材料和试剂

Glass Tupperware（图1B）
尺寸可根据每个实验的要求而变化。您必须避免使用太重且难以操作的大型容器。＆nbsp;
Schmidtea mediterranea 该物种可以在西地中海的沿海地区找到。大多数实验室使用的菌株的起源是巴塞罗那Montjuic的喷泉。现在最简单的来源是直接从我们的实验室或任何已经建立它作为模型生物的人那里询问。＆nbsp;
有机牛肝
注意：可以在任何出售有机肉的肉店购买。
NaOH（默克，目录号：106462）
MgSO 4 •7H 2 O（默克，目录号：105886）
NaHCO 3 （默克，目录号：106329）
KCl（默克，目录号：104936）
MgCl 2 •6H 2 O（默克，目录号：105833）
CaCl 2 •2H 2 O（默克，目录号：102382）
MilliQ水
100x Planarians人工培养基（PAM）储备液（见食谱）
100x CaCl 2 储备溶液（见食谱）

设备

“Planarium” - 室温或20°C的培养箱（图1C）
1升烧杯
电磁搅拌器
搅拌棒
1 L量筒
1升水晶瓶
水箱

图1.培养 Schmidtea mediterranea 。 A. 体内来自物种 Schmidtea mediterranea 。 B.带有涡虫的玻璃特百惠。 C.“Planarium”（20°C的房间）。

程序

准备100x Planarians人工培养基（PAM）储备液（见食谱1）。
注意：100x PAM水和100x CaCl的分离库存 2 •2H 2 应准备好溶液以避免盐析。不建议制备更高浓度的原料，因为盐可能会沉淀。稀释适量的两种溶液，并在使用前混合（参见食谱）。不要将稀释后的原料储存在水箱中超过1周。
准备100x CaCl 2 储备液（参见配方2）。
需要时，使用水箱将原料稀释至Millipore水中1倍。对于10L 1x PAM水，使用100ml每种原料。
将一种来自 Schmidtea mediterranea 的克隆系菌株的涡虫放入玻璃特百惠中，并用1x PAM水填充至Tupperware容量的3/4（图1B）。将涡虫放在“Planarium”中：一个分开的房间或孵化器，温度可控（约20°C）并保持在黑暗中。
注意：为了增加种群，可以在咽后水平切割涡虫，这是在自然无性繁殖期间裂变的区域。片段将在两周内完全再生缺失的部分。如果涡虫大（> 0.5厘米）并且需要大量增加，可以预先进行额外的切割。
为了促进涡虫的生长和繁殖，每周喂食有机牛肝2至3次。为此，在5-7小时内将小块肝脏浸入水中（一块4厘米 2 切成较小的碎片可以在150厘米 2 中加入特百惠）。在此之后，取出肝脏并用PAM水改变。当在特百惠墙壁上观察到粘液时，用一张纸清洁它而不接触涡虫并添加新的1x PAM水。
注意：
1. 为了长期储存，应将牛肝切成小块（约3-5厘米），用铝箔包裹并冷冻。当用它来喂食涡虫时，取出金属箔并用手术刀将其切成小块。
2. 请注意在特百惠盖板上切开一些开口，以便进行气体交换。
3. 通常只有喂食后才能更换PAM水。然而，当在特百惠墙壁上清楚地观察到粘液时，即使没有喂食，也应改变涡虫水。你必须意识到要避免感染。
为了增加涡虫种群，可以在咽后水平切割涡虫，这是在自然无性繁殖期间裂变的区域。片段将在两周内完全再生缺失的部分。如果涡虫大（> 0.5cm）并且需要人口的高增加，则可以预先进行额外的切割。涡虫的密度可以根据每个研究人员的具体要求而变化。图1B中显示的培养物对应于低密度培养物。它可以增加2-3倍。

数据分析

为了进行实验，应选择相同大小的涡虫，以避免由于大小差异导致的结果差异。出于同样的原因，只应使用完全再生的涡虫（见图2）。

图2. Schmidtea mediterranea的尾部再生。 A.刚刚切断尾巴的Planarian。 B.在切割后6-8天，使尾部部分再生的Planari（参见用黄色箭头指向的白色blastema）。 C.完全再生的涡虫，切割后10-13天。

食谱

100x Planarians人工中（PAM）原液解决方案
1.6 mM NaCl
1.0mM MgSO 4 ·7H 2 O
1.2 mM NaHCO 3
0.1 mM KCl
0.1mM MgCl 2 •6H 2 O
1. 将约750ml MilliQ水加入烧杯中
2. 用搅拌棒将烧杯放入磁力搅拌器中
3. 将盐逐一加入MilliQ水中，达到适当的浓度。在添加下一个盐之前，确认前一个盐已完全溶解
4. 将溶液转移至1 L量筒并将体积调节至1 L.
5. 将此库存储存在“Planarium”的1升玻璃瓶中
100x CaCl 2 库存溶液
1.0 mM CaCl 2 •2H 2 O
1. 将约750ml MilliQ水加入烧杯中
2. 用搅拌棒将烧杯放入磁力搅拌器中
3. 将盐加入MilliQ水中以达到适当的浓度
4. 将溶液转移至1 L量筒并将体积调节至1 L.
5. 将此库存储存在“Planarium”中的1升玻璃瓶中＆nbsp;
注意：如果储备溶液沉淀，在磁力搅拌器中搅拌一会儿，然后过滤溶液。
PAM水
0.016 mM NaCl
0.01mM MgSO 4 ·7H 2 O
0.012 mM NaHCO 3
0.001 mM KCl
0.001 mM MgCl 2 •6H 2 O
0.01 mM CaCl 2 •2H 2 O
注意：PAM水必须从两种不同的100x储备溶液中制备（参见配方1和2），因为CaCl 2 必须只在需要时添加，以避免降水。

致谢

我们对图2中的图像感谢Eudald Pascual。这项工作得到了补助金BFU2008-01544和BFU2014-56055-P（MinisteriodeEducaciónyCiencia）和2009SGR1018（AGAUR）的资助。 N.S。得到了巴塞罗那大学APIF奖学金的支持。这项工作改编自以前的文献（Cebrià和Newmark，2005）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Baguñá，J。和Romero，R。（1981）。对涡虫中的生长，去除和再生过程中细胞类型的定量分析 Dugesia mediterranea 和 Dugesia tigrina 。 Hydrobiologia 84（1）：181-194。
Cebrià，F。和Newmark，P。A.（2005）。 netrin 和 netrin receptor 的Planarian同系物是正确再生中枢神经系统和维持神经系统结构所必需的。发展 132（16）：3691-3703。
Reddien，P.W。和Alvarado，A。S.（2004）。涡虫再生的基础知识。 Annu Rev Cell Dev Biol 20：725-757。
Salo，E。（2006）。再生和干细胞王国的力量：淡水涡虫（Platyhelminthes）。 Bioessays 28（5）：546-559。