材料和试剂

1毫升微量吸管尖端
微量离心管
带Ultracel-10膜的Amicon Ultra-0.5离心过滤装置（默克，产品目录号：UFC501024）
质粒pGEX_GST-Tau0N4R-8xHis（Addgene，目录编号：XXX）
Rosetta T M ＆nbsp;细菌细胞（默克，目录号：70953）
LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3522）
氨苄西林（Sigma-Aldrich，目录号：A9393）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
抗His抗体（如Thermo Fisher Scientific，目录号：37-2900）或抗Tau抗体（如Agilent Technologies，DAKO，目录号：A0024）
异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）
注意：在无菌H 2 O中制备100 mM原液，并在-20°C下冷冻等分试样。解冻后不要再冻结。
Glutathione Sepharose 4B（GE Healthcare，目录号：17075601）
完整的蛋白酶抑制剂片剂，不含EDTA（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
Phenylmethanesulfonyl fluoride（PMSF），100 mM溶液（Sigma-Aldrich，目录号：93482）
Benzonase核酸酶，250单位/μl（西格玛奥德里奇，目录号：E1014）
PreScission Protease，2,000单位/ ml（GE Healthcare，目录号：27084301）
注意：收到原种后，在冰上解冻并准备约10μl等分试样并在-20°C下冷冻。解冻后不要重新冷冻等分试样。
Ni-NTA Profinity TM IMAC树脂，Ni-charged（Bio-Rad Laboratories，目录号：1560131）
快速入门 TM Bradford蛋白质分析（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000201）
PageBlue TM 蛋白质染色液（Thermo Fisher Scientific，目录号：24620）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）
无水磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：795410）
DL-二硫苏糖醇（DTT），在H 2 O中的1M储备溶液（Sigma-Aldrich，目录号：646563）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
Tween-20（西格玛奥德里奇，目录号：P1379）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：792527）
细菌裂解缓冲液（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
PBS + 250 mM NaCl（参见食谱）
PreScission蛋白酶切割缓冲液（见食谱）
Ni-NTA洗涤缓冲液（见食谱）
Ni-NTA洗脱缓冲液（见食谱）

设备

移液器
台式微量离心机，速度可达16,000 x g
微孔板读数器或分光光度计能够在600 nm处进行细菌密度测量的吸光度读数，在595 nm处用于Bradford蛋白质测定的吸光度读数

程序

注意：

以下步骤用于从50ml培养体积的细菌中纯化Tau蛋白，其产生约4μg纯蛋白质。如果需要更多的蛋白质，这个协议可以很容易地扩大规模。
为了保证Tau的溶解性，必须将蛋白质新鲜纯化，并在完成纯化后立即用于实验。冷冻纯化的Tau蛋白会使聚集成核并导致溶解度和功能的丧失。
在4°C和/或冰上进行所有纯化步骤，并在冰上预冷所有管。

细菌细胞诱导和收获
1. 用pGEX_GST-Tau0N4R-8xHis质粒（氨苄青霉素抗性）转化合适的细菌菌株用于蛋白质生产。我们建议使用携带氯霉素抗性tRNA质粒的Rosetta细菌来增强哺乳动物蛋白的表达。
2. 初级培养：下午，接种含有适当抗生素的5 ml LB培养基（100μg/ ml氨苄青霉素用于pGEX_GST-Tau0N4R-8xHis质粒;另外，25μg/ ml氯霉素，如果使用Rosetta细胞，强烈推荐），单个细菌菌落（或从甘油原液中10μl）并在37℃下以220-250rpm振荡生长过夜。
3. 主培养：第二天早上，将饱和的5ml过夜培养液（OD 600 ~2.0）稀释到45ml含有适当抗生素的新鲜LB培养基中（1:10稀释，OD 600 ~0.2），并在37℃下以220-250rpm振荡孵育1小时，以使细菌恢复到指数生长期。
4. 1小时后，加入IPTG至终浓度为0.4 mM，让细菌在37°C生长2小时。
  可选：通过测量OD 600 处培养物的密度，确认细菌已重新进入指数生长期。诱导前，细菌应从OD 600 ~0.2恢复到至少OD 600 ~0.4。
5. 诱导后2小时，通过在4℃下以5,000×g×g离心15分钟沉淀细菌。将细菌细胞沉淀在-80°C冷冻直至使用。
  注意：细菌细胞颗粒在-80°C下至少可稳定保存3个月。我们常规制备0.5-2L批次的细菌，以等分试样冷冻50ml细胞培养体积颗粒，并在实验日取单个等分试样进行纯化。
细菌细胞裂解
1. 从50ml培养物中取出一个细菌细胞沉淀并在冰上融化。通过用1ml微量移液管尖端上下移液，将沉淀物彻底重悬于1.5ml冰冷的细菌裂解缓冲液中，所述微量移液管尖端已被切割以使其宽孔并将裂解物转移至冰上的微量离心管中。
  注意：确保新鲜制备裂解缓冲液（参见食谱）。
2. 将裂解物在4°C下在旋转轮上孵育30分钟以允许完全裂解。
3. 在4℃下以16,000 x g 离心裂解物20分钟以沉淀不溶性物质和碎片，并将上清液（澄清的裂解物）转移到冰上的新微量离心管中。当裂解物变成浅棕色时，完全裂解将是明显的。
针对N端GST标签的纯化
1. 谷胱甘肽琼脂糖凝胶的制备：使用切割的移液管尖端，将75μl谷胱甘肽Sepharose 4B浆液转移到微量离心管中，加入1ml冰冷的PBS进行洗涤。
  注意：确保谷胱甘肽琼脂糖浆液在使用前轻轻摇动30秒彻底混合。
2. 通过在3,500 x g 离心3分钟沉淀琼脂糖凝胶。＆nbsp;
3. 丢弃上清液。用1ml冰冷的PBS再次洗净琼脂糖凝胶，离心并弃去上清液。
4. 将澄清的细菌裂解物的总体积（来自50ml细菌培养物的约1.5ml裂解物）转移到含有洗涤的谷胱甘肽琼脂糖珠的管中。
5. 将裂解物与谷胱甘肽琼脂糖凝胶在4℃下孵育2小时，旋转以使GST标签结合谷胱甘肽。
6. 结合后，沉淀琼脂糖凝胶（3,500 x g 在4℃下3分钟）并用1ml PBS + 250mM NaCl洗涤。再次沉淀并弃去上清液。重复洗涤2次。
N末端GST标签的切割
1. 在使用前立即加入新鲜的DTT至终浓度为1mM，制备PreScission蛋白酶切割缓冲液。
2. 通过用含有DTT的1ml PreScission蛋白酶裂解缓冲液洗涤两次（GST-Tau-8xHis结合的琼脂糖凝胶）平衡珠子（与步骤C中相同的洗涤程序）。
3. 在第二次洗涤后，弃去上清液并将珠浆液重悬于240μl含有DTT的PreScission蛋白酶裂解缓冲液中。＆nbsp;
4. 将悬浮液转移到较小的管（例如，0.5ml管）中并加入10μl（20U）PreScission蛋白酶。
5. 将裂解混合物在4℃下旋转孵育过夜。确保管具有适当的体积，以使反应充分混合。
  注意：GE Healthcare推荐的最短切割时间为4小时4小时，但我们建议过夜孵育。
针对C末端His标签的纯化
1. 第二天早上，通过在4,500℃下在3℃下离心5分钟来沉淀琼脂糖凝胶浆液。将上清液转移到新的微量离心管中并丢弃琼脂糖凝胶珠浆液。该上清液含有裂解的Tau-His以及残留的PreScission蛋白酶。＆nbsp;
2. 制备新鲜的谷胱甘肽琼脂糖凝胶浆液（50μl），在含有DTT的裂解缓冲液中洗涤两次，然后将来自步骤E1的上清液在4℃下在4℃下搅拌混合使用新鲜谷胱甘肽琼脂糖凝胶1小时。
  注意：此步骤将去除残留的GST标记的PreScission蛋白酶以及混合物中任何残留的未切割的GST-Tau-His蛋白。＆nbsp;
3. 1小时后，通过在4℃下在3,500×g离心5分钟沉淀琼脂糖凝胶，并将含有游离Tau-His蛋白的上清液转移到冰上的新微量离心管中。
4. 通过将25μlNi-NTA浆液移液到微量离心管中制备Ni-NTA树脂，并在冰冷的PreScission蛋白酶裂解缓冲液中洗涤两次以平衡树脂。
5. 将含有Tau-His蛋白的上清液应用于Ni-NTA树脂，并在4℃下混合45分钟。
6. 45分钟后，在4℃下在3,500×gg /小时下沉淀Ni-NTA浆液3分钟并弃去上清液。用冰冷的1ml Ni-NTA洗涤缓冲液洗涤珠子三次。
7. 通过在冰冷的500μlNi-NTA洗脱缓冲液中重悬浮洗涤的珠子并在4℃下旋转孵育10分钟来洗脱结合的Tau-His蛋白质。
8. 通过在4℃下以10,000 x g 离心2分钟来沉淀Ni-NTA珠粒。收集上清液，注意不要转移任何沉淀的Ni-NTA珠子，并转移到冰上的新微量离心管中。
9. 通过将洗脱液应用于Amicon Ultra-0.5 ml离心过滤装置（30 kDa分子量截止值）并在14,000 xg 离心约8，将500μl蛋白质洗脱液浓缩至约100μl的体积。最低温度为4°C或更长时间，直至体积达到100μl。通过将过滤器单元倒置到干净的收集管中并在4℃下以1,000 x g 离心2分钟来回收溶液。
10. 使用Bradford蛋白质测定法或其他适当的蛋白质定量方法测量蛋白质浓度。通过SDS-PAGE确认蛋白纯度，并用PageBlue胶体考马斯试剂染色。
  注意：预计蛋白质浓度约为20-60μg/ ml，这需要将最多10μl蛋白质样品加入200μlBradford反应中进行检测。

数据分析

为了评估最终产品的纯度，在SDS-PAGE凝胶上运行1μg蛋白质并用胶体考马斯染色。我们常规使用该方案观察到超过90％的蛋白质纯度（图2）。
纯化的蛋白质产物的特性可以通过使用抗His抗体或抗-Tau抗体的免疫印迹来确认。对于检测使用该方案纯化的全长和截短的Tau蛋白的免疫印迹的实例，参见Zhou 等人（2017）和McInnes 等人（2018）。
纯化的Tau蛋白的聚集状态可以通过在4℃下以100,000×gg 超速离心样品1小时来评估，然后通过SDS-PAGE分析沉淀中Tau聚集体的存在。使用该方案分析新鲜纯化的蛋白质，我们在不溶性部分中观察到最小的Tau蛋白质。相反，冷冻和解冻纯化的蛋白质在100,000 x g 离心后导致沉淀中的大量Tau蛋白，表明聚集。

图2. Tau-His蛋白的纯度。将1微克纯化的蛋白质与含有1％β-巯基乙醇的1x NuPAGE LDS样品缓冲液（Invitrogen TM ）混合，加热至70℃。 ℃保持10分钟，并在具有MOPS运行缓冲液的NuPAGE 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶（Invitrogen TM ）上分离。凝胶用PageBlue胶体考马斯溶液染色。

食谱

细菌裂解缓冲液
1x PBS（来自10x原液）
1％Triton X-100（来自10％原液）
10％甘油（来自50％原液）
1毫克/毫升溶菌酶（从粉末中溶解新鲜）
1x完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒，不含EDTA（罗氏诊断）
1mM PMSF（来自100mM储备溶液）
250 U / ml Benzonase（酶原1：1,000）
注意：使用前立即加入完全蛋白酶抑制剂混合物，PMSF，溶菌酶和Benzonase。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
10mM Na 2 HPO 4
2.7 mM KCl
137 mM NaCl
将pH调节至7.4
PBS + 250 mM NaCl
将5 M NaCl的稀释液稀释到PBS中，使最终浓度为250 mM NaCl
PreScission蛋白酶切割缓冲液
20 mM Tris-HCl
50 mM NaCl
0.5 mM EDTA
0.01％吐温-20
1 mM DTT
用NaOH调节pH至7.0
注意：
1. 缓冲液（不含DTT）可在4°C下保存长达1个月。
2. 在使用前，立即取一份缓冲液并补充DTT。
Ni-NTA洗涤缓冲液
50mM NaH 2 PO 4
300 mM NaCl
20 mM咪唑
pH 8.0
储存在4°C
Ni-NTA洗脱缓冲液
50mM NaH 2 PO 4
300 mM NaCl
250 mM咪唑
pH 8.0
储存在4°C

致谢

这项工作得到了欧洲研究委员会合并补助金（646671），Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen（FWO）的支持，以及VIB-KU鲁汶脑与疾病研究中心和Johnson＆amp; Janssen Pharmaceutical Companies之间的学术 - 工业合作。 ;约翰逊。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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Iqbal，K.，Liu，F。和Gong，C。X.（2016）。 Tau和神经退行性疾病：迄今为止的故事。 Nat Rev Neurol 12（1）：15-27。
Koss，D.J.，Jones，G.，Cranston，A.，Gardner，H.，Kanaan，N.M。和Platt，B。（2016）。可溶性前纤维状tau蛋白和β-淀粉样蛋白物种在早期人类阿尔茨海默病中出现，并追踪疾病进展和认知能力下降。 Acta Neuropathol 132（6）：875-895。
McInnes，J.，Wierda，K.，Snellinx，A.，Bounti，L.，Wang，YC，Stancu，IC，Apostolo，N.，Gevaert，K.，Dewachter，I.，Spiers-Jones，TL，De Strooper，B.，De Wit，J.，Zhou，L。和Verstreken，P。（2018）。 Synaptogyrin-3介导由Tau诱导的突触前功能障碍。 Neuron 97（4）：823-835 e8。
Polydoro，M.，Dzhala，VI，Pooler，AM，Nicholls，SB，McKinney，AP，Sanchez，L.，Pitstick，R.，Carlson，GA，Staley，KJ，Spires-Jones，TL and Hyman，BT（2014 ）。内嗅皮质中可溶性病理性tau导致早期阿尔茨海默病模型中的突触前缺陷。 Acta Neuropathol 127（2）：257-270。
Wang，Y。和Mandelkow，E。（2016）。 Tau in physiology and pathology。 Nat Rev Neurosci 17 （1）：5-21。
Zhou，L.，McInnes，J.，Wierda，K.，Holt，M.，Herrmann，AG，Jackson，RJ，Wang，YC，Swerts，J.，Beyens，J.，Miskiewicz，K.，Vilain，S 。，Dewachter，I.，Moechars，D.，De Strooper，B.，Spiers-Jones，TL，De Wit，J。和Verstreken，P。（2017）。 Tau与突触小泡的关联导致突触前功能障碍。 Nat Commun 8：15295。