材料和试剂

注射器：BD 1 ml注射器，针头长度为27 G x 1/2（BD，目录号：309623）
毛细管（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：22-362566）
口服灌胃针（可重复使用的小动物喂养针）（Cadence Science，目录号：7905）
Eppendorf管（Eppendorf ® Safe-Lock微量离心管）（Eppendorf，目录号：022363611）
非无菌棉纱布海绵（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：22-362178）
收集心脏穿刺血液的管（SARSTEDT，目录号：2022-07-31）
Oatp1b2 KO和野生型DBA小鼠（8至12周龄，详见程序）＆nbsp;
Nilotinib（Chemietek，目录号：CT-NL001）
紫杉醇（LC Laboratories，目录号：P-9600）
盐水（Hospira，NDC：0409-4888-02）
羟丙基甲基纤维素（HPMC）（Sigma-Aldrich，目录号：09963-25G）
Cremophor EL（Sigma-Aldrich，目录号：238470-1SET）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
吸管用于毛细管的橡胶管（Globe Scientific，目录号：51674）
异氟醚（Henry Schein，NDC 11695-7667-1）
0.5％（m / v）HPMC（见食谱）

设备

柳叶刀，Goldenrod 4或5毫米（MEDIpoint，目录号：Goldenrod ANIMAL LANCET 4MM）
移液器，200μl和20μl单通道移液器4（Mettler-Toledo，ShopRAININ，型号：Pipet-Lite XLS +，目录号：17014391和17014392）
红灯（UL E187949F，250V，660W）
Scout Pro Balance（OHAUS，型号：SP202）
尾静脉注射平台（低尾注射平台）（AIMS，目录号：IL300）
离心机（Eppendorf，Mini spin plus，型号：5453）
Sonicator（QSONICA，型号：Q55）
Vaporstick麻醉机（Smiths Medical，Surgivet，型号：V7015）
经典T3Vaporizer（Smiths Medical，Surgivet，型号：VCT302）
数字涡旋混合器（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：02-215-370）

软件

WinNonlin 6.2软件（Pharsight，Leblanc et al。>，2018）
Graph Pad棱镜6.0

程序

小鼠
在Oatp1b2KO和野生型DBA小鼠上进行用尼罗替尼或载体预处理的单剂量紫杉醇（PTX）的血浆药代动力学研究。这些小鼠由Richard B.Kim（西部大学，伦敦，安大略省，加拿大）和Jeffrey L.Stock（辉瑞公司，格罗顿，康涅狄格州，美国）提供。将8至12周龄的小鼠饲养在温度受控的环境中，具有12小时光照/黑暗循环。根据俄亥俄州立大学的机构动物护理和使用委员会，所有小鼠均接受标准饮食和随意饮水，并且所有研究均根据国家动物保护法进行。
准备工作
取决于PK研究中涉及的小鼠数量和PK时间点，可以在PK研究的前一天或在PK研究的同一天进行工作的准备。我们将每只笼子中的两只小鼠分开，以确保在研究期间每个团队参与者都能轻松获得并顺利完成交易。我们对小鼠进行称重，对尾巴上的小鼠进行编号，根据体重计算药物体积。标记两组0.5 ml样品采集管，分别用于血液和血清样品。小鼠信息，药物注射量，药物注射和收集时间点总结在表1中。在PK研究当天，团队成员根据指示执行其分配的任务。视频1和5显示了血液采集和处理平台的布局。

表1.紫杉醇PK研究剂量和取样信息表

视频1.采血平台
药物制剂
在室温下PK实验当天制备药物。将尼罗替尼溶于0.5％（w / v）HPMC（羟丙基甲基纤维素）中，超声处理以在给药1小时内以10mg / ml的速率制备悬浮液。将紫杉醇以6mg / ml配制在Cremophor EL /乙醇（1：1）中并在生理盐水中稀释，在注射前涡旋以制备2mg / ml工作溶液。
药品管理局
紫杉醇通过静脉内静脉推注给予尾静脉，剂量为10 mg / kg，100 mg / kg尼罗替尼或等效体积的载体对照（0.5％HPMC），通过口服强饲法给予30在紫杉醇之前的最小值（表1）。
1. 通过口服强饲法给予尼罗替尼。＆nbsp;
2. 在预定的i.v.前几分钟暴露鼠标。注入红灯。
3. 将鼠标放入尾静脉注射平台。
4. 在尾静脉注射药物静脉内>推注。
注意：药物在特定时间点的精确剂量是至关重要的。 >
血液采集
如图1所示，我们在选定的时间点从个体小鼠采集血样（每个30μl）：使用刺血针从下颌下静脉5,10和15分钟。在30和60分钟时间点，我们使用异氟烷麻醉小鼠，使用肝素化毛细管从眶后静脉丛收集血液。在120分钟时，使用注射器和针头通过心脏穿刺收集血液。

图1.药物管理和采血的时间方案
1. 血液采集由脸颊流血（视频2）
  1. 用一只手适当地约束老鼠，这将对上颌静脉施加足够的压力。
    注意：此步骤对于脸颊出血程序的成功至关重要，避免在耳朵周围保持太紧，否则会导致耳朵或鼻子意外出血，最终导致动物死亡。>
  2. 可视化地标。 FVB小鼠在上颌静脉区域有一个方便的标志，如图2所示。通常被视为小秃斑或毛发（雀斑），你可以沿着下颌骨的曲率找到它;经过颚骨的沟槽中的静脉正好在这个标记之上。较暗的老鼠有相同的位置，但可能更难看。
    注意：您也可以将刺血针尾部对准下颌角，延伸到耳朵。穿刺部位位于刺血针的中间位置。
    >
    
    图2.小鼠脸颊出血的可视化地标
  3. 使用刺血针的尖端，在眼睛的尾部和腹部下方的颌下静脉处施加压力，然后释放直至血液流动。
    注意：避免颚骨，穿刺会引起眶后静脉和下颌下静脉加入颈静脉的出血。如果由于技术不当而导致耳道穿孔，请用纱布施加压力，直至出血停止。>
  4. 用肝素化毛细管收集血液（每只小鼠30μl和时间点）并用移液管橡胶球转移到预先标记的0.5ml微量离心管中。
    注意：取决于您从一只小鼠采集血液的时间点，每个时间点的体积可能会有所不同，但是，IACUC指南必须允许采集的血液总量。>
  5. 用纱布轻轻按压以止血。流血将在几秒钟内停止。
  6. 释放将自我修饰的鼠标。
  7. 在下一个时间点旋转脸颊出血的一侧。例如，我们在右脸颊上进行了5分钟的时间点出血，在左脸颊上进行了10分钟，在右脸颊上进行了15分钟。
    注意：如果由于束缚或失血而发现窘迫症状，释放束缚，轻轻刺激鼠标直至其恢复。>
  视频2.脸颊出血（该视频是根据俄亥俄州立大学俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会的指导原则在俄亥俄州立大学制作的，并由俄亥俄州立大学动物研究伦理委员会根据协议批准＃2015A10000101。）
2. 眶后静脉丛采血（视频3）
  1. 用氧气中携带的3％异氟烷麻醉小鼠。＆nbsp;
  2. 在手术前检查有害刺激后没有角膜眨眼和运动。
  3. 将鼠标放在侧卧位置，用拇指和食指揉搓。
  4. 将收集毛细管插入眼睛下方的眼角下，与鼻子呈30度角。＆nbsp;
  5. 用轻微的压力稍微旋转毛细管以刺穿窦组织，血液将在毛细管中流动。
  6. 取出毛细管，在眼睛上涂抹干净的垫子可以止血。
  7. 手术后30分钟检查眼睛。
  8. 在右眼上进行血液采集30分钟时间点，然后在左眼上旋转60分钟时间点。
    注意：眼眶后出血相对安全且易于在PK研究中进行，但是，在几次连续的面颊出血后，小鼠可能会处于压力之下，特别是在短时间内。在这种情况下，有时很难从眼眶后出血中获取血液。我们发现腹腔注射1-2毫升生理盐水会有所帮助。 >
  视频3.复眼眶出血（该视频是根据俄亥俄州立大学俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会的指导原则在俄亥俄州立大学制作的，并由俄亥俄州立大学动物研究伦理委员会批准。协议＃2015A10000101。）
3. 通过心脏穿刺收集血液（视频4）
  1. 心脏穿刺作为终止程序进行。＆nbsp;
  2. 在CO 2 室中安乐死小鼠。
    注意：取决于IACUC批准，可以在小鼠麻醉期间进行心脏穿刺。>
  3. 在没有生命体征后，立即进行心脏后穿刺手术。
    注意：如果在对小鼠实施安乐死后等待太久，那么从心脏穿刺中获取血液是非常困难的。>
  4. 将鼠标放在背侧卧位，用70％乙醇喷雾。＆nbsp;
  5. 将针穿过剑突下的胸壁，并刺穿隔膜。保持针平行于脊柱，并将其插入肋骨下方。
  6. 当心脏在肘部水平被刺破时，在注射器上施加背压。如果针在心脏中，注射器将充满血液。如果没有，请重新定位针头并再次尝试对针头施加压力。
  7. 一旦注射器充满血液，就要增加更多的背压。
    注意：我们通常尽可能多地获取血液，以确保足够的体积用于药物的分析测量。通常，与所有早期时间点相比，药物浓度是最低的;如果您还有兴趣收集组织进行进一步检查，那么从血液循环中去除血液以尽量减少组织中的血液污染也是一种很好的做法。>
  8. 将血液转移到含有肝素的1.3 ml微量管中，轻轻倒置2-3次，让肝素释放到血液中。
  视频4.心脏穿刺（该视频是根据俄亥俄州立大学俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会的指导在俄亥俄州立大学制作的，并由俄亥俄州立大学动物研究伦理委员会根据协议批准＃2015A10000101）。
血液样本过程（视频5）
1. 以1,500 x g >离心血样5分钟。＆nbsp;
2. 小心地将半透明的淡黄色上清液（血浆）转移到预先标记的相应时间点管中，而没有任何携带的血细胞。
3. 将血浆样品保存在-80°C直至分析。＆nbsp;
视频5.血液处理平台
药物水平的测定
紫杉醇通过基于反相液相色谱与串联质谱检测相结合的验证方法（LC / MS / MS，Leblanc 等，<2018）进行定量。

数据分析

使用WinNonlin 6.2软件（Pharsight，Leblanc 等人，2018）计算非房室药代动力学参数（C max，T max，AUC，清除率，半衰期）。根据最小二乘法拟合的对数血浆浓度 - 时间曲线的末期斜率和终末半衰期（T 1/2 ）估算消除速率常数（Kel）。）计算为0.693 / Kel。通过目测检查来自浓度 - 时间曲线的数据，获得峰值血浆浓度（Cmax）和达到峰值血浆浓度的时间（Tmax）。血浆浓度 - 时间曲线下面积（AUC）根据线性梯形法则计算，直到最后一个时间点，可测量的目标分析物浓度。使用未配对的2侧Student's t > - 测试与Welch校正来评估与相应的媒介物对照组或基线小鼠的显着差异（ P > <0.05）。典型的血浆浓度 - 时间曲线如图3所示，紫杉醇（PTX）的药代动力学参数如表2所示：紫杉醇血浆曲线下面积仅在Oatp1b2 KO小鼠中适度增加，紫杉醇的血浆水平为不受尼罗替尼预处理的影响。

图3.紫杉醇给药后的紫杉醇（10 mg / kg; iv）用尼罗替尼（100 mg / kg;口服）或载体（每组n = 5）预处理的血药浓度 - 时间曲线

表2.含有或不含尼罗替尼（100 mg / kg）的小鼠中紫杉醇（10 mg / kg）的药代动力学参数

缩写：AUC，血浆浓度 - 时间曲线下的面积; Cmax，最大血浆浓度; CL，全身清除; T 1/2 ，终末期的半衰期; WT，野生型; KO，OATP1B2（ - / - ）。

笔记

仔细规划和全面准备研究对于确保PK研究的顺利完成至关重要。每笼两只小鼠对于涉及多种药物给药，紧张出血时间表的PK研究尤其重要。 PK研究的时间点是根据某些物种的个体药物特性设计的。对于我们在这份手稿中研究的药物，紫杉醇，它被快速排出体外，这就是为什么我们的时间 - 浓度曲线在2小时结束。根据IACUC机构的批准，调整并批准每次出血的时间/体积以及血液的总体积。对于半衰期较长的药物，您必须根据IACUC指南调整抽血时间表的时间和数量。
每次出血间隔三分钟可调，完全取决于PK团队的舒适程度。＆nbsp;
每个治疗组的样本量的确定在很大程度上取决于个体药物性质，个体研究组的实验变化。通常认为使用最小数量的小鼠达到科学统计学意义。根据我们的经验，每个治疗组的5只小鼠是大多数PK研究的最佳＃，包括紫杉醇。
PK研究是团队合作，确保参与研究的每个人都充分了解自己的责任，并且训练有素，技能熟练，能够按时履行职责。
记录每个细节步骤，并让第二个人检查药物制剂和程序的计算。

食谱

0.5％（m / v）HPMC
0.5克羟丙基甲基纤维素
100ml Millipore H 2 O

致谢

该方案改编自Leblanc 等人>（2018）。这项工作得到NIH拨款R01CA187176的支持。资助机构在编写手稿时没有任何作用。

利益争夺

作者没有任何潜在的利益冲突申报。

伦理

根据俄亥俄州立大学的机构动物护理和使用委员会对所有动物进行饲养和处理，并且所有研究均根据国家动物保护法进行。

参考

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Leblanc，AF，Sprowl，JA，Alberti，P.，Chiorazzi，A.，Arnold，WD，Gibson，AA，Hong，KW，Pioso，MS，Chen，M.，Huang，KM，Chodisetty，V.，Costa， O.，Florea，T.，de Bruijn，P.，Mathijssen，RH，Reinbolt，RE，Lustberg，MB，Sucheston-Campbell，LE，Cavaletti，G.，Sparreboom，A。和Hu，S。（2018）。 OATP1B2缺乏可防止紫杉醇引起的神经毒性。 J Clin Invest > 128（2）：816-825。
Liu，B.，Chang，J.，Gordon，W。P.，Isbell，J.，Zhou，Y。和Tuntland，T。（2008）。快照PK：快速啮齿动物体内>临床前筛查方法。药物Discov Today > 13（7-8）：360-367。
Reddy，J.，Madishetti，S。和Vachaspati，P。R.（2012）。快速小鼠PK（快速PK）：一种快速筛查方法，可提高临床前药物的药代动力学吞吐量发现。 Eur J Pharm Sci > 47（2）：444-450。