材料和试剂

0.1-10μl移液器吸头（Gilson，目录号：F161630）
0.1-2μl移液器吸头（Eppendorf，目录号：3120000011）
0.5-10μl移液器吸头（Eppendorf，目录号：3120000020）
0.2μmFiltropur过滤器S（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
用于多步移液器的10 ml combitips（Eppendorf，目录号：0030069.269）
100-1,000μl移液器吸头（Greiner，目录号：686290）
2毫升微量管（Greiner，目录号：623201）
2-20μl移液器吸头（Eppendorf，目录号：3120000038）
2-200μl移液器吸头（Greiner，目录号：739290）
5毫升combitips（Eppendorf，目录号：0030069.250）
50毫升猎鹰管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
96孔板，黑色平底（Screening Devices b.v.，目录号：324002）
玻璃盖玻片（Carl Roth GmbH，目录号：NK75.1）
玻璃载玻片（Fisher-Emergo B.V.，目录号：361000）
多点玻璃载玻片（Hendley-Essex，目录号：SM011，白色）
TetraSpeck微球，0.2μm，荧光蓝/绿/橙/暗红（Invitrogen通过Thermo Fisher，目录号：T7280）
黑色透明底微量滴定板（Greiner，目录号：675096）
B中。 subtilis > 168（DSMZ，目录编号：402）
琼脂糖（Sphaero Q，目录号：S103b）
硫酸铁（II）（Fe（II）NH 4 柠檬酸盐）（Sigma-Aldrich，目录号：F5879）
硫酸铵（（NH 4 ） 2 SO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：A6387）
苄醇（Sigma-Aldrich，目录号：305197）
氯化钙二水合物（CaCl 2 •2H 2 O）（默克，目录号：102382）
酪蛋白水解物（酪蛋白氨基酸）（Duchefa，目录号：C1301.0250）
DiIC12（1,1'-二十二烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐）（Anaspec，目录号：AS-84902）
二甲基甲酰胺（DMF）（Sigma-Aldrich，目录号：227056）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4 ）（VWR，目录号：26932.290）
电子。大肠杆菌>极性脂质提取物（Avanti Polar Lipids，目录号：100600P）
葡萄糖（Duchefa Biochemie，目录号：G0802）
L-谷氨酸钾盐（Sigma-Aldrich，目录号：G1501）
短杆菌素S（Sigma-Aldrich，目录号：G0900）
注意：此产品已停产。本研究中使用的批次由斯泰伦博斯大学的Marina Rautenbach提供。>
盐酸（默克，目录号：1003171000）
硫酸铁七水合物（FeSO 4 •7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：215422）
Laurdan（6-十二烷酰基-N，N-二甲基-2-萘胺）（Sigma-Aldrich，目录号：40227）
硫酸镁七水合物（MgSO 4 •7H 2 O）（罗斯，目录号：T888.1）
硫酸锰四水合物（MnSO 4 •4H 2 O）（Fischer Scientific，目录号：M / 2250/53）
MP196（根据Albada et al。>，2012和Sanchez et al。>，2007通过固相肽合成合成）;本研究中使用的批次由波鸿鲁尔大学的Nils Metzler-Nolte提供
氯化钾（KCl）（VWR，目录号：26764.298）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（默克，目录号：104873）
Rhodomyrtone（纯化形式的 Rhodomyrtus tomentosa >叶根据Limsuwan 等>（Zhao et al。>，2013）;本研究中使用的批次是由Songkla大学Prince Supayang Voravuthikunchai提供
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：1.06404.1000）
Todd-Hewitt肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：T1438-500G）
Tris（默克，目录号：1083821000）
柠檬酸三钠二水合物（Na 3 柠檬酸盐•2H 2 O）（默克，目录号：106448）
胰蛋白胨（Duchefa Biochemie，目录号：T1332,1000MG）
L-色氨酸（Sigma Aldrich，目录号：T0254）
酵母提取物（Duchefa Biochemie，目录号：Y133）
ķ<子> 2 HPO <子> 4
琼脂糖溶液（见食谱）
BMM基本培养基（见食谱）
BMM补充剂（见食谱）
DiIC12洗涤介质（见食谱）
Laurdan缓冲液（见食谱）
Lysogeny肉汤（LB）培养基（见食谱）
SMM基本介质（见食谱）
SMM补品（见食谱）

设备

100-1,000μl移液器（Eppendorf，目录号：3120.000062）
20-200μl移液器（Eppendorf，目录号：3120000054）
HeraCell 150炉（Kendro，目录号：50075549B）
Cy3滤光片立方体（尼康，产品目录号：MXU96213）
DAPI滤镜立方体（尼康，目录号：MBE41300）
Laurdan定制过滤器立方体组成：
1. C-FL过滤块，仅限框架（尼康，目录号：MXA22030）
2. FF01-360 / 23-25激发滤光片（尼康，产品目录号：MXR00637）
  重要提示：与DAPI筛选器多维数据集中的筛选器相同。>
3. Di02-R405-25x36二向色镜（尼康，产品目录号：MXR00604）
  重要提示：与DAPI滤镜立方体中相同的二向色镜。>
4. FF01-535 / 5--25发射滤光片（尼康，目录号：MXX99999）
多步移液器（Eppendorf，目录号：022260201）
尼康Eclipse Ti倒置落射荧光（宽视场）显微镜（尼康，产品目录号：MEA53100）配备：
1. CFI计划Apochromat DM 100x NA 1.45油目标（尼康，目录号：MRD31905）
2. Intensilight HG 130 W光源（MBF72665）
3. C11440-22CU Hamamatsu ORCA Flash USB 3.0相机（尼康，产品目录号：MHC11441）
4. NIS elements AR软件（尼康，产品目录号：MQS31000）
读板器（BioTek Synergy Mx，目录号：SMATBCL）
温控微管离心机（Eppendorf，型号：5424R，目录号：5404000010）
Thermomixer（Eppendorf，目录号：5350000013）
水浴（GFL，目录号：5905985）
孵化器Heraeus HERAcell（Kendro Laboratory Products，目录号：50042307）
高压灭菌器（三洋，产品目录号MLS-3780）
单色
荧光光度计Quantamaster 2000-4（Photon Technology International）

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）
荧光分光光度计软件（PTI采集软件FeliX32版本1.2 Build 56）
微孔板阅读器软件Gen5版本2.00（Biotek）

程序

Laurdan
根据大多数制造商的说法，如果保持在-20°C并且避光，未溶解的laurdan可以稳定多年。但是，我们的经验是，它的光谱特性可能会更早地改变，具体取决于单个批次。由于这会显着影响结果的重现性，因此我们建议在350 nm激发时检查染料的发射波长光谱。为此，应进行laurdan染色的脂质体的发射波长扫描（参见下面的方案）。典型的laurdan光谱应在440 nm处显示清晰的峰，在480-500 nm处显示第二个峰或肩（图2）。劣化的laurdan批次在~420和~460 nm处显示两个峰，在440 nm处有明显的下降（图2）），这极大地影响了GP测量。由于这个问题，我们建议以下处理laurdan染料。在DMF中制备10mM Laurdan储备溶液。储备溶液通常可以在-20°C下保存长达3个月。在表面上可见的沉淀或胶束膜形成的情况下，需要制备新的原料。在首次使用前，应在排放扫描中检查每个新的10 mM原液。通过在DMF中稀释，由该原料制备1mM工作溶液。这确保了最终的DMF浓度为1％，这有助于保持月桂酸可溶于培养基或缓冲液中，并提高结果的可重复性。等分的工作溶液在-20℃下稳定4-6周。应避免多次冻融循环，并且必须始终保护laurdan溶液免受光照。为了获得最佳的重现性，一系列的所有实验都应使用相同的原料进行。

图2. laurdan随时间的恶化。 > laurdan的发射波长扫描结合到由 E制成的0.2μm脂质体中。记录大肠杆菌>极性脂质提取物，激发波长为350nm。如步骤A1b中所述染色脂质体。在恒定30℃的5mM Tris-HCl，pH 7.4中进行测量。注意440nm峰值在420和460nm处变为两个峰值。 Laurdan在-20°C时保持不溶，并且不断受到光照。
1. Laurdan光谱学
  使用laurdan进行光谱膜流动性测量是直截了当且易于实施的。使用配备有单色器的读板器获得最佳结果，但是适合的覆盖350nm激发和440和500nm发射波长的适当滤光器组也是合适的。该方案也适用于荧光计，但它们不能提供96孔板格式的高通量（注1）。恒温对于膜流动性测量至关重要，并且读板器必须配备精确的温度控制。理想情况下，样品制备在气候室进行，以确保温度稳定。如果无法做到这一点，必须快速处理样品，并且所有溶液和塑料制品必须预热。移液步骤在热混合器中进行。如果必须将样品运送到其他地方，则必须始终保持温暖。在准备多个样品时，建议使用多步或多通道移液器以节省样品处理时间。如果 B.subtilis >对氧消耗极为敏感，则细胞也必须始终保持摇动。为了防止剪切力对膜的损害，应尽量减少细胞移液，并且不得通过上下移液重新悬浮细胞颗粒。
  1. 细菌的Laurdan光谱学（注2）
    1. 在溶原肉汤（LB）或其他选择的培养基中建立过夜培养物，并在所需温度下生长过夜（通常为30或37℃;对于本文中的所有实验，我们使用30℃）（注释3和4）。
    2. 在新鲜LB或另一种选择的培养基中稀释过夜培养物1：100（注释3和4）。
    3. 在所需温度下生长，直至达到所需的细胞密度（标准：30或37°C，对数期）（注5）。
    4. 从1mM工作溶液中加入10μL的laurdan并孵育10分钟。
    5. 通过使用预热（30℃）2ml微管在预热的微管离心机（高达16,000 x g >，30s，30℃）中离心收获细胞。（注6）
    6. 在预热（30°C）的laurdan缓冲液中洗涤4次（注7）。在移液时使用热混合器使管保持温暖。通过短时间涡旋重悬细胞而不是上下移液以避免可能损伤膜的剪切力。
    用于终点测量（图3A）
    1. 将细胞重悬至最终OD 600 0.4。
    2. 使用荧光板读数器将每孔200μl（注释8）的细胞悬浮液加入到预热（30℃）的黑色平底和透明底部微量滴定板中。根据样品数量，应使用多步移液器（注9）促进此步骤。
    3. 在合适的读板器中测量荧光（激发：350nm，发射：460和500nm）。
    用抗生素进行终点测量（注10）（图3B和3D）
    1. 将细胞重悬至最终OD 600 0.4
    2. 将220μl细胞加入2 ml预热（30°C）微量管中，并加入适当的抗生素浓度。
    3. 在恒温下在恒温箱中孵育并摇动所需时间。通常，对于大多数抗生素，5-10分钟的治疗就足够了。用30-50mM膜流化剂苄醇处理用作阳性对照。由于另外的对照测量（i）洗涤步骤的上清液（以确定洗涤效率）和（ii）laurdan缓冲液（以减去背景）。染色细胞的荧光强度应至少比laurdan缓冲液背景对照的荧光强度高10倍。＆nbsp;
    4. 每孔加入200μl孵育的细胞悬浮液至预热（30℃）黑平和透明底微量滴定板（注释10）。
    5. 在荧光板读数器中测量荧光（激发：350nm，发射：460和500nm）。
    用抗生素进行动力学测量（注9）（图3C和4）
    1. 将细胞重悬至最终OD 600 0.8。
    2. 在预热（30℃）的黑色平底和透明底部微量滴定板（注释6和8）中，将100μl染色的细胞悬浮液加入100μl预热（30℃）的laurdan洗涤缓冲液（对照样品）中。
    3. 在6-10分钟内以2分钟的间隔测量荧光板读数器中的荧光，以记录治疗前基线（注释11）。
    4. 将100μl染色细胞悬浮液加入100μl预热（30°C）laurdan洗涤缓冲液中，该缓冲液含有预热（30°C）黑色平底和透明底微量滴定板中所需抗生素浓度的两倍。如有必要，使用多步移液器减少样品处理时间。
    5. 立即在30分钟内以2分钟的间隔测量荧光（注释12和13）。
    6. 如果正确完成，未处理细胞的laurdan GP测量结果非常可重复，即使使用不同批次的生长培养基也是如此（图4）。抗生素处理的样品可能会显示出更多的变异，但通常也可以很好地重现（图4）。
    图3.活细菌中的光谱Laurdan测量结果。 A. B的一点测量。枯草杆菌> 168（Anagnostopoulos和Spizizen，1961）在不同条件下生长。 SMM（Spizizen基本培养基）和BMM（Belitzky基本培养基）是通常用于 B的基本培养基。枯草杆菌>（Anagnostopoulos和Spizizen，1961;Stülke et al。>，1993; Wenzel et al。>，2011）。请注意，不同介质对膜流动性的影响远远大于温度和生长阶段的中度差异。早期对数期是指OD 600 为0.3。晚对数期是指OD 600 为0.8。 B. Laurdan测量 B的一点。用抗生素处理10分钟（生长温度30℃）的枯草芽孢杆菌168。使用最小抑制浓度。 C. B的动力学Laurdan测量。在与（B）相同的条件下用相同的抗生素处理枯草芽孢杆菌168。注意抗微生物六肽MP196与环状β-折叠肽短杆菌肽S和膜流化剂苯甲醇的即时效果相比的逐渐效果。 D.一点Laurdan测量 S.金黄色葡萄球菌> NCTC 8325（Bæk et al。>，2013）。 S上。金黄色葡萄球菌>在LB中于37℃生长。在OD 600 0.3下进行测量。注意 S的不同膜流动性。金黄色葡萄球菌>和 B.枯草杆菌>在相同的生长条件下展示。
    
    图4.使用 B进行的laurdan测量的再现性。 subtili > s > 。> B.枯草芽孢杆菌168在连续摇动下于30℃在LB中生长。显示了三个不同日期的三个独立的生物学重复。为每个重复分别准备Laurdan储备，缓冲液和培养基。误差棒显示5个技术重复的标准偏差。未经处理的样品具有高度可重复性，而抗生素处理的样品则略有不同。
  2. 脂质体的Laurdan光谱学
    1. 用您选择的方法和缓冲液从所需的脂质中制备脂质体。在这里，我们使用由 E制备的10mg / ml0.4μm脂质体。使用Strahl和Hamoen（2010）中描述的去污剂 - 透析方法，在50mM Tris-HCl，pH7.4中加入大肠杆菌极性脂质提取物。
    2. 用双蒸水稀释脂质体原液至终浓度为1mg / ml脂质体和5mM Tris-HCl，pH7.4。
    3. 从1mM工作储备溶液在DMF中加入10μL的laurdan，并在30℃下孵育30分钟。始终保持温度稳定（此处为30°C）。
    用抗生素进行一点测量（图5A）
    1. 将20μl染色脂质体加入180μl5mM Tris-HCl（pH 7.4）中，加入和不加抗生素化合物，置于黑色扁平透明底微量滴定板（预热至30°C）中，孵育所需时间（2） -10分钟通常就够了）（注13）。
    2. 在微量滴定板读数器中测量样品。
    用抗生素进行动力学测量（图5B）
    1. 将20μl染色的脂质体加入到180μl预热（30℃）的5mM Tris-HCl，pH 7.4（对照样品）中，在黑色平坦且透明的底部微量滴定板中（注释13）。
    2. 在6-10分钟内以2分钟间隔测量荧光以记录治疗前基线。
    3. 将20μl染色的脂质体加入到180μl预热（30℃）的5mM Tris-HCl，pH 7.4，其中含有抗生素化合物（最终浓度计算为200μl终体积），在黑色平坦且透明的底部微量滴定板中。
    4. 以2分钟为间隔测量样品30分钟（注释14）。
    图5.由 E组成的脂质体的Laurdan测量。大肠杆菌> 极性脂质提取物。 A.用不同浓度的抗生素测量Laurdan的一点。将脂质体保持在恒定的30℃。注意浓度依赖性硬化/流化效应。由于未知的生物因素（例如与细胞壁成分的结合）无法准确确定脂质与化合物的体内比例，因此无法将它们与体外>脂质与化合物比率进行比较人造脂质体。因此，我们建议测试一系列浓度以控制例如>，在过高浓度下的总膜裂解。 B.在（A）中使用的相同条件下的动力学Laurdan测量。注意抗微生物六肽MP196与环状β-折叠肽短杆菌肽S和膜流化剂苯甲醇的即时效果相比的逐渐影响，这与体内>测量非常相符（图3C）。
2. Laurdan显微镜
  Laurdan显微镜需要荧光显微镜，其具有高质量的100x油浸物镜，用于校正色差（参见步骤A2a），温度室和一组特定的过滤器。 350nm激发和440nm发射通常由标准DAPI滤光器组覆盖。对于第二发射波长，需要使用与DAPI设置完全相同的激发滤光片和二向色镜的特殊滤光片组，但需要覆盖500-540 nm的发射滤光片（参见设备部分中描述的滤光片）。由于膜流动性的温度依赖性变化很快发生，温度控制室对于可靠和可重复的结果至关重要。
  1. 显微镜校准
    对于laurdan显微镜，对每个发射波长拍摄单独的图像。为了正确的GP计算，这些图片的完美叠加是必不可少的。因此，在laurdan显微镜实验之前，有必要确定放大率和z偏移的波长相关差异。这些像差取决于物镜类型，并且可以使用具有高度色差校正的高质量物镜（例如Nikon APO或Zeiss APOCHROMAT系列）大大减少。在使用Nikon CFI Plan Apochromat物镜的laurdan设置中（有关物镜和滤光片的详细信息，请参见设备部分），色差可忽略不计。只有在更换物镜或滤光片后才需要进行校准。
    1. 准备覆盖有1.2％琼脂糖薄膜的显微镜载玻片（注释15），并找到适当稀释的多色荧光珠（例如>，TetraSpeck）。
    2. 选择一个视野，其中珠子位于该区域的边缘附近。
    3. 执行两个波长的z-stack（200 nm步长，5μm深度）。
    4. 通过检查捕获的z-stack，为每个波长选择精确的焦平面。这里，通过测量所选荧光珠的点扩散函数（PSF）来确定最佳焦点。具有最佳焦点的焦平面的特征在于最窄的PSF。该步骤可以通过在珠子上测量的线扫描轮廓确定荧光强度在ImageJ中进行。如果最佳焦平面在所使用的波长之间不同，则通过在显微镜软件的图像采集程序中引入相应的波长相关z偏移来纠正此误差。
    5. 在视场的相对边缘选择两个珠子，并测量每个波长的荧光珠子中心之间的距离。根据目标，对于440nm发射波长图像，距离（以像素或以μm为单位测量）将略微更大。使用此值可以在ImageJ中进行数据分析时调整520 nm发射波长图像的大小。＆nbsp;
  2. Laurdan显微镜（注2）（图6）
    1. 在溶原肉汤（LB）或其他选择的培养基中建立过夜培养物，并在所需温度（通常30或37℃）下生长过夜（注释3和4）。
    2. 在新鲜LB或其他选择的培养基中稀释过夜培养物1：100（注释3和4）。
    3. 在所需温度下生长，直至达到所需的细胞密度（标准：30或37°C，对数期）（注5）。
    4. 从1 mM工作溶液中加入10μL的laurdan并孵育10分钟（注释16）。
    5. 通过使用预热（30℃）2ml微管在预热的微管离心机（高达16,000 x g >，30s，30℃）中离心收获细胞。
    6. 在预热（30°C）的laurdan缓冲液中洗涤4次（注释6）。在移液时使用热混合器使管保持温暖。通过涡旋而不是上下移液来重悬细胞，以避免可能损伤膜的剪切力（注17）。
    7. 在laurdan缓冲液中重悬至OD 600 0.4。
    8. 在预热（30°C）2 ml微管中制备50-200μl等分试样并添加抗生素（或应用其他感兴趣的条件）。孵育时间为5-10分钟通常就足够了（注18）。
    9. 取出0.5μl并在覆盖有1.2％琼脂糖薄层的载玻片上斑点（注释15）。等到液滴刚刚干涸（约60秒）并立即加入盖玻片。防止盖玻片和琼脂糖之间形成气泡。
    10. 使用相位对比度或明场搜索具有足够数量单元的良好视野。完美的焦点对于laurdan显微镜至关重要。
    11. 在laurdan自定义频道中拍照，然后在DAPI频道中拍摄第二张照片（通常每张曝光时间为1秒）（注释19,20和21）。
    图6. B的Laurdan显微镜。枯草杆菌> 168。使用具有完全相同的激发滤光片（360 nm）和二向色镜（405 nm）的两个滤光片立方体，分别拍摄440 nm（A）和520 nm（B）发射波长的照片。。在校正波长相关的尺寸像差和z漂移之后，可以使用ImageJ Calculate GP插件（C）生成GP图。由于将为任何像素计算GP值，因此对每张图片应用单独的背景校正非常重要。然而，无义GP值仍将出现在细胞的细胞质空间中，对于未经训练的眼睛，可能难以将细胞膜与其余细胞区分开。因此，有助于用一个荧光通道图片（红色）创建laurdan GP图片（灰色）的叠加，以确定GP图片中细胞质膜的确切位置（D）。这也极大地有助于使用ImageJ测量感兴趣区域（例如>，膜片或静止膜）中的GP值。该图改编自Saeloh 等人>（2018）。
DiIC12
DiIC12显微镜原则上可以用任何良好的荧光显微镜进行。建议使用Cy3滤光片（此处为535 nm激发和590 nm发射）以获得最佳信号。虽然可以使用标准RFP滤波器（约570nm激发和645nm发射）检测DiIC12，但是低得多的信号通常导致不太清晰的RIF。虽然染色程序很简单，但在 B中观察到清晰的RIF。枯草杆菌>严重依赖于生长阶段，并且应激细胞显示平滑的DiIC12染色或大的斑块。因此，稳定的培养条件是必不可少的，特别是在温度和氧气供应方面。
＆NBSP;使用DiIC12的流体膜结构域染色可以容易地适应其他革兰氏阳性细菌，例如，， S.金黄色葡萄球菌>和 S.肺炎>（图7）。然而，严格意义上的RIF定义为在 B中观察到的流体焦点。枯草杆菌>和大肠杆菌>似乎是MreB依赖性纵向细胞伸长的现象（Strahl et al。>，2014; Oswald et al。 >，2016），并且不会出现在生长方式不同的细菌中（Saeloh et al。>，2018）（图7）。 DiIC12可用于革兰氏阴性细菌，但可能导致较弱的膜染色。 E的成功方法。大肠杆菌>由Oswald 等人建立>（2016）。
1. DiIC12显微镜（图7和8）
  1. 在溶原肉汤（LB）或其他选择的培养基中建立过夜培养物，并在所需温度（通常30或37℃）下生长过夜（注释3和4）。
  2. 在新鲜LB或其他选择的培养基中稀释过夜培养物1：100（注释3,4和22）。
  3. 从DMSO中的100μg/ ml原液中添加1μg/ ml DiIC12（1％DMSO终浓度）（注释23和24）。
  4. 在所需温度下生长直至达到所需的细胞密度（注释25和26）。
  5. 通过使用预热（30℃）2ml微管在预热的微管离心机（高达16,000 x g >，30s，30℃）中离心收获细胞。
  6. 在预热（30°C）LB中补充1％DMSO（和其他补充剂，如诱导剂或辅因子，如果适用）洗涤4次（注释25和28）。在移液时使用热混合器使管保持温暖（30°C）。通过涡旋而不是上下移液来重悬细胞，以避免可能损伤膜的剪切力（注17）。
  7. 在相同的介质中重悬至OD 600 0.4。
  8. 对于抗生素治疗：在预热（30°C）2 ml微管中制备50-200μl等分试样并添加抗生素（或应用其他感兴趣的条件）。孵育时间为5-10分钟通常就足够了（注18）。
  9. 取出0.5μl并在覆盖有1.2％琼脂糖薄层的载玻片上点样（注释15）。等到液滴刚刚干燥并加入盖玻片，没有气泡。
  10. 使用相位对比度或明场搜索具有足够数量单元的良好视野。
  11. 在Cy3频道拍照。如果显微镜没有配备Cy3滤光片立方体，也可以使用标准RFP滤光片观察DiIC12，但这会产生较低的荧光信号（注释27和28）。
  图7.对数生长 B的DiIC12染色。枯草杆菌> 168， S.肺炎支原体> D39（Lanie et al。>，2007）和 S. aureus > NCTC 8325。 B中的RIF。枯草杆菌>由肌动蛋白同系物MreB组织。有趣的是， S.肺炎>和 S.金黄色葡萄球菌>，两者都没有MreB同源物，不能显示明显不同的RIF。然而，两种细菌都没有显示出完全光滑的荧光膜，并且膜污染的轻微不规则性表明了流体微区。用引起流体膜结构域的rhodomyrtone处理（Saeloh et al。>，2018），导致DiIC12染料在所有细菌的流体膜病灶中明显积累（黄色箭头）。细胞在37℃下在LB（ B.subtilis >， S.aureus >）或Todd-Hewitt肉汤中培养，补充0.5％酵母提取物（ S. pneumoniae >）。比例尺=2μm。
  
  图8.在 B的对数生长阶段，RIF变得清晰可见。枯草杆菌>。 A.随着时间的推移开发RIF。 B中。枯草芽孢杆菌168在37℃下在连续摇动下在LB中生长。取出样品用于不同生长阶段的显微镜检查。 B. RIF也发生在基本培养基中。 B中。枯草芽孢杆菌168在连续摇动下于37℃在BMM中生长。比例尺=2μm。

数据分析

Laurdan光谱学
1. 根据以下公式计算Laurdan GP：GP =（I 460 - I 500 ）/（I 460 + I 500 ）。
2. 对于动力学测量，绘制GP对时间。
有关 B的终点和动力学测量的示例，请参见图3。枯草杆菌>， S.金黄色葡萄球菌>和脂质体。图4显示了使用 B的动力学流动性测量的实例的测定的再现性。用抗微生物肽MP196和短杆菌肽S处理枯草芽孢杆菌（Wenzel 等，>，2014）。表1显示了示例性终点实验的数据。

表1.示例性的laurdan实验。如步骤A1a'用抗生素测定终点'所述，在30℃下进行实验。背景减去的值用于GP计算。
Laurdan显微镜
1. 将DAPI频道图片重命名为“A”，将Laurdan自定义频道图片重命名为“B”（请参阅补充文件1 ，例如图片）。
2. 在ImageJ中打开图片。确保首先打开图片'A'，然后打开图片'B'。
3. 使用从显微镜校准确定的校正值校正图像尺寸（参见步骤A2a显微镜校准）。
4. 执行'Align'插件以完美对齐感兴趣的单元格（补充文件2 ）。
5. 使用矩形工具确定两张图片中的背景值（平均强度）并执行“测量”。
6. 执行'计算GP'插件（补充文件3 < / A>）。这将导致出现多张图片。 “A”和“B”是背景扣除图像，“A + B”和“A-B”是用于计算GP的图像，“比率”是可视化GP值的最终图像。
7. 将显着性设置为A和B的视野中最高像素强度的10％。该值表示包含在GP计算中所需的最小信号强度。使用测量的背景值（平均强度）进行A和B的背景扣除。必须注意的是，这些值通常是我们手中的良好起点，但由于最佳值取决于具体的研究问题，具体的研究问题，并且在给定显微镜设置的情况下，可能需要修改这些值以获得最佳图像。尝试不同的值，直到得到的图片清楚地显示没有细胞外背景的细胞。细胞内背景将始终保留，但应从分析中排除。确保不要减去太多的背景，因为这可能会导致切断膜信号。为了控制这一点，所得到的GP图像与荧光图像'A'的叠加可以帮助找到GP图像中细胞膜的确切位置（参见图6D）。请注意，这些修改只会更改数据的可视化，而不会更改GP值本身。
8. 将查找表（LUT）设置为'Rainbow RGB'。
9. 编辑LUT - ＆gt;打开 - ＆gt; GP map.lut（补充文件4 ）。
10. 现在，图片显示了使用光标越过图片时的GP值。
11. 保存此图片并将其用于所有量化目的，例如行扫描等>。在其他图像软件中打开时，它将以灰度显示。
12. 出于显示目的，将图片导出为RGB TIFF。此图片仅用于显示目的，因为RGB颜色格式消除了GP信息。

笔记

光谱laurdan测量可以96孔格式进行，原则上适用于高通量方法。但是，必须确保样品处理和测量过程中的恒定温度和氧气供应。在 B的情况下。枯草杆菌>和其他对氧耗竭具有相似敏感性的物种，细胞不能停止振动超过最长2分钟。在设计实验时必须牢记这一点（例如>，关于测量间隔和板读取器中的摇动时间）。
已经为 B建立并优化了这些测定。枯草杆菌>但可以很容易地适应其他革兰氏阳性菌（参见 S.aureus >，图3D）。对于革兰氏阴性细菌，外膜应通过加入多粘菌素B九肽进行透化，例如>。
在水浴中孵育比在干燥振荡器或温度室中孵育提供更好的温度稳定性。
玻璃器皿易于从清洁溶液中释放肥皂消毒剂，这会影响膜的流动性。使用一次性塑料制品（如Falcon管）可确保化学污染不会影响实验。对于 B。枯竭>，对氧消耗非常敏感，在水浴中在50 ml falcon管中培养2 ml培养物已被证明是流动性实验的最佳选择。
对于抗生素研究，OD 600 0.3-0.5已被证明是最佳的。由于培养物后期稀释，因此总是增加所需体积的两倍。不要长到所需OD的两倍，因为生长阶段会影响膜的流动性。
虽然离心对膜流动性的影响尚未直接研究，但离心力可能会影响细胞膜。因此，我们不建议产生比产生固体细胞沉淀所需的更高的离心力，并建议将离心时间保持在最低限度。
LB和类似介质的黄色和弱自发荧光干扰了laurdan荧光。因此，laurdan缓冲液用于洗涤和进一步孵育。当使用透明培养基，例如Spizizen或Belitzky Minimal Medium时，可以用补充有1％DMF的相应透明培养基替换laurdan缓冲液。
可以根据读板器的摇动速度调节样品体积。根据 B的要求快速摇动。使用高样本量时，枯草杆菌>可能会因飞溅而导致交叉污染。
实验应以技术三次进行。
如果确保恒定的温度和通气，例如>，通过使用具有微量滴定板支架的热混合器，可以更直接地在微量滴定板中进行抗生素处理。为此，只需使用“抗生素动力学测量”描述的程序，并执行终点而不是动力学测量。
动力学测量需要在laurdan缓冲液中存在葡萄糖，以便在30分钟测量期间保持细胞通电并使膜极化。不建议进行更长时间的测量。但是，可以在任何时间点采集单独的样品，染色，清洗，并进行一点测量。使用透明培养基可以防止出现此问题。但是，请注意不同的生长培养基会彻底改变膜的流动性（图3A）。
需要在测量时OD 600 为0.4以保持测量值随时间稳定。较低的OD导致未处理的对照细胞中的GP值不稳定（持续降低或“跳跃”）。
这取决于脂质混合物（因为laurdan更好地插入更多的流体膜），脂质体制备方法，读板器和染色质量，样品必须稀释多少。因此，建议在运行实际实验之前运行测试样本。
虽然对于体外>实验不是必需的，但在样品处理和测量期间脂质体样品也保持连续摇动以保持条件尽可能与体内>实验相似。
薄且完全平坦的琼脂糖薄膜是laurdan显微镜的关键。有关如何准备合适载玻片的详细说明，请参阅（Te Winkel et al。>，2016）。应遵循相同的方案来制备用于DiIC12显微术的载玻片。
虽然laurdan没有表现出与其他膜染料如尼罗红或FM5-95相关的光谱重叠，但我们已经观察到这种染料在共染色实验中对laurdan GP的显着影响。因此，如果需要与其他膜染料共染色，我们严格建议运行仅含有laurdan的对照。
请注意，管道中的物理和化学应力因素（如剪切力，温度冲击或残留化学物质）可能都会影响膜的流动性，并导致斑片状膜污染，这会影响laurdan和DiIC12显微镜实验。
已知去极化剂如质子离子载体羰基氰化物间氯苯肼（CCCP）会在 B中引起流体膜斑块。枯草杆菌>（Strahl et al。>，2014），可用作阳性对照。迄今为止，在其他细菌的laurdan显微镜实验中发表的唯一一种引起流体膜斑的化合物是rhodomyrtone，它至少可以用作 B的阳性对照。枯草杆菌>， S.金黄色葡萄球菌>和肺炎链球菌>（Saeloh et al。>，2018）。
通过将细胞保持在盖玻片下太长时间的氧消耗，例如>，导致膜去极化，这也导致流体膜贴片（Strahl和Hamoen，2010; Strahl 等。< / em>，2014）。建议在安装细胞后10-15分钟内完成显微镜检查以避免这种伪影。始终先对未经处理的对照进行成像。然后在完成最后一个样品后，再次检查是否因氧气耗尽而出现任何异常膜污染的迹象。曝光时间可能因光源和滤光片而异，但两个通道的曝光时间必须相同。
在2x 1秒的荧光曝光后，该laurdan染料受到光漂白的适度影响。由于良好的信噪比对于良好的GP计算很重要，因此每个通道只能暴露一次相同的区域。我们通常在两个通道中与未处理的对照细胞达到至少5：1的信噪比。
隔夜培养不应过度静止，甚至不应处于死亡阶段，因为这会导致较长的滞后期并可能影响RIF。
不要将DiIC12添加到玻璃器皿中，因为它在很大程度上会不可逆地污染玻璃表面。
最终浓度为1％的DMSO有助于保持DiIC12的可溶性并且应该持续保持。然而，高浓度的DMSO可能会影响细胞膜并引起细菌应激反应。因此不建议使用较高的DMSO浓度。
RIF仅在对数生长期（在 B.subtilis > OD 600 为0.2-0.8）中清晰可见。在我们的手中，滞后期和固定期细胞总是显示出光滑的膜污染（图8A）。耗尽氧气或暴露于温度变化的细胞也可能显示具有大膜片的平滑或异常的DiIC12图案。
DiIC12对 B.subtilis >无毒，也适用于延时实验。然而，由于RIF在该生物体中是生长期依赖性的，由于生长速率降低，它们在基因框架下生长的细胞中可能不太明显（比较在基本培养基中生长的细胞，图8B）。微流体装置已被证明非常适合DiIC12延时显微镜（Saeloh et al。>，2018）。
DiIC12倾向于形成大的沉淀物，导致强背景。需要彻底清洗细胞以将背景降至最低。在遵循时间过程时，可能需要在显微镜检查之前立即再次清洗样品。
使用适当的Cy3滤光片立方体的良好染色仅需要50-300毫秒的曝光时间。由于在mCherry通道中也检测到DiIC12，因此它不能与红色荧光染色剂或RFP融合剂一起使用。
流入GFP通道的流量很低但存在。当将DiIC12与GFP融合与弱荧光信号结合时，应牢记这一点，并应包括渗透控制。由于未知的原因，DiIC12也可能影响GFP融合的信号强度（Strahl et al。>，2014），这可能需要对诱导物和染料浓度进行一些调整。

食谱

注意：所有溶液均用双蒸水制备。>

琼脂糖溶液
1.2％，新鲜配制
BMM基础媒体
50mM Tris-HCl，pH 7.5
15 mM（NH 4 ） 2 SO 4
8mM MgSO 4 •7H 2 O
27 mM KCl
7mM Na 3 柠檬酸盐·2H 2 O
高压灭菌器
BMM补充剂
200 mM KH 2 PO 4 （高压灭菌器），向100 ml BMM基础培养基中添加0.3 ml
1 M CaCl 2 •2H 2 O（高压灭菌器），向100 ml BMM基础培养基中加入0.2 ml
0.5 mM FeSO 4 •7H 2 O（滤液），在100 ml BMM基础培养基中加入0.2 ml
25 mM MnSO 4 •4H 2 O（滤液），向100 ml BMM基础培养基中添加0.04 ml
0.5M谷氨酸（滤液），加入0.9ml至100ml BMM基础培养基 39mM色氨酸（滤液），加入2ml至100ml BMM基础培养基中 20％葡萄糖（滤液），加入1ml至100ml BMM基础培养基
DiIC12洗涤介质
LB（高压灭菌）（见下文）
1％DMSO
新鲜的
Laurdan缓冲区
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH 2 PO 4
0.2％葡萄糖
1％DMF
滤液
Lysogeny肉汤（LB）培养基
10克/升胰蛋白胨
5克/升酵母提取物
10 g / L NaCl
高压灭菌器
SMM基础媒体
13.9g / L K 2 HPO 4
6g / L KH 2 PO 4
2 g / L（NH 4 ） 2 SO 4
2 g / L Na 3 柠檬酸盐•2H 2 O
高压灭菌器
SMM补充剂
40％葡萄糖（滤液），在100ml SMM基础培养基中加入1.25ml
将5毫克/毫升色氨酸（滤液）加入1毫升至100毫升SMM基础培养基中 1 M MgSO 4 •7H 2 O（滤液），在100 ml SMM基础培养基中加入0.6 ml
20％酪蛋白氨基酸（滤液），加入0.1 ml至100 ml SMM基础培养基中 0.22％Fe（II）NH 4 柠檬酸盐（滤液），在100ml SMM基础培养基中加入0.05ml

致谢

本文详细描述了用于表征响应抗生素的膜流动性变化的方法（Saeloh et al。>，2018）。 MP196由Nils Metzler-Nolte，波鸿鲁尔大学，斯泰伦博斯大学Marina Rautenbach的短杆菌素S和宋卡王子大学Supayang Voravuthikunchai的rhodomyrtone提供。作者希望感谢Annelies Eenhoorn的技术援助。这项工作得到了荷兰科学研究组织（NWO， http://nwo.nl/en ）的资金支持， STW-Vici 12128到LWH）。 MW得到阿姆斯特丹感染与免疫研究所的博士后津贴支持。
作者贡献： MW和HS建立了实验程序。 NOEV和HS编写了ImageJ'Align'和'Calculate GP'插件。 LWH监督实验。所有作者都撰写和编辑了论文。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突或竞争利益。

参考

Albada，H.B.，Chiriac，A.I.，Wenzel，M.，Penkova，M.，Bandow，J.E.，Sahl，H.G。和Metzler-Nolte，N。（2012）。用N-末端金属茂烯基调节含有短精氨酸 - 色氨酸的抗菌肽的活性。 Beilstein J Org Chem > 8：1753-1764。
Anagnostopoulos，C。和Spizizen，J。（1961）。 Bacillus subtilis >的转化要求。 J Bacteriol > 81（5）：741-746。
Bach，J。N.和Bramkamp，M。（2013）。 Flotillins在功能上组织细菌膜。 Mol Microbiol > 88 （6）：1205-1217。
Bæk，K.T.，Frees，D.，Renzoni，A.，Barras，C.，Rodriguez，N.，Manzano，C。和Kelley，W。L.（2013）。全基因组揭示的金黄色葡萄球菌> 8325菌株谱系的遗传变异排序。 PLoS One > 8（9）：e77122。＆nbsp;
Barák，I。和Muchová，K。（2013年）。脂质结构域在细菌细胞过程中的作用。 Int J Mol Sci > 14（2）：4050-4065。
Baumgart，T.，Hunt，G.，Farkas，E.R.，Webb，W。W.和Feigenson，G.W。（2007）。荧光探针在脂质膜中的Lo / Ld相之间进行分配。 Biochim Biophys Acta > 1768（9）：2182-2194。
Beranova，J.，Jemiola-Rzeminska，M.，Elhottova，D.，Strzalka，K。和Konopasek，I。（2008）。冷适应过程中 Bacillus subtilis >中膜流动性的代谢控制。< / a> Biochim Biophys Acta > 1778（2）：445-453。
Bramkamp，M。和Lopez，D。（2015）。探索细菌中脂筏的存在。 Microbiol Mol Biol Rev < / em> 79（1）：81-100。
Epand，R。M.和Epand，R。F.（2009）。细菌膜中的脂质结构域和抗菌剂的作用。 Biochim Biophys Acta > 1788（1）：289-294。
Garcia-Fernandez，E.，Koch，G.，Wagner，RM，Fekete，A.，Stengel，ST，Schneider，J.，Mielich-Suss，B.，Geibel，S.，Markert，SM，Stigloher，C。和Lopez，D。（2017）。膜微区解体抑制MRSA抗生素耐药性。细胞> 171 （6）：1354-1367 e1320。
Karabadzhak，A.G.，Weerakkody，D.，Deacon，J.，Andreev，O.A.，Reshetnyak，Y。K.和Engelman，D.M。（2018）。双层厚度和曲率会影响pHLIP肽的结合和插入。 Biophys J > 114（9）：2107-2115。
Kingston，A.W。，Subramanian，C.，Rock，C.O。和Helmann，J。D.（2011）。 Bacillus subtilis >中σW依赖的应激反应会降低膜的流动性。 Mol Microbiol > 81（1）：69-79。
Lanie，J.A.，Ng，W.L.，Kazmierczak，K.M.，Andrzejewski，T.M.，Davidsen，T.M.，Wayne，K.J.，Tettelin，H.，Glass，J.I。和Winkler，M.E。（2007）。艾利毒性链球菌毒株D39 肺炎链球菌>的基因组序列及比较与未包封的实验室菌株R6相同。 J Bacteriol > 189（1）：38-51。
Lopez，D。和Kolter，R。（2010）。细菌膜中的功能性微区。 Genes Dev > 24（ 17）：1893-1902。
Müller，A.，Wenzel，M.，Strahl，H.，Grein，F.，Saaki，TN，Kohl，B.，Siersma，T.，Bandow，JE，Sahl，HG，Schneider，T。和Hamoen，LW （2016）。达托霉素通过干扰液膜微区来抑制细胞包膜合成。 Proc Natl Acad Sci US A. > 113（45）：E7077-E7086。
Oswald，F.，Varadarajan，A.，Lill，H.，Peterman，E.J。和Bollen，Y。J.（2016）。 MreB依赖的 E组织。大肠杆菌>细胞质膜控制膜蛋白扩散。 Biophys J > 110（5）：1139-1149。
Parasassi，T。和Gratton，E。（1995）。通过Laurdan荧光检测到的膜脂质结构域和动力学。 J Fluoresc < / em> 5（1）：59-69。
Reddy，A。S.，Warshaviak，D。T.和Chachisvilis，M。（2012）。膜张力对DOPC脂质双层膜物理性质的影响。 Biochim Biophys Acta > 1818（9）：2271-2281。
Rosch，J。W.和Caparon，M。G.（2005）。 ExPortal：专门研究化脓性链球菌中分泌蛋白生物合成的细胞器 >。 Mol Microbiol > 58（4）：959-968。
Saeloh，D.，Tipmanee，V.，Jim，K.K.，Dekker，M.P.，Bitter，W.，Voravuthikunchai，S.P.，Wenzel，M。和Hamoen，L.W。（2018）。新型抗生素rhodomyrtone可捕获囊泡中膜蛋白的流动性增加。 PLoS Pathog > 14（2）：e1006876。
Sanchez，S.A.，Tricerri，M.A.，Gunther，G。和Gratton，E。（2007）。 Laurdan广义极化：从比色皿到显微镜。在：Méndez-Vilas，A。和Díaz，J。（编辑）。显微镜中的现代研究和教育主题。 Formatex >，1007-1014。
Schneider，J.，Klein，T.，Mielich-Suss，B.，Koch，G.，Franke，C.，Kuipers，O.P.，Kovacs，A.T.，Sauer，M。和Lopez，D。（2015）。功能性膜微区的时空重塑可以组织细菌的信号传导网络。 PLoS Genet > 11（4）：e1005140。
Strahl，H。和Hamoen，L。W.（2010）。膜电位对细菌细胞分裂至关重要。 Proc Natl Acad Sci USA > 107（27）：12281-12286。
Strahl，H.，Burmann，F。和Hamoen，L。W.（2014）。肌动蛋白同系物MreB组织细菌细胞膜。 Nat Commun > 5：3442。
Stülke，J.，Hanschke，R。和Hecker，M。（1993）。枯草芽孢杆菌中β-葡聚糖酶合成的时间活化是由GTP池介导的。 J Gen Microbiol > 139（9）：2041-2045。
Te Winkel，J.D.，Gray，D.A.，Seistrup，K.H.，Hamoen，L.W。和Strahl，H。（2016）。使用电压敏感染料分析抗菌剂引发的膜去极化。前细胞Dev Biol > 4:29。
Vega，L。A.，Port，G。C.和Caparon，M。G.（2013）。肽聚糖合成与 Streptococcus pyogenes > ExPortal的组织之间的关联。< / a> MBio > 4（5）：e00485-00413。
Weihs，F.，Wacnik，K.，Turner，R.D.，Culley，S.，Henriques，R。和Foster，S.J。（2018）。金黄色葡萄球菌>中膜蛋白的异质定位。 Sci Rep > 8（1）：3657。
Wenzel，M.，Chiriac，AI，Otto，A.，Zweytick，D.，May，C.，Schumacher，C.，Gust，R.，Albada，HB，Penkova，M.，Kramer，U.，Erdmann， R.，Metzler-Nolte，N.，Straus，SK，Bremer，E.，Becher，D.，Brotz-Oesterhelt，H.，Sahl，HG和Bandow，JE（2014）。小阳离子抗菌肽使外周膜蛋白离域。 Proc Natl Acad Sci USA > 111（14）：E1409-1418。
Wenzel，M.，Patra，M.，Albrecht，D.，Chen，D.Y.，Nicolaou，K.C.，Metzler-Nolte，N。和Bandow，J.E。（2011）。可用于体内>机制的脂肪酸生物合成抑制的蛋白质组学特征 - 反应研究。 Antimicrob Agents Chemother > 55（6）：2590-2596。
Zhao，J.，Wu，J。和Veatch，S.L。（2013）。粘附在生理温度下稳定超临界膜中强大的脂质异质性。 Biophys J > 104（4）：825-834。