毫克氯霉素
加入10毫升乙醇
过滤灭菌
储存在-20°C
0.1 M IPTG股票
23.8 mg IPTG
将Milli-Q水加入10毫升
过滤灭菌
储存在-20°C
500克/升丙酸钠原料
5克丙酸钠
将Milli-Q水加入10毫升
过滤灭菌
储存在-20°C

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金（31700044），中国科学院重点研究计划（ZDRW-ZS-2016-2）的支持，以及第一个人才开发和高层次创新特别支持计划。和天津市的创业团队。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

参考

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