材料和试剂

移液器吸头（无RNase 1 ml，0.2 ml和0.02 ml，Corning，Axygen ®，产品目录号：T-1000，T-200，TF-20）
1.5毫升透明微管（Corning，Axygen ®，目录号：MCT-150-C）
夹笼（自制，40 x 30 x 35 cm，图1A）
人工吸尘器（国产，图1B）
陶瓷砂浆（外径= 120毫米）
PVDF膜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：88585）
滤纸（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703967）

图1.本研究中使用的自制夹笼和人工吸痰器。 A.用于培育昆虫载体和病毒传播的夹笼。 B.用于转移昆虫载体的人工吸痰器。
X光片
RRSV感染的水稻植株（在营养生长期）
寄主植物（ Oryza sativa > L. spp.japonica var.Nippobare）（所有转基因品系均为Nippobare背景）
昆虫载体（ Nilaparvate lugens > Stal）（收集自中国福建省福州市的田间种群，在25°C下培养16 h / 8 h [光照/黑暗]的光周期组织培养框架）;昆虫载体会在栽培过程中自然交配。＆nbsp;
引物
对于β-肌动蛋白>基因：
5'-CAGCCACACTGTCCCCATCTA-3'
5'-AGCAAGGTCGAGACGAAGGA-3'
对于RRSV CP >：
5'-GAGCAAACTTGAGGCGTA-3'
5'-AAGCTACCGTGTAGGTGGCG-3’
植物RNA试剂盒（Omega Bio-Tek，目录号：R6827）
DNase I（Omega Bio-Tek，目录号：E1091）
ReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO，目录号：FSQ-301）
THUNDERBIRD qPCR Mix（TOYOBO，目录号：QPS-201）
液氮
琼脂糖
针对RRSV编码的CP的自制单克隆抗体
ProteinFind抗β-微管蛋白小鼠单克隆抗体（TransGen Biotech，目录号：HC201-02）
ProteinFind Goat Anti-Mouse IgG（H + L），HRP Conjugate（TransGen Biotech，目录号：HS201-01）
化学发光HRP底物（默克，目录号：WBKLS0100）
预染色标记
乙醇（ALADDIN，目录号：E111963）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：75746-1KG）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：V900312）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：97622）
Glycerinum（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
Na 2 HPO 4 •12H 2 O（国药化学试剂，CAS号：10039-32-4）
脱脂奶粉（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：LP0031B）
30％丙烯酰胺溶液＆nbsp;
（NH 4 ） 2 S 2 O 8 （Sigma-Aldrich，目录号：A3678-25G）
TEMED（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：17919）
Tween 20（Xilong Scientific，CAS号：9005-64-5）
甘氨酸（Solarbio，目录号：G8200）
甲醇（国药化学试剂，目录号：10014108）
10％PAGE凝胶（参见食谱）
植物总蛋白质提取缓冲液（见食谱）
10x PBS缓冲液（参见食谱）
PBS-T（见食谱）
阻止解决方案（见食谱）
转移缓冲液（见食谱）
单克隆抗CP抗体溶液（见食谱）

设备

Eppendorf移液器套件（1毫升，0.2毫升，0.02毫升，0.01毫升和0.0025毫升）
陶瓷砂浆
离心机（Eppendorf，型号：5424 R和5427 R）
Vortex（Kylin-Bell实验室仪器，型号：VORTEX-5）
PCR放大器（Bio-Rad Laboratories，型号：T100）
荧光定量PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，型号：CFX Connect TM ）
凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories，型号：GelDoc TM XR +）
碱性电泳仪（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac TM Basic）
Mini-Protean Tetra（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN Tetra Cell）
半干转移槽（Bio-Rad Laboratories，型号：Trans-Blot SD）
超微紫外分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 2000）
开发机器（Carestream Health，型号：102）
脱色轨道振动筛（Kylin-Bell Lab仪器，目录号：TS-1000）
黑盒子
胶片盒（广东粤华医疗器械厂，型号：AX-II）

软件

SPSS for Windows 11.5版（IBM，Armonk，NY，USA）
凝胶成像软件（Bio-Rad Laboratories，型号：GelDoc TM XR +）
Bio-Rad qPCR软件（Bio-Rad Laboratories，型号：CFX Connect TM ）

程序

通过RT-PCR和Western印迹检测RRSV病株的水稻植物
RRSV病害水稻植物的来源，表现出典型的症状，包括发育不良，分蘖过度，以及深绿色和/或有锯齿状边缘或扭曲尖端的叶子（Zhang et al。>，2016），从田间采集（福建省福州市）。通过RT-PCR和Western印迹确认RRSV的存在。
1. RT-PCR
  1. 使用Plant RNA试剂盒（OMEGA Bio-Tek Inc.）按照制造商的说明从具有疾病症状的0.1g叶中提取总RNA。＆nbsp;
  2. 按照制造商的说明书，使用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒（TOYOBO）逆转录1μg总RNA。＆nbsp;
  3. 然后用引物扩增RRSV CP >基因：5'-GAGCAAACTTGAGGCGTA-3'和5'-AAGCTACCGTGTAGGTGGCG-3'。
  4. 在Bio-Rad CFX Connect TM PCR系统上，在95°C的循环条件下运行PCR 5分钟，然后进行25个循环，95°C，20秒，55°C，30秒， 72°C，5秒。
  5. 用引物扩增水稻β-肌动蛋白>基因：5'-CAGCCACACTGTCCCCATCTA-3'和5'-AGCAAGGTCGAGACGAAGGA-3'作为对照。＆nbsp;
  6. 进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用凝胶成像系统观察RRSV CP >基因的扩增产物。
2. 西方印迹
  从0.1g RRSV感染的叶中提取总蛋白，将其用液氮在陶瓷研钵中研磨成粉末，然后转移到1.5ml预冷的透明微管中，然后加入100μl植物蛋白提取缓冲液。使用涡旋使样品混合均匀。然后在6,010 x g > 4℃下离心10分钟。对于RRSV检测，使用20μl制备的总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹。具体步骤如下：
  1. 在PAGE凝胶的每个孔中加载20μl制备的总蛋白质以及预先染色的标记物，并在120V下运行凝胶90分钟。
  2. 准备一个略大于凝胶大小的PVDF膜。准备2张与PVDF膜一样大的滤纸。将PVDF膜，凝胶和滤纸置于1x转移缓冲液中10分钟。准备转移夹层（滤纸-PVDF膜 - 凝胶 - 滤纸）并将其置于具有3.0-5.5mA / cm 2 2 的半干转移槽中30分钟。
  3. 在室温（RT）下在PBS-T（参见配方）中用5％脱脂乳封闭膜0.5-1小时。
  4. 用PBS-T洗涤膜三次，每次5分钟。
  5. 通过在室温下使用脱色轨道振荡器将膜在单克隆抗CP抗体溶液（参见配方）中孵育2小时或在4℃过夜。
  6. 每次用PBS-T洗涤膜三次，每次10分钟。
  7. 通过在室温下使用脱色轨道振荡器在HRP缀合的抗体溶液中孵育1小时。用PBS-T洗涤膜5次，每次5分钟。
  8. 根据制造商的说明使用化学发光HRP底物进行印迹。
  9. 将一片X光胶片放入黑盒子中的胶片盒中。
  10. 使用显影机自动显影，固定，清洗和干燥曝光的胶片。
矢量病毒获取
1. 洗涤RRSV感染的水稻植物，如程序A中所述用水确认并将其置于方形塑料盒中，然后将盒子放入夹笼中（图2）。
  
  图2.幼虫若虫在RRSV感染的水稻植物上获得病毒。 A.夹子笼中RRSV感染的水稻植物中昆虫载体的摄食病毒过程概述。 B.患病水稻植物上的昆虫载体。 C.雌性BPH在交配过程之前（上部）和之后（下部）的形态。
2. 为了制备具有高病毒携带率的含毒BPH群体并克服BPH的有限寿命，我们允许20名在交配中完成的雌性BPH成年人用RRSV患病的水稻植物喂养，3-5天后，他们在RRSV上产卵感染的水稻。大约7天后，若虫开始孵化，以感染的大米为食，并尽早获得病毒。
3. 大约12天后，在若虫孵化后，所有的若虫都经历了9天的潜伏期（贾等。>，2012），然后它们可用于病毒传播。
4. 同时，我们将20只交配完成的雌性BPH成虫喂养健康水稻植株，以产生非毒性BPH群体作为对照载体。
用于病毒传播的水稻幼苗的制备
1. 加入150-200毫升的细土以清洁方形塑料盒，并在箱壁上加入100毫升水润湿土壤。
2. 在土壤上散布约100粒预先发芽的种子，然后撒上一层薄薄的土壤。将方形塑料盒放入夹笼中（图3A和3B），放置在25℃的生长室中的组织培养框架上，光周期为16小时/ 8小时（亮/暗），强度为5,000-7,000 Lux直到水稻幼苗已经长到2叶期，才可以用于病毒传播。
病毒传播
1. 让若虫在生长室中的组织培养框架上在试验幼苗中饲养3天。
2. 通过使用人工抽吸工具在三叶期测试水稻幼苗来吸收含有毒性和非含毒性的BPH若虫。由于BPH若虫的病毒携带率约为70％，若虫数量与幼苗数量之比为2：1（Zhang et al。>，2013）。＆nbsp;
移栽RRSV接种水稻幼苗
一旦水稻幼苗接种含有毒性和非含毒性的BPH若虫，从试验幼苗中彻底除去载体，然后在温室中种植水稻幼苗用于症状观察。如图3C所示，通常将16个水稻幼苗均匀地移植到一个盆中（图3C）。

图3.测试水稻幼苗的制备和完成病毒传播的水稻植株的移植。：一种。在含有150-200毫升潮湿细土的干净方形塑料盒中制备试验稻苗。 B.在夹子笼中生长的水稻幼苗以避免载体摄食。 C.将接种病毒的水稻幼苗移植到温室中生长的盆中。

数据分析

RT-PCR和Western印迹鉴定RRSV感染的来源植物
通过RT-PCR用基因RRSV CP >的236bp PCR产物鉴定RRSV感染的来源植物（图4A和4B）。通过Western印迹进一步验证RRSV CP的表达（图4C），其中β-微管蛋白作为上样对照。这些结果表明用于病毒接种的这些植物被RRSV感染。

图4.通过RT-PCR和蛋白质印迹鉴定RRSV病株。 A.具有典型症状的RRSV病株，包括矮小，分蘖数增加和深绿色叶片和/或有锯齿状边缘或扭曲尖端。 B.RTSV CP >基因的RT-PCR检测，用于鉴定RRSV感染的来源植物。 C.通过蛋白质印迹鉴定RRSV感染的来源植物。水稻 actin1 >和β-微管蛋白作为上样对照进行。
观察疾病症状
试验稻植物的疾病症状在接种后20天出现。从植物高度和分蘖数可以观察到试验稻样品的疾病症状的差异。我们通常在接种后45天拍摄每个大米样本的照片。
发病率统计
在接种后28天计数RRSV患病水稻植物的数量。病毒接种重复三次。通过RT-PCR鉴定RRSV感染的水稻植物（图5A）。通过柱图比较所有测试样品的发生率（图5B），并通过Student's t > -test分析显着差异。 P > - 值≤0.05被认为具有统计学意义。

图5. RRSV感染样本的发病率统计数据和不同样本中病毒含量的比较。 A.通过RT-PCR检测RRSV病株。 M，DNA标记; - ，从健康水稻植物的cDNA中检测到阴性对照; +，阳性对照，从含有RRSV CP >基因的质粒扩增该条带。 B.接种后4周RRSV接种的水稻植物的发病率。 C.进行RT-qPCR以指示RRSV CP >基因在不同RRSV接种水稻植物中的相对表达水平。
通过qRT-PCR比较病毒含量
疾病症状的严重程度始终与病毒感染的水稻植物中的病毒积累正相关。我们通过qRT-PCR检测RRSV CP >基因相对表达水平来比较不同的病毒含量（图5C）。
为了整体描述病毒接种分析的整个过程，过程图如图6所示。

图6. RRSV在水稻上的繁殖和感染概述

笔记

在有毒昆虫载体产卵之前完成病毒接种。
具有两片叶子的水稻幼苗适合于病毒接种。
所有稀释的抗体溶液均可在4°C下保存不超过1天。

食谱

10％PAGE凝胶（5毫升）
1.9毫升ddH 2 O
1.7毫升30％丙烯酰胺溶液
1.3ml 1.5M Tris-HCl（pH = 8.8）
0.05毫升10％（NH 4 ） 2 S 2 O 8
0.002毫升TEMED
通过加入100mg（NH ）制备10％（NH 4 ） 2 S 2 O 8 溶液。 4 ） 2 S 2 O 8 加入1 ml去离子水
植物总蛋白提取缓冲液
0.25M Tris-HCl（pH = 6.8）
8％β-巯基乙醇
20％甘油
8％SDS
10x PBS缓冲液
16克NaCl
4克KCl
4 g KH 2 PO 4
6 g Na 2 HPO 4 •12H 2 O
溶于900毫升蒸馏水中，最终体积为1000毫升（pH = 7.5）
PBS-T
以1：9的体积比稀释10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS），加入0.1％吐温20
阻止解决方案
PBS-T中的5％（w / v）脱脂奶粉
转移缓冲区
48 mM Tris
39 mM甘氨酸
20％甲醇
0.04％SDS
单克隆抗CP抗体溶液
将5μl单克隆抗CP抗体加入10 ml封闭液中

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金委员会的C. Zhang和J. G. Wu的资助（第31722045号; 31772128; 31701757和31201491）;国家基础研究计划973（2014CB138400）;和福建省自然科学基金，福建省新世纪杰出青年科研计划和优秀人才计划（JA3091和2014J06011）。我们还赞赏以前与其他人进行的水稻病毒繁殖和感染有关的工作。

利益争夺

没有任何利益冲突或竞争利益。

参考

Hibino，H。（1979）。稻米褴褛特技，一种在亚洲热带地区发生的新病毒病。 Rev Plant Prot Res > 12：98-110。
Jia，D.，Guo，N.，Chen，H.，Akita，F.，Xie，L.，Omura，T。和Wei，T。（2012）。通过病毒非结构蛋白Pns10装配病毒对于水稻粗糙特技病毒的持续感染至关重要在昆虫载体中。 J Gen Virol > 93（Pt 10）：2299-2309。
Ling，K.C.，Tiongco，E.R。和Aguiero，V。M.（1978）。稻米褴褛特技，一种新的病毒病。 Plant Dis Rep > 62（8）：701-705。
Zhang，C.，Ding，Z.，Wu，K.，Yang，L.，Li，Y.，Yang，Z.，Shi，S.，Liu，X.，Zhao，S.，Yang，Z。， Wang，Y.，Zheng，L.，Wei，J.，Du，Z.，Zhang，A.，Miao，H.，Li，Y.，Wu，Z。和Wu，J。（2016）。通过病毒诱导的microRNA319抑制茉莉酸介导的防御有助于水稻中的病毒感染。 Mol Plant > 9（9）：1302-1314。
Zhang，S。B.，Song，G。W.，Yang，L.，Wu，Z。J. and Xie，L。H.（2013）。确定水稻粗糙特技病毒和病媒传播特征。 J福建农业大学>（中文）。