材料和试剂

3毫升一次性转移移液器（VWR，目录号：414004-037）
0.2μm无菌注射器过滤器（VWR，目录号：28145-477）
乳胶检查手套（VWR，目录号：414004-429）
实验室外套（VWR，目录号：37000-922）
3个月雌性成年SVJ 129小鼠
3个月成年雌性Sprague Dawley大鼠
PNU-282987（N - [（3R）-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基] -4-氯苯甲酰胺盐酸盐）（Sigma-Aldrich，目录号：P6499）（干燥，储存于4℃）
BrdU（5-溴-2'-脱氧尿苷）（Sigma-Aldrich，目录号：19-160）（在-20°C下储存长达2年）
PBS（磷酸盐缓冲盐水10倍浓缩液）（Sigma-Aldrich，目录号：P5493）（在室温下储存）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）（在室温下储存）
Cheerios（当地杂货店，常温商店）
PNU-282987 / BrdU解决方案（见食谱）

设备

30毫升透明玻璃瓶（VWR，目录号：10862-356）
4°C冰箱＆nbsp;
通风橱

程序

根据研究的实验设计，每天一次从回填的3ml塑料一次性移液管中给动物滴一滴眼药水不同的时间。来自转移移液管的一滴溶液含有30μl稀释的PNU-282987 / BrdU。滴眼液直接输送到眼球结膜中央;覆盖巩膜前表面和角膜透明表面上皮的透明膜。每次施用滴眼液时，使用新的一次性3ml移液管。在滴眼处理3天后，成年大鼠和小鼠的两性都产生BrdU阳性细胞。在载体对照研究中，将含有PBS或含有1％DMSO的PBS的滴眼液作为阴性对照。

给成年小鼠添加滴眼液
注意：
1. 这些啮齿动物的安全束缚和温和处理是实验程序的关键部分。所有啮齿动物处理都在动物设施中穿着实验室外套和乳胶手套。在继续之前，所有处理人员都有机构动物护理和使用委员会培训。＆nbsp;
2. 应充满信心地接近动物，并应轻柔地处理动物，但要坚决避免对处理者造成咬伤或划伤或对动物造成伤害。
3. 单手鼠标约束通常用非惯用手进行，让优势手可以自由使用眼药水。
1. 将成年小鼠（3-6个月）从尾巴的尾部抬起，放在笼盖上。将尾巴的基部塞在3 rd 和4 th 指之间（图2A）。
2. 然后通过在颈部涂抹皮肤来固定成年小鼠（3-6个月）。使用握住尾巴的同一只手，用食指和拇指抓住头部底部附近的皮肤（图2B）。
  注意：确保对颈部周围的皮肤施加足够的压力或紧致度，以确保眼睛被打开并防止鼠标转动或扭曲出手柄。
3. 将鼠标牢固地涂抹后，将一滴稀释的PNU-282987 / BrdU溶液置于右眼球结膜上。右眼应该通过扭转限制器手的手腕来定位。稀释液应该滴在眼睛上方。不要将移液管直接接触角膜。下落将覆盖整个眼睛，并应作为一个小球坐在眼睛上方1-2秒（图2C）。
  注意：如果需要对动物的对侧眼进行治疗，应该转动含有相同硬化动物的限制器手腕，使左眼朝上。此时，可以在左眼上添加另一个单一滴，并允许在眼睛上方放置一个小球，持续1-2秒。
4. 一旦治疗了眼睛，将动物放回笼子里。动物一旦释放就会摇头，以清除残留在眼睛上方的多余液体，这种情况并不少见（见注释）。
  
  图2.对成年小鼠施用滴眼液。 A.将3个月大的雌性成年SVJ 129小鼠从笼中取出并放置处理。 B.保持小鼠用于滴眼剂递送。 C.滴眼液适用于粗糙的动物。比例尺代表1.25厘米。
给成年大鼠添加滴眼液
1. 为没有身体束缚的老鼠（3-6个月）提供滴眼液。取出鼠笼顶部，用一次性3ml回填移液管将含有PNU-282987稀释液和BrdU的滴眼液加入大鼠眼中心（图3A）。将滴管置于眼睛的一英寸范围内，然后将含有30μl稀释的PNU-282987 / BrdU的一滴液体释放到球结膜上。成功应用滴眼液后，大鼠会眨眼并摇头。不要让移液管与角膜直接接触。＆nbsp;
2. 当添加一滴时，根据研究的实验设计，也可以将滴剂添加到对侧眼睛中。＆nbsp;
3. 在施用所有滴剂后，在更换笼子顶部之前给每只大鼠2-3只Cheerios（例如图3B中的实施例），然后将含有处理过的动物的笼子放回到菌落中。所有动物都单独饲养。
  
  图3.对成年大鼠施用滴眼液 A.将3个月大的成年雌性Sprague Dawley大鼠定位以接受一滴PNU-282987 / BrdU溶液。 B. Cheerio奖励是在成功提供眼药水后提供的。比例尺代表2.5厘米。

笔记

第一次将滴眼液递送到老鼠眼睛时，动物将不熟悉该过程并且可能不够长，以使滴眼液沉积到角膜中心（需要1-2秒）。为了最大限度地减少这种行为，应将含有滴眼液的移液管定位并保持在笼子上方，直到动物沉降。动物第一次安静降落的时间根据每只动物的个性而变化。然而，第一次，在动物使用戴手套的手拿着移液管并且保持足够长以沉积滴眼液之前，可能需要平均2或3分钟。然而，在给大鼠加入两到三次滴剂后，一旦笼子顶部被移除，大鼠就会停止移动，因为他们熟悉了这个程序，并且知道他们将在完成后获得Cheerio奖励。未来的研究可能会受益于大鼠的训练期，以提高获得滴眼液的耐受性。
使用BrdU护理：
BrdU在DNA复制过程中取代胸苷，可导致DNA突变。因此，应采取适当的预防措施以避免暴露。孕妇和哺乳期妇女应避免接触BrdU和已服用BrdU滴眼液的动物。由于BrdU暴露会损害免疫系统;免疫功能低下的人在处理BrdU时也应格外小心。
当向动物添加滴眼液时，当动物摇头时，少量溶液可能落入动物的床上。在动物的正常护理期间，应定期将这种床上用品移除并由动物设施工作人员进行高压灭菌，该工作人员戴着手套和实验室外套。任何意外泄漏的PNU-282987 / BrdU都应使用危险的泄漏工具包进行处理。

交叉：
在一些情况下，仅用PNU / BrdU溶液处理一只大鼠眼，而对侧眼作为未处理对照。在这些条件下，没有交叉效应的证据。在对照未治疗的眼睛中没有出现BrdU染色（Webster et al。，2017）。然而，在成年小鼠中并非如此。当用PNU / BrdU溶液处理一只小鼠眼并且对侧眼未经治疗时，发生交叉效应。例如，在成年小鼠中，即使只有一只眼睛用PNU / BrdU溶液治疗，两只眼睛通常都表现出BrdU阳性细胞。这种在小鼠中的交叉效应可能是由于两只眼睛的相对接近。因此，对侧眼可用作成年大鼠的内部对照，但不应在成年小鼠中用作未经处理的内部对照。

食谱

PNU-282987 / BrdU解决方案
注意：
1. 在准备PNU-282987和BrdU原液时，会戴上乳胶手套和实验服。
2. 未使用的PNU-282987 / BrdU在危险品容器中处理。
1. 准备10 mM PNU-282987原液
  使用二甲基亚砜（DMSO）制备10mM PNU-282987的储备溶液。储备溶液在4°C下保存长达3个月
2. 准备BrdU库存解决方案
  请说明如何准备BrdU库存解决方案。
3. 需要时，使用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）将PNU-282987原液稀释至1到1,000 nM的各种浓度，用于滴眼研究
4. 然后将BrdU直接加入到稀释的PNU-282987溶液中，使最终的BrdU浓度为1mg / ml。
5. 最终的PNU-282987 / BrdU溶液用0.2μm注射器过滤器进行无菌过滤，然后在通风橱下使用。＆nbsp;
6. 将PNU-282987 / BrdU的稀释液保存在4℃的冰箱中，在标记的30ml玻璃瓶中保存长达一周。

致谢

该程序的资金由NIH NEI＃EY022795和EY027970提供给C. Linn博士。
以前的研究包括Webster et al。（2017）已经使用了这种滴眼剂方案。

利益争夺

没有利益冲突。

伦理

将大鼠和小鼠保存在西密歇根大学的动物设施中直至需要，并根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准指南进行护理。

参考

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