材料和试剂

刻度量筒（Nalgene; Fisher，目录号：02-540-270）
塑料烧杯（Nalgene; Fisher，目录号：02-591-10H）
15毫升Falcon管（Fisher，目录号：14-959-70C）
15 ml细菌培养试管（Fisher，目录号：14-956-9C）
1.5 ml微量离心管（Fisher，目录号：05-408-129）
称重船（Fisher，目录号：08-732-112）
移液器吸头（Fisher，目录号：02-707-401,02-707-415和02-707-436）
血清移液管（Fisher，目录号：13-676-10J和13-676-10K）
35毫米培养皿（实验室科学，目录号：9333-35NV）
100毫米培养皿（Fisher，目录号：FB0875712）
Rubbermaid塑料容器（亚马逊，目录号：B00YQAGNGK）
铝箔（任何家庭用品）
空1毫米凝胶盒（Thermo Fisher，目录号：NC2010）
剃刀刀片（Fisher，目录号：18-100-970）
显微镜载玻片（Fisher，目录号：12-518-100B）
显微镜载玻片盖玻片（Fisher，目录号：12-541B）
℃。线虫菌株;对于野生型，使用Bristol N2（ Caenorhabditis 遗传中心）
电子。大肠杆菌 OP50菌株（ Caenorhabditis 遗传中心）
氯化钠，NaCl（Fisher，目录号：S271-10）
蛋白胨（Fisher，目录号：BP1420-500）
琼脂（Fisher，目录号：BP1423-500）
氯化钙二水合物，CaCl 2 •2H 2 O（Fisher，目录号：C79-500）
胆固醇（阿法埃莎，目录号：A11470-18）＆nbsp;
乙醇（Fisher，目录号：BP2818-500）
硫酸镁，MgSO 4 （Alfa Aesar，目录号：33337-36）
磷酸二氢钾，KH 2 PO 4 （Fisher，目录号：P285-500）
磷酸氢二钾，K 2 HPO 4 （Fisher，目录号：P288-500）
氢氧化钠，NaOH（Fisher，目录号：S318-1）
家用漂白剂（Chlorox）
LB Broth，Miller（Fisher，目录号：BP1426-2）
琼脂糖（Fisher，目录号：BP1356-100）
盐酸左旋咪唑（Acros Organics，目录号：187870100）
羧苄青霉素（Fisher，目录号：BP2648-1）
IPTG（Fisher，目录号：BP1755-10）
染料
注意：以下染料已经过测试和验证，可以使用此协议，但其他染料也可能适用。
1. LysoTracker Red DND-99（Life Technologies，目录号：L7528）＆nbsp;
2. MitoTracker Deep Red FM（Life Technologies，产品目录号：M22426）
3. DiOC6（3）（Life Technologies，目录号：D273）
1 M CaCl 2 （见食谱）
5毫克/毫升胆固醇（见食谱）
1 M MgSO 4 （见食谱）
1 M KPO 4 pH 6.0（参见食谱）
100毫克/毫升羧苄青霉素（见食谱）
1 M IPTG（见食谱）
NG琼脂（见食谱）
染料储备液（见食谱）
LB培养基（见食谱）
蠕虫漂白解决方案（见食谱）
琼脂糖垫（见食谱）
左旋咪唑溶液（见食谱）

设备

注意：此协议需要以下类型的设备。虽然确切的模型并非绝对必要，但我已经包含了我实验室和我使用过的具体单元的信息。

玻璃烧瓶（Kimble; Fisher，目录号：02-543-21）
玻璃烧杯（Kimble; Fisher，目录号：02-555-2）
玻璃瓶（Pyrex; Fisher，目录号：06-414-1B，06-414-1C和06-414-1D）
搅拌棒（Fisher，目录号：14-513-82）
Pipets（Gilson; Fisher，目录号：F167900G）
电动移液控制器（Fisher，目录号：FB14955202）
微波炉（任何家庭用品）
高压灭菌器（Steris，型号：AMSCO 3000系列）
电炉搅拌器（Thermo Fisher，目录号：88880004）＆nbsp;
振荡器（Amerex Instruments，GYROMAX，型号：737R）
台式离心机（Eppendorf，型号：5804R）
Vortex（Thermo Fisher，目录号：88880017TS）
引擎罩
管左轮手枪（Thermo Fisher，目录号：88881001）
细菌培养箱（Fisher，目录号：15-103-0518）
蠕虫培养箱（Thermo Fisher，目录号：PR205745R）
共聚焦显微镜
我们使用各种显微镜系统对染色的蠕虫进行成像。原则上，任何具有适合所选染料的过滤器组的共聚焦系统都是合适的。我建议使用40倍物镜对各个种子进行成像。我实验室和我使用的显微镜系统的例子包括：
1. 徕卡，型号：TCS SP8，带白光激光
2. 尼康，型号：CSU系列＆nbsp;

软件

成像软件
这取决于所使用的显微镜系统。例如，Leica TCS SP8配备了LAS X软件（ https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/details/product/leica-las-x-ls/ ），而尼康共焦显微镜有NIS Elements软件（ https://www.nikoninstruments.com/Products/Software ）。与显微镜系统一样，许多不同类型的成像软件原则上都与此协议兼容。＆nbsp;
ImageJ
ImageJ可用于图像分析（NIH; https://imagej.nih.gov/ij/ ）。

程序

按照标准配方在烧瓶中制备25ml的NG琼脂（见下文）（Stiernagle，2006）。包括一个搅拌棒。
使用设定在121°C和15 psi压力下的液体循环至少30分钟的高压灭菌NG琼脂。＆nbsp;
冷却NG琼脂。从无菌原料中加入高压釜后成分（参见下面的食谱）并在热板上搅拌（图1A）。＆nbsp;
将所有成分混合后，加入染料。已经验证测试染料的最终浓度为2μM。不同浓度可能适用于其他染料;在尝试新染料时，最好将各种染料浓度的测试板与染色效率进行比较。使用较少的染料允许更多的板由相同的起始染料量制成，这是成本有效的。然而，较低的染料浓度也导致较弱的染色，因此必须评估每种染料的权衡。
将染料加入培养基后，在热板上搅拌直至染料均匀分布（图1B）。＆nbsp;
将5ml染色的培养基吸移到35mm培养皿中。你总共可以制作5个盘子（图1C）。

图1.用于活体染色的NG琼脂平板的生产 C.线虫。 A.高压灭菌后但在加入LysoTracker Red DND-99之前的NG培养基。 B.添加LysoTracker Red DND-99后的NG培养基。注意粉红色。 C. 35毫米培养皿，每个培养皿含有5毫升含LysoTracker的NG琼脂。
将板放入带有箔的容器中并在室温下干燥至少2天。如果需要更快的盘子，可以在引擎盖中干燥（关灯）。
划掉 E。大肠杆菌 OP50到不含抗生素的LB琼脂平板上。连续到单个菌落以确保纯度是很重要的。在37°C下生长过夜。
第二天，检查LB琼脂平板上的OP50菌落和可能的污染物。如果OP50菌落，但没有污染物生长，则挑选单个OP50菌落并接种5ml LB液体培养物。在37℃下振荡孵育过夜。
过夜生长将产生饱和的OP50培养物（~10 8 -10 9 CPU / ml）。将500μl饱和的OP50培养物转移到微量离心管中，并加入先前添加到NG琼脂平板中的相同染料（图2A）。使用与以前相同的染料终浓度。
将100μl染色的OP50培养物等分到染色的NG琼脂平板的中心（图2B）。将板置于室温下的箔状容器中至少2天。细菌会形成草坪。板材可以在室温下保存在有盖容器中长达1周，只要它们不会变干和破裂就适合使用。

图2.染色细菌的制备。 A. OP50等分试样（+）或不含（ - ）LysoTracker Red DND-99。 B.两个LysoTracker板在中心点有100μlOP50。
对于最强大的染色，将蠕虫转移到细菌草坪，如卵或L1幼虫。 ℃。线虫鸡蛋可以通过漂白分离。对于漂白，应收集妊娠成虫。用M9缓冲液冲洗平板以收集蠕虫，并将蠕虫转移到15ml Falcon管中。在200 x g 下离心30秒以沉淀蠕虫。取出M9缓冲液，加入5毫升新鲜的蠕虫漂白液。涡旋5分钟以溶解动物并释放卵。加入5ml M9缓冲液并倒置管混合。将释放的卵在200 x g 下沉淀30秒，并用5ml M9缓冲液洗涤卵三次。将蛋直接打蛋，或将蛋在M9缓冲液中过夜，以使蠕虫在接种前发育成L1幼虫。这两种方法都适用于此应用。每板引入约50个卵/动物;如果包括更多的蠕虫，细菌食物来源可能会在蠕虫到达成年之前耗尽。
将带有蜗板的带箔的容器放入适当的培养箱中。对于标准染色，在20℃温育是合适的。当还需要表达种系转基因时，在25°C温育以防止种系沉默（Merritt et al。，2010）。允许蠕虫发育成年轻成年人（从胚胎阶段开始，这将需要大约3天，取决于孵化温度）。
制作1毫米厚的4％琼脂糖垫，可用于安装蠕虫用于显微镜检查。首先，将空的1毫米凝胶盒的两半分开。然后，在玻璃烧杯或烧瓶中将1g琼脂糖在25ml H 2 H 2中熔化。在琼脂糖凝固之前，将琼脂糖倒在其中一个盒半部的平坦内表面上，并用另一半盒半压下琼脂糖至1mm厚。一旦琼脂糖凝固，将盒子的两半分开; 1毫米厚的琼脂糖片应粘在盒子的一半上。用剃须刀将琼脂糖切成小方垫。＆nbsp;
将琼脂糖垫放在显微镜载玻片上，加入一滴2mM左旋咪唑（用于固定蠕虫的麻痹剂）。将年轻成人蠕虫转移到左旋咪唑滴，并将盖玻片放在上面。＆nbsp;
将载玻片固定在共聚焦显微镜的载物台上。使用适当的滤光片组对感兴趣的荧光团成像（图3）。

图3. C中溶酶体的染色实例。线虫种系。性腺手臂呈红色轮廓，胚胎呈橙色轮廓。当它们接近精子（sp）时，LysoTracker阳性斑点在成熟的卵母细胞中发育。注意其他组织也被染色。比例尺=10μm。

数据分析

在图像采集时可以观察到种系中的染色模式（图3）。可以使用ImageJ量化荧光强度。通常，应进行三次独立的重复以进行定量。可以使用未配对的 t - 测试进行实验组之间的染色模式/强度的统计分析，其显着性定义为 P < 0.05。关于不同类型实验的数据分析和原始数据的详细信息可以在原始研究文章（Bohnert和Kenyon，2017）中找到，该文章可在PubMed Central免费获得（PMCID：PMC5936623）。

笔记

值得注意的是，种系以外的组织也会被染色（图3）。因为蠕虫正在喂养染料，所以当聚焦时，肠道会发出明亮的荧光。当种系的近端和远端区域位于同一z平面并位于肠道顶部时，最容易在活体动物中成像完整的性腺臂。
＆NBSP;该染色方法可用于标记用RNAi处理的动物的种系。在这种情况下，需要将染料添加到RNAi平板（补充有100μg/ ml羧苄青霉素和1mM IPTG的NG琼脂）和相关的细菌菌株（即，表达RNAi克隆的那些）。当在发育晚期或成年期需要基因敲低时，应首先在含有染料的正常NG平板上培养蠕虫，然后在适当的阶段移至染色的RNAi平板。

食谱

1 M CaCl 2
在1LH 2 O中溶解147.0g CaCl 2 •2H 2 O，并使用设定在121℃和15psi的液体循环进行高压釜压力至少30分钟
5毫克/毫升胆固醇
将0.25克胆固醇溶于50毫升200毫升乙醇中，过滤灭菌
1 M MgSO 4
将120.4g MgSO 4 溶解在1L H 2 O中，并使用设定在121℃和15psi压力下的液体循环至少30分钟的高压釜
1 M KPO 4 pH 6.0
在1LH 2中溶解108.3g KH 2 PO 4 和35.6g K 2 HPO 4 / sub> O，并使用设定在121℃和15psi压力下的液体循环至少30分钟的高压釜
100毫克/毫升羧苄青霉素
将1g羧苄青霉素溶于10ml H 2 O中，并过滤灭菌
1 M IPTG
将2.38g IPTG溶于10ml H 2 O中，并过滤灭菌
NG琼脂
1. 在25毫升H 2 O中混合75毫克NaCl，62.5毫克蛋白胨和425毫克琼脂
2. 使用设定在121℃和15psi压力下的液体循环至少30分钟的高压釜
3. 在室温下冷却，直到可以舒适地触摸烧瓶
4. 加入25μl1M CaCl 2 ，25μl5mg / ml胆固醇，25μl1M MgSO 4 和625μl1M KPO 4 pH 6.0
5. 然后，继续添加所需的染料
对于RNAi平板，高压灭菌后还要加入25μl100mg / ml羧苄青霉素和25μl1M IPTG。
染料库存解决方案
在DMSO（或其他推荐的溶剂）中制备每种染料的1mM储备溶液。
注意：
1. 这些储备溶液可以1：500的比例使用，最终浓度为2μM。如程序中所述，不同浓度可能适用于尚未验证的其他染料。
2. 应尽可能保护库存（例如，管子可以用铝箔包裹并保存在盒子内）。推荐的液体原料储存温度为-20°C。
LB媒体
1. 将25g LB肉汤（Miller）溶解在1L H 2 O中，并使用设定在121℃和15psi压力下的液体循环至少30分钟进行高压灭菌。
2. 为了制备LB琼脂，在高压灭菌前每400ml LB加入8g琼脂
3. 可以将LB琼脂倒入100-mm培养皿中
蠕虫漂白解决方案
混合3.5 ml H 2 O，1 ml家用漂白剂和0.5 ml 5 N NaOH（Stiernagle，2006）
制备5N NaOH：将10g NaOH溶于50ml H 2 sub 2 / O中
琼脂糖垫
1. 在烧杯中加入1g琼脂糖至25ml H 2 O.
2. 微波溶解琼脂糖
3. 将琼脂糖倒入旧蛋白质凝胶盒的干净内表面，并使用盒式磁带的另一半压缩至约1 mm厚度
4. 使用剃刀切割大约1.25 cm x 1.25 cm的琼脂糖正方形（垫的确切尺寸和几何形状不是严格要求）
左旋咪唑溶液
1. 通过将0.24 g左旋咪唑盐酸盐溶解在1 ml H 2 O中制备1M的储备溶液
2. 在H 2 O中稀释1：500以制备2mM工作溶液

致谢

这项完整协议所依据的研究（Bohnert和Kenyon，2017）最初是在加州大学旧金山分校和Calico Life Sciences的Cynthia Kenyon实验室进行的。我感谢Cynthia的指导，慷慨和创造性的洞察力，以及Kenyon实验室的成员在设计这些实验时提供了有用的评论。我还要感谢Maria Ingaramo和Andy York分享显微镜建议和专业知识。在Kenyon实验室，我是Jane Coffin Childs纪念基金的荣誉院士。我现在是路易斯安那州立大学的助理教授。我感谢我现在的实验室成员和Alyssa Johnson对该协议的发人深省的讨论和意见。

利益争夺

我宣布没有利益冲突或利益冲突。

参考

Bohnert，K。A.和Kenyon，C。（2017）。溶酶体开关触发永生 C中的蛋白质稳定性更新。线虫胚芽谱系。自然 551（7682）：629-633。
Hermann，G.J.，Schroeder，L.K.，Hieb，C.A.，Kershner，A.M.，Rabbitts，B.M.，Fonarev，P.，Grant，B.D。和Priess，J.R。（2005）。 Caenorhabditis elegans的溶酶体运输的遗传分析。 em> Mol Biol Cell 16（7）：3273-3288。
Klass，M.R。（1977）。线虫老化 Caenorhabditis elegans ：影响生命的主要生物和环境因素跨度。 Mech Aging Dev 6（6）：413-429。
Merritt，C.，Gallo，C.M.，Rasoloson，D。和Seydoux，G。（2010）。种系的转基因解决方案。 WormBook
Page，A。和Johnstone，I。L.（2007）。角质层。 WormBook
Schaheen，L.，Dang，H。和Fares，H。（2006）。 C中杀伤力的基础。线虫缺乏CUP-5，即嗜血杆菌病IV型直系同源症。 Dev Biol 293（2）：382-391。
Stiernagle，T。（2006）。 C的维护。线虫。 WormBook