第一部分：通过PAGE提取和分析磷壁酸

材料和试剂

用于PAGE的粗壁磷壁酸（WTA）萃取

移液器吸头
50 ml离心管（Fisher Scientific，目录号：14-955-240）
接种循环（VWR，目录号：12000-810）
2 ml微量离心管（VWR，目录号：87003-298）
1.7毫升微量离心管（VWR，目录号：87003-294）
Staphylococcus aureus 或其他革兰氏阳性菌（约100μl湿细胞沉淀）
MilliQ dH 2 O.
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）（BD，目录号：211822）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（Fisher Bioreagents，目录号：BP300-100）
十二烷基硫酸钠（SDS）（BP，目录号：166-500）
氯化钠（NaCl）（Sigma，目录号：S5886）
Tris（Fisher Bioreagents，目录号：BP152-5）
蛋白酶K（Amresco，目录号：0706-100mg）
氢氧化钠（NaOH）（EMD Millipore，目录号：1064621000）＆nbsp;
盐酸（HCl）（Sigma，目录号：258148-500ML）
三氯乙酸（TCA）（BDH，目录号：BDH9310-500G）
缓冲液1（50 mM MES，pH 6.5）（参见食谱）
缓冲液2（4％[wt / vol] SDS，50 mM MES，pH 6.5）（参见配方）
缓冲液3（2％NaCl，50 mM MES，pH 6.5）（参见配方）
消化缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0,0.5％[w / v] SDS）（参见食谱）
蛋白酶K溶液（2 mg / ml）（见食谱）

用于PAGE的粗脂磷壁酸（LTA）提取

移液器吸头
50 ml离心管（Fisher Scientific，目录号：14-955-240）
接种循环（VWR，目录号：12000-810）
2 ml微量离心管（VWR，目录号：87003-298）
1.7毫升微量离心管（VWR，目录号：87003-294）
PCR管（VWR，目录号：20170-004）
pH条（EMD Millipore，目录号：700181-2）
Staphylococcus aureus 或其他革兰氏阳性菌（约100μl湿细胞沉淀）
MilliQ dH 2 O.
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）（BD，目录号：211822）
柠檬酸一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C7129）
氢氧化钠（NaOH）（默克密理博中国，目录号：1064621000）
氧化锆/二氧化硅珠（0.1 mm; Biospec Products，目录号：11079101z）
1-丁醇（Thermo Scientific，目录号：A399）
Tris（Fisher Bioreagents，目录号：BP152-5）
Resinase HT（Strem Chemicals，目录号：06-3125）
20倍柠檬酸盐缓冲液（见食谱）
重悬浮缓冲液（见食谱）

磷壁酸PAGE和染色

移液器吸头
凝胶加载技巧（VWR，目录号：53509-015）
50 ml离心管（Fisher Scientific，目录号：14-955-240）
14毫升管（康宁，目录号：352057）
用于染色的大玻璃皿（耐热玻璃，目录号：1085782）
MilliQ dH 2 O.
Tris（Fisher Bioreagents，目录号：BP152-5）
盐酸（HCl）（Sigma，目录号：258148-500ML）
40％丙烯酰胺溶液（Fisher Bioreagents，目录号：BP1402-1）
双丙烯酰胺（默克密理博中国，目录号：8059680250）
Tricine（Fisher Bioreagents，目录号：BP315-100）
TEMED（Fisher BioReagents，目录号：BP150-20）
过硫酸铵（APS）（Fisher BioReagents，目录号：BP179-25）
70％乙醇（Fisher BioReagents，目录号：BP8201500）
甘油（Fisher Bioreagents，目录号：BP229-4）
溴酚蓝（Sigma，目录号：114391-5G）
阿尔新蓝8GX（阿法埃莎，目录号：J60122）
冰醋酸（EMD，目录号：AX0073-9）
重铬酸钾（JT Baker，目录号：3090-01）
硝酸（Amresco，目录号：0697-100ML）
硝酸银（Fisher Bioreagents，目录号：BP2546-100）
碳酸钠（VWR，目录号：0585-500G）
甲醛，37％（西格玛，目录号：F1635-500ml）
凝胶缓冲液（见食谱）
10％过硫酸铵（APS）（见食谱）
10x Tris-Tricine缓冲液（见食谱）
运行缓冲区（参见食谱）
解决丙烯酰胺溶液（30％T，6％C）（见食谱）
堆积丙烯酰胺溶液（30％T，2.6％C）（见食谱）
4x上样染料（见食谱）
阿辛蓝溶液（1毫克/毫升，3％醋酸）（见食谱）
氧化溶液（见食谱）
硝酸银溶液（见食谱）
开发人员（见食谱）
醋酸，0.1 M（见食谱）

设备

用于PAGE的粗壁磷壁酸（WTA）萃取

摇动培养箱（Thermo Scientific，目录号：SHKE6000）
台式离心机（Eppendorf，目录号：022621807）
微量移液器
热板（VWR，目录号：97042-698）
烧杯
Thermomixer（Eppendorf，目录号：022670107）

用于PAGE的粗脂磷壁酸（LTA）提取

摇动培养箱（Thermo Scientific，目录号：SHKE6000）
离心机（Eppendorf，目录号022623508）
转子（Eppendorf，目录号：022638009）
台式离心机（Eppendorf，目录号：022621807）
微量移液器
MagNA Lyser（罗氏，产品目录号：03358968001）
Thermomixer（Eppendorf，目录号：022670107）
热循环仪（Bio-Rad，目录号：1861096）

磷壁酸PAGE和染色

蛋白质® II xi 2-D管凝胶细胞（Bio-Rad，目录号：1651931）
烧杯
搅拌板（VWR，目录号：97042-590）
搅拌棒
移液器控制器（BrandTech Scientific，目录号：26330）
微量移液器
Shaker（Alkali Scientific，目录号：RS7061）

程序

用于PAGE的粗壁磷壁酸（WTA）萃取

将20毫升TSB转移到50毫升离心管中，如有必要，加入所需的抗生素进行选择。
使用无菌接种环，从单个金黄色葡萄球菌菌落接种培养基。
将细菌培养物在37℃下孵育16-20小时，同时以250rpm振荡。
加热热板，在烧杯中煮沸800毫升水。
注意：获得滚动沸腾以确保彻底破碎细胞至关重要。
将细胞培养物在5,000 x g 下离心5分钟。
将细胞沉淀重悬于30ml缓冲液1中。
以5,000 x g 离心细胞5分钟。
将细胞沉淀重悬于30ml缓冲液2中。
将含有细胞再悬浮液的离心管放入沸水浴中1小时。
从沸水浴中取出离心管，让其在室温下冷却30分钟或直至冷却接触。
注意：不要在冰上冷却，因为SDS会沉淀。
在5,000 x g 下离心5分钟。
重悬于1 ml缓冲液1中，转移至2 ml微量离心管中。
注意：使用含SDS的缓冲液1进行额外清洗对于去除LTA和其他污染脂质至关重要。
在16,000 x g 离心1分钟。
重悬于2ml缓冲液2中并如步骤13中那样离心。
重悬于2ml缓冲液3中并如步骤13中那样离心。
重悬于2ml缓冲液1中并如步骤13中那样离心。
重悬于1毫升消化缓冲液中。
加入10μl2mg / ml蛋白酶K溶液（20μg）
在振荡加热块上在50℃下以1,400rpm孵育4小时。
在16,000 x g 离心1分钟。
重悬于2ml缓冲液3中并如步骤20中那样离心。
重悬于2ml dH 2 O中并如步骤20中那样离心。
重复dH 2 O洗涤总共3次洗涤以除去SDS。
用1ml 0.1M NaOH彻底重悬。参见备选TCA水解的注释。
在室温下以1,400转/分钟在恒温混匀器上孵育16小时。
在16,000 x g 离心1分钟。
将上清液转移到新的1.7ml微量离心管中。
加入250μl1MTris-HCl，pH 7.8中和。
储存在-20°C或进行TA-PAGE。

粗脂磷壁酸（LTA）提取PAGE

将20毫升TSB转移到50毫升离心管中，如有必要，加入所需的抗生素进行选择。
使用无菌接种环，从单个金黄色葡萄球菌菌落接种培养基。
将细菌培养物在37℃下孵育16-20小时，同时以250rpm振荡。
以5,000 x g 离心细胞5分钟。
将细胞沉淀重悬于2ml重悬浮缓冲液中。
将细胞悬浮液转移到2ml螺旋盖微量离心管中。
将细胞在16,000 x g 离心1分钟并弃去上清液。
加入~700μl氧化锆/二氧化硅珠。
用重悬浮缓冲液填充管以最小化顶部空间。
将样品在冰上冷却5分钟。
用MagNA-lyser裂解细胞
1. 以7,000 rpm运行30秒。
2. 在冰上冷却5分钟。
3. 再重复3次。
将细胞膜在20,000 x g ，4℃下沉淀1小时。
将细胞膜悬浮在350μl重悬浮缓冲液中。
注意：颗粒难以重悬，因此尽可能用吸管尖端和移液管混合物进行废弃。在重新悬浮之前将颗粒冷冻在-20°C可能会有所帮助。
加入350μl1-丁醇。
在37℃下以1,400rpm摇动加热块45分钟孵育。
在20,000 x g ，4℃下离心45分钟以沉淀不溶性碎片并进行相分离。
将下层水层萃取到1.7 ml微量离心管中。
注意：如果仍有细胞碎片，则以20,000 x g离心，4°C离心20 min，并将上清液提取到另一个1.7 ml微量离心管中。
在PCR管中，设置脂肪酶反应以水解LTA脂质
1. 50μl粗LTA提取物
2. 50μl50mMTris游离碱
3. 2μl1MNaOH
充分混合，用pH条确保pH值约为pH8.5。
加入1μlResinaseHT并混合。
在热循环仪中于50°C孵育16-18小时。
储存在-20°C或进行TA-PAGE。

磷壁酸PAGE和染色

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

用dH 2 O填充凝胶冷却芯并在4℃下冷却。
在4°C下冷却运行缓冲液。
组装凝胶玻璃板。
将溶解凝胶（20％T，6％C终浓度）放入50 ml管中。
1. 13.3毫升凝胶缓冲液（3M Tris-HCl，pH 8.5）
2. 26.67毫升拆分丙烯酰胺溶液（30％T，6％C）
3. 400μl10％APS
4. 40μlTEMED
在凝胶板之间吸取35毫升，留下足够的空间用于堆积凝胶。
用70％乙醇对表面进行分层。
注意：最好将梳子插入此处以正确放置玻璃板。
让凝胶凝固至少30分钟。
倒出乙醇并用dH 2 O冲洗。
用纸巾擦去多余的水。
将堆积凝胶（3％T，2.6％C）放入15 ml管中
1. 2毫升MilliQ dH 2 O.
2. 1毫升凝胶缓冲液（3 M Tris-HCl，pH 8.5）
3. 333μl堆积丙烯酰胺溶液
4. 33μl10％APS
5. 3.3μlTEMED
用堆积凝胶填充顶部空间并小心地插入梳子，同时用纸巾擦去凝胶溢出物。
让凝胶凝固。
如有必要，轻轻取下凝胶梳并用凝胶加载尖端拉直孔。
通过首先润湿垫圈并将凝胶锁定在适当位置来组装凝胶装置。
用运行缓冲液填充顶部腔室。
注意：确保没有泄漏。如果泄漏，请取下凝胶并重新组装设备。
将剩余的运行缓冲液倒入凝胶罐中。
在加载孔之前，通过将运行缓冲液移液到孔中，用1,000μl移液管冲洗孔。
将15μl每种样品与5μl4x上样染料混合。
每孔加入15μl样品。
以每个凝胶40mA，4℃运行20-22小时，同时在凝胶罐中持续搅拌缓冲液。

阿尔新蓝银染色

的

小心地拆卸玻璃板并取下堆积凝胶。
用一些MilliQ dH 2 O填充大的Pyrex培养皿并小心地将分离的凝胶转移到培养皿中。
轻轻搅拌洗涤凝胶。
倒水。
用MilliQ dH 2 O将凝胶短暂洗涤两次。
在阿尔新蓝溶液中轻轻搅拌凝胶至少3小时或在摇床上搅拌过夜。
倒出染料溶液。
用MilliQ dH 2 O短暂洗涤凝胶5次。
将MilliQ dH 2 O中的凝胶停留数小时，换水几小时或摇动过夜，直至染料前沿不再可见。
倒水。
将凝胶浸泡在氧化溶液中，轻轻搅拌7分钟。
用MilliQ dH 2 O洗涤5次。
将凝胶浸泡在12 mM硝酸银溶液中，在明亮的光照下轻轻搅拌24分钟。
注意：层流罩中的照明就足够了。
用MilliQ dH 2 O快速洗涤5次。
用3种简单的显影剂处理开发凝胶
1. 短暂洗涤，直到溶液变成棕色并倾倒。
2. 第二次重复洗涤。
3. 将凝胶浸泡在显影剂中并轻轻搅拌直至条带增强。让条带充分发展，但在背景变暗之前倾析溶液。见图1。
立即用0.1M乙酸淹没凝胶以停止显影过程并使其在乙酸中静置至少15分钟。
在成像之前，倾析乙酸并将凝胶储存在dH 2 O中。
使用凝胶成像仪或相机对凝胶成像。

图1. TA-PAGE的样本结果。（左） S.金黄色葡萄球菌 WTA通常是糖基化的。敲除多余的WTA糖基化基因 tarM 和 tarS 导致较低分子量的WTA。（右）野生型 S.金黄色葡萄球菌 LTA具有非常低的糖基化水平。 LTA糖基化途径的过度表达不均匀地改变LTA，导致单带分辨率的丧失。凝胶图像改编自Kho和Meredith（2018）的公开图。

笔记

用于PAGE的粗壁磷壁酸（WTA）萃取

如有必要，可以在4 ml的1 ml 5％TCA中进行WTA水解45 h，然后用36.5μl10M NaOH和100μl1M Tris-HCl中和，pH 7.8。虽然这可能会产生略微“更清洁”的WTA，但D-丙氨酸修饰可能保持完整并影响PAGE分辨率。
对于特定的目标菌株，可能必须针对特定的目标菌株调整WTA水解与酸或碱的温育期，以使TA链水解最小化（在TA-PAGE中看作是时间依赖性的快速迁移条带），同时保持可接受的WTA产率。
如果冻干，该方案应产生至少0.5μg的粗WTA。

用于PAGE的粗脂磷壁酸（LTA）提取

可以使用10OD / ml的指数生长细胞。
应避免酶解（使用溶菌酶/溶葡萄球菌素/变溶菌素）以最大限度地减少LTA交叉污染（通过TA-PAGE观察更快的迁移物质）。
虽然珠粒打浆不是绝对必要的，但LTA的产量会因先前的机械破坏而增强。
如果您无法使用冷冻微量离心机，那么常规离心机就足够了。
通过将细胞膜悬浮于200μl含有200μl1-丁醇的重悬浮缓冲液中，可以实现更浓缩的LTA制剂。
重要的是脂肪酶反应在pH8.5下进行以促进碱催化的LTA上D-ala修饰的水解，这可以通过增加LTA同质性来改善PAGE上的单谱分辨率。
基于与纯化的LTA的PAGE比较，该方案应产生至少50μg的粗LTA。

磷壁酸PAGE和染色

分离的丙烯酰胺溶液（30％T，6％C）中的双丙烯酰胺可在长期储存期间沉淀，并且可能在使用前需要混合。
应将Alcian blue 8GX溶于含有3％乙酸的MilliQ dH 2 O中以保持染料溶解度。高纯度dH 2 O应与所有Alcian蓝8GX溶液一起使用。
如果样品浓缩，单独的阿尔新蓝染色可能足以使TA条带可视化。
染色和洗涤时，边缘轻轻地处理凝胶。任何压痕/印刷品都会被银染，并可能使乐队模糊不清。

食谱

用于PAGE的粗壁磷壁酸（WTA）萃取

缓冲液1（50mM MES，pH6.5）
1. 称取2.665克MES（213.2克/摩尔）
2. 溶于175ml MilliQ dH 2 O.
3. 用NaOH调节pH至6.5
4. 顶部用MilliQ dH 2 O至250 ml
5. 在室温下储存
缓冲液2（4％[wt / vol] SDS，50mM MES，pH6.5）
将4克SDS溶于100毫升缓冲液1中在室温下储存
缓冲液3（2％NaCl，50mM MES，pH6.5）
将1克NaCl溶于50毫升缓冲液1中在室温下储存
消化缓冲液（20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5％[w / v] SDS）
1. 将0.1214g Tris溶于40ml MilliQ dH 2 O中
2. 用HCl调节至pH 8.0
3. 加入0.25克SDS并溶解
4. 顶部用MilliQ dH 2 O至50 ml
5. 在室温下储存
蛋白酶K溶液（2 mg / ml）
将2mg蛋白酶K溶于1ml MilliQ dH 2 O中储存在4°C

用于PAGE的粗脂磷壁酸（LTA）提取

20x柠檬酸盐缓冲液（1M柠檬酸钠，pH4.7）
1. 称出21.014克柠檬酸一水合物（MW 210.14）
2. 溶于70ml MilliQ dH 2 O中
3. 用氢氧化钠颗粒调节至pH4.7
4. 顶部用MilliQ dH 2 O至100 ml
5. 在室温下储存
重悬浮缓冲液（50mM柠檬酸钠，pH4.7）
1. 将25ml 20x柠檬酸盐缓冲液稀释到500ml MilliQ dH 2 O中
2. 必要时用NaOH调节至pH4.7
3. 在室温下储存

磷壁酸PAGE和染色

凝胶缓冲液（3M Tris-HCl，pH8.5）
1. 将36.342克Tris（MW = 121.14克/摩尔）溶于90毫升MilliQ dH 2 O中
2. 用浓HCl调节至pH8.5
3. 顶部用MilliQ dH 2 O至100 ml
4. 储存在4°C
10％过硫酸铵
将0.1g APS溶于1ml MilliQ dH 2 O中储存在-20°C
10x Tris-Tricine缓冲液（1M Tris，1M Tricine，pH 8.2）
1. 称出121.2克Tris（MW = 121.14克/摩尔）
2. 称出179.2克Tricine（MW = 179.17 g / mol）
3. 将粉末溶解在700ml MilliQ dH 2 O中
4. 顶部有MilliQ dH 2 O至1 L.
5. 在室温下储存
6. 不要调节pH值＆nbsp;
运行缓冲区
用MilliQ dH 2 O稀释300 ml 10x Tris-tricine缓冲液至3 L
分解丙烯酰胺溶液（30％T，6％C）
1. 将1.8克双丙烯酰胺溶于70.5毫升40％丙烯酰胺溶液中
2. 顶部用MilliQ dH 2 O至100 ml
3. 储存在4°C
堆积丙烯酰胺溶液（30％T，2.6％C）
1. 将0.78克双丙烯酰胺溶于73.1毫升40％丙烯酰胺溶液中
2. 顶部用MilliQ dH 2 O至100 ml
3. 储存在4°C
4x装染料
1. 将5毫升甘油与5毫升运行缓冲液混合
2. 加入一丝溴酚蓝并混合均匀
3. 储存在-20°C
阿辛蓝溶液（1毫克/毫升，3％乙酸）
1. 使这个解决方案新鲜
2. 将0.2g阿尔新蓝溶于194ml MilliQ dH 2 O中
3. 加入6毫升冰醋酸
氧化溶液（3.4 mM重铬酸钾，3.2 mM硝酸）
1. 使这个解决方案新鲜
2. 称出0.2克重铬酸钾（294.185克/摩尔）
3. 溶于200ml MilliQ dH 2 O.
4. 加入40μl硝酸
硝酸银溶液（12 mM）
1. 使这个解决方案新鲜
2. 称出0.408g硝酸银（MW = 169.87g / mol）＆nbsp;
3. 溶于200ml MilliQ dH 2 O.
显影剂（0.28M碳酸钠，1.85％甲醛）
1. 使这个解决方案新鲜
2. 称出14.84克碳酸钠（MW = 105.99克/摩尔）
3. 溶于500ml MilliQ dH 2 O.
4. 加入250μl37％甲醛＆nbsp;
0.1 M醋酸
用MilliQ dH 2 将1.44ml冰醋酸稀释到250ml中

第二部分：提取和分析磷壁酸 1 H NMR和ESI-MS

材料和试剂

用于核磁共振的壁磷壁酸（WTA）沉淀

14毫升管（康宁，目录号：352057）
接种循环（VWR，目录号：12000-810）
50 ml离心管（Fisher Scientific，目录号：14-955-240）
50毫升橡树岭管（Nalgene，目录号：3119-0050）
2 ml微量离心管（VWR，目录号：87003-298）
Staphylococcus aureus 或其他革兰氏阳性菌（至少5 ml湿细胞沉淀）
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）（BD，目录号：211822）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：BP166-500）
氯化钠（NaCl）（Sigma，目录号：S5886）
无水磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（默克密理博中国，目录号：SX0720-1）
氯化钾（KCl）（Sigma，目录号：P9541-500G）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Fisher Bioreagents，目录号：BP362-500）
Tris（Fisher Bioreagents，目录号：BP152-5）
胰蛋白酶（Amresco，目录号：M150-1G）
氢氧化钠（NaOH）（默克密理博中国，目录号：1064621000）
盐酸（HCl）（Sigma，目录号：258148-500ML）
三氯乙酸（TCA）（BDH，目录号：BDH9310-500G）
三水合乙酸钠（Sigma，目录号：S8625-500G）
冰醋酸（默克密理博中国，目录号：AX0073-9）
95％乙醇（Koptec，目录号：V1101）
干冰
10x磷酸盐缓冲盐水（见食谱）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
2 M NaCl（参见食谱）
1 M Tris-HCl，pH 7.0（参见食谱）
1 M Tris-HCl，pH 7.0，含有1M NaCl（参见配方）
0.5％SDS（见食谱）
10％三氯乙酸（见食谱）
3 M NaOAc，pH 5.1（见食谱）
胰蛋白酶解决方案（见食谱）

通过疏水相互作用色谱法纯化脂磷壁酸（LTA）

50 ml离心管（Fisher Scientific，目录号：14-955-240）
接种循环（VWR，目录号：12000-810）
50毫升橡树岭管（Nalgene 3119-0050）
2 ml微量离心管（VWR，目录号：87003-298）
橡胶塞（VWR，目录号：59586-167）
96孔板（Greiner，目录号：655185）
14毫升管（康宁，目录号：352057）
闪烁瓶（VWR，目录号：VW74511-20）
Kimwipes（Kimberly-Clark，目录号：34120）
真空管
0.45μmPES注射式过滤器（VWR，目录号：28145-503）
5 ml注射器（Fisher Scientific，目录号：14-829-45）
HiPrep Octyl FF 16/10柱（GE Healthcare，目录号：28936548）
松紧带
Staphylococcus aureus 或其他革兰氏阳性菌（至少20-25 ml湿细胞沉淀）
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）（BD，目录号：211822）
柠檬酸一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C7129）
氢氧化钠（NaOH）（默克密理博中国，目录号：1064621000）
0.1 mm氧化锆/硅胶珠（BioSpec Products，目录号：11079101z）
1-丁醇（Thermo Scientific，目录号：A399）
磷酸二氢钠，一水二元（NaH 2 PO 4 •2H 2 O）（Acros Organics，目录号：271750010）
硫酸（Sigma，目录号：258105-500ML）
70％高氯酸（BDH，目录号：4550-500ML）
钼酸铵四水合物（Sigma，目录号：A7302-100G）＆nbsp;
三水合乙酸钠（Sigma，目录号：S8625-500G）
L-抗坏血酸钠盐（VWR，目录号：0561-100G）
干冰
20倍柠檬酸盐缓冲液（见食谱）
重悬浮缓冲液（见食谱）
平衡缓冲液（见食谱）
洗脱缓冲液（见食谱）
灰化溶液（2 M H 2 SO 4 ，0.44 M HClO 4 ）（参见配方）
还原溶液（3 mM钼酸铵，0.25 M醋酸钠，1％抗坏血酸）（见食谱）
0.1 M磷酸盐缓冲液（见食谱）
磷酸盐标准（见食谱）

1 磷酸的H NMR和ESI-MS分析

1.7毫升微量离心管（VWR，目录号：87003-294）
NMR管（Wilmad，目录号：528-PP-7）
50 ml离心管（Fisher Scientific，目录号：14-955-240）
纯化的磷壁酸
99.8％D 2 O（Acros Organics，目录号：166300100）
100％D 2 O（Acros Organics，目录号：320700075）
48％氢氟酸（Acros Organics，目录号：223330250）
OmniTop组件，预灭菌一次性样品管®（PAW BioScience，目录号：50CTA-CF-X-00）
油管（VWR，目录号：89068-512）
氢氧化钾（西格玛，目录号：484016）
无水碳酸钠（Amresco，目录号：0585-500G）
碳酸氢铵（Sigma，目录号：09830-500G）
氢氧化铵溶液（Sigma，目录号：320145）
乙腈（Thermo Scientific，目录号：51101）
饱和碳酸钠溶液（见食谱）
1 M碳酸氢铵（见食谱
5 mM碳酸氢铵（见食谱）
稀氢氧化铵（见食谱）

设备

用于核磁共振的壁磷壁酸（WTA）沉淀

2 L带挡板的烧瓶（Kimble，目录号：25630-2000）
离心瓶（Thermo Fisher，目录号：3120-0500）
摇动培养箱（Thermo Scientific，目录号：SHKE6000）
BeadBeater（BioSpec产品）
落地式离心机（Beckman，目录号：369001）
转子（Beckman，目录号：369687）
Rotoflex管转子（Argos Technologies，目录号：R2000）
冷冻干燥机（Labconco，目录号：7670520）

通过疏水相互作用色谱法纯化脂磷壁酸（LTA）

摇动培养箱（Thermo Scientific，目录号：SHKE6000）
2 L挡板烧瓶x 4（Kimble，目录号：25630-2000）
250毫升带挡板的烧瓶（Kimble，目录号：25630-250）
Nalgene离心瓶（Thermo Fisher，目录号：3120-0500）
落地式离心机（Beckman，目录号：369001）
转子（Beckman，目录号：369687）
BeadBeater（BioSpec产品）
冷冻干燥机（Labconco，目录号：7670520）
1LBüchner烧瓶（Kimble，目录号：27060-1000）
真空泵（步琪，目录号：11V100000）
搅拌棒
搅拌板（VWR，目录号：97042-590）
ÄKTA纯色谱系统（GE Healthcare）
5 ml样品环（GE Healthcare，目录号：18114053）
加热块（VWR，目录号：12621-088）
读板器（Molecular Devices，目录号：SpectraMax M2e）
旋转蒸发器（步琪，目录号：11100V202）
Float-A-Lyzer G2透析装置CE，0.5-1.0 kD MWCO（Spectrum Laboratories，目录号：G235051）

1 磷酸的H NMR和ESI-MS分析

冷冻干燥机（Labconco，目录号：7670520）
干燥设备（见图2）
OmniTop组装（VWR，目录号：75840-774）
干燥管（VWR，目录号：46600-054）
Bruker Avance III 600
沃特世Q-TOF Premier四极杆/飞行时间质谱仪

图2.干燥设备。 A.使用化学通风橱内温和的气流进行过滤气流设置的示意图。装配有移液管尖端的预装配的OmniTop组装管可以方便地转换成图解的HF移除装置。将含有样品的微量离心管插入50ml离心管中作为第二容器。然后使空气（或氮气）流通过填充有KOH颗粒的捕集器，并进一步鼓泡通过饱和的碱溶液以中和HF。 B.实际设置的图片。

程序

用于核磁共振的壁磷壁酸（WTA）沉淀

将2 ml TSB转移到14 ml管中，如有必要，加入抗生素进行选择。
使用无菌接种环，从单个金黄色葡萄球菌菌落接种培养基。
将培养物在37℃下孵育，在一天中以250rpm振荡直至其混浊。
用预先培养的培养物在带挡板的烧瓶（如果需要，含有抗生素）中接种1L TSB。
将培养物在37℃下孵育，同时以200rpm振荡过夜。
将细胞培养物倒入离心瓶中。
在6,000 x g 离心10分钟。
将细胞沉淀悬浮在10ml的2M NaCl中。
用小三分之一的锆/硅珠填充小BeadBeater室。
将细胞悬浮液倒入BeadBeater室。
用2 M NaCl填充腔室，以最小化顶部空间并牢固地盖住它。
拧紧装满冰水的冷却室，让其冷却至少5分钟。
以2.5分钟打4个循环，其间至少冷却5-10分钟。
让珠子沉淀，并根据需要小心地将裂解物吸移到尽可能多的50ml橡树脊管中。
向珠子中加入10ml的2M NaCl并脉冲10秒以洗涤珠子。
将洗涤液与Oak Ridge管中的裂解液混合。
在14,000 x g 离心15分钟以沉淀细胞壁碎片。
用10ml 1x PBS洗涤并离心。
将沉淀重悬于30ml 0.5％SDS中并离心。
再重复两次。
用MilliQ dH 2 O洗涤3次，重新悬浮并离心。＆nbsp;
悬浮于30ml MilliQ dH 2 O中。
在60℃下孵育30分钟，同时以250rpm振荡以除去非共价结合的组分。
在14,000 x g 离心15分钟以沉淀细胞壁并吸出含有非共价结合组分的上清液。
用30ml MilliQ dH 2 O洗涤细胞壁沉淀。＆nbsp;
悬浮于20毫升胰蛋白酶溶液中。
在37℃下孵育18小时，并在250rpm下持续混合。
在14,000 x g 离心15分钟。
每次洗涤后，重新悬浮并以14,000 x g 离心15分钟，依次用30 ml以下洗涤：
1. 1M Tris-HCl pH 7.0
2. 1 M Tris-HCl，pH 7.0，含有1M NaCl
3. 1M Tris-HCl，pH 7.0
4. 3x MilliQ dH 2 O.
悬浮在10毫升0.1M NaOH中。参见备选TCA水解的注释。
在管旋转器上或在250rpm振荡下在室温下孵育16小时。
在5,500 x g 离心45分钟。
将含有WTA的上清液转移到新管中并丢弃肽聚糖沉淀。
加入0.1体积的3M NaOAc，pH5.1和3体积的95％冰冷乙醇以沉淀WTA。
在-20°C孵育过夜。
在室温下以5,500 x g 离心30分钟。
将沉淀悬浮在2ml 95％EtOH中，并转移到2ml微量离心管中。
在16,000 x g 离心5分钟以收集WTA。
用2ml 95％EtOH洗涤橡树脊管，并在2ml微量离心管中混合，通过在16,000 离心5分钟离心收集残留的WTA。
通过重悬于2ml 95％乙醇中洗涤WTA沉淀并离心。
重复共5次。
让乙醇完全蒸发。
将沉淀悬浮于500μlMilliQdH 2 O中。
转移到预先称重的1.7ml微量离心管中。
在干冰浴中或在-80℃下冷冻并冷冻干燥，得到白色粉末。
称重并储存在-20°C。

通过疏水相互作用色谱法纯化脂磷壁酸（LTA）

原油LTA的提取

将20 ml TSB转移到50 ml离心管中，如有必要，加入抗生素进行选择。
使用无菌接种环，从单个金黄色葡萄球菌菌落接种培养基。
将培养物在37℃下孵育，在一天中以250rpm振荡直至其混浊。
用预培养的培养物接种4×1L TSB烧瓶（如果需要，用抗生素）。
将培养物在37℃下孵育，同时以200rpm振荡过夜。
将细胞培养物倒入离心瓶中。
在6,000 x g 离心10分钟。
将细胞重悬并合并在100ml重悬浮缓冲液中。
将细胞在6,000 x g 下沉淀10分钟。
注意：颗粒可以冷冻，在-80°C下长期保存。
用1/3 rd 锆/二氧化硅珠填充大BeadBeater室。
用刮刀将细菌沉淀物转移到BeadBeater室中。
注意：重要的是尽量减少腔室中的顶部空间，因此不推荐涡旋重悬，因为它会导致起泡。
用50ml重悬浮缓冲液清洗瓶子并倾倒入BeadBeater室。
使用重悬浮缓冲液填充腔室以最小化顶部空间，同时为BeadBeater转子留出足够的空间。
用冰水填充冷却室，冷却5分钟。
以2.5分钟打4个循环，在循环之间冷却至少5-10分钟。
让珠子沉淀，并根据需要小心地将裂解物吸移到尽可能多的50ml橡树脊管中。
向珠子中加入50ml重悬浮缓冲液并脉冲10秒以洗涤珠子。
将洗涤液与Oak Ridge管中的裂解液混合。
在30,000 x g ，4°C离心45分钟以沉淀细胞膜材料。
注意：颗粒可以冷冻，在-80°C下长期保存。
彻底重悬并将膜沉淀在60-75 ml总重悬浮缓冲液中混合，倒入干净的250 ml带挡板的烧瓶中。
注意：膜颗粒难以重悬，因此需要用刮刀/移液管和涡流进行刮擦。
用50ml总1-丁醇洗涤离心管并倒入同一烧瓶中。
紧紧盖住以防止丁醇蒸发并在37℃下振荡孵育45分钟。
将悬浮液分成50毫升橡树岭管。
注意：可以使用与步骤19-20相同的管而无需清洁。
在30,000 x g ，4℃下离心45分钟以沉淀不溶性碎片。
将含有LTA的下部水相萃取到50ml离心管中。
在6,000 x g 离心10分钟以除去碎片。
在冷冻干燥瓶中提取并合并上清液。
在干冰浴中快速冷冻。
注意：在冷冻时缓慢旋转烧瓶以涂覆烧瓶壁。更大的冰面积将加速干燥。
冷冻干燥过夜或完成。
悬浮于5 ml平衡缓冲液中。
分成3×2ml微量离心管。
在20,000 x g 离心10分钟以除去不溶性碎片。
将上清液合并，通过0.45μmPES注射器过滤器过滤，以除去任何残留的碎屑。
用500μl平衡缓冲液清洗过滤器并合并滤液。
将溶液吸入干净的5 ml注射器中，然后进行柱层析。
注意：
1. 确保最终样品完全没有碎屑。否则，再次离心和/或过滤以澄清。
2. 确保没有气泡。点击注射器去除任何气泡，让它直立几分钟，让气泡上升。

疏水相互作用色谱

将500ml平衡缓冲液转移至1LBüchner烧瓶中。
插入搅拌棒并用橡皮塞盖住烧瓶。
将真空管的一端连接到软管倒钩，另一端连接到真空泵。
启动真空以使溶液脱气。
缓慢增加搅拌速率，直至剧烈搅拌，确保溶液不会进入管道。
在搅拌下将溶液脱气30分钟。
通过缓慢停止搅拌然后关闭真空来停止除气。
用洗脱缓冲液重复脱气程序。
将HiPrep Octyl FF 16/10色谱柱连接到ÄKTApure系统。
用10 ml平衡缓冲液清洁样品环。
手动将粗LTA提取物注入样品环中。
在以下条件下开始色谱柱纯化运行：
1. 根据系统压力将流速固定在0.5 ml / min或更高。
2. 用2倍柱体积（40ml）的平衡缓冲液平衡。
3. 用10 ml平衡缓冲液清空样品环。
4. 用5倍柱体积的平衡缓冲液（100ml）洗涤柱子。
5. 用线性梯度的平衡缓冲液和洗脱缓冲液（15％至65％1-丙醇，50mM柠檬酸钠，pH4.7）在100ml中洗脱柱子。
6. 收集3ml级分，总共约36个级分。
7. 用4倍柱体积的（80ml）洗脱缓冲液清洗柱子。
8. 用6个柱体积（120ml）的平衡缓冲液平衡柱子。

LTA组分的磷酸盐含量分析

将100μl磷酸盐标准品和100μl每种级分转移到2ml微量离心管中。
在化学通风橱中工作，每管加入200μl灰化溶液。
将微量离心管打开盖子，在化学通风橱中在120℃的加热块上孵育3小时。
加入1毫升还原溶液和盖管。
在45°C孵育2小时，偶尔通过倒置混合。
将250μl从每个管转移至96孔板并在700nm处读数。
结合LTA峰值分数。
在旋转蒸发器上干燥，水浴设定为30°C。
在干燥馏分的同时，根据制造商的说明准备透析装置。
将LTA悬浮在总共5ml MilliQ dH 2 O中并转移到制备的透析装置中。
在4°C下对MilliQ dH 2 O进行广泛透析
1. 在5L MilliQ dH 2 O中透析至少7至8轮，每次6小时。
2. 严格搅拌以提高透析效率。
3. 如果一次透析多个样品，则至少再加2轮透析。
将透析液转移到预先称重的闪烁瓶中。
在干冰浴中小心地冷冻透析液。
取下盖子，用松紧带将折叠的Kimwipe固定在其位置。
冷冻干燥过夜或完成。
称重并储存在-20°C。

1 H NMR和ESI-MS分析磷壁酸

1 H核磁共振

将纯化的TA悬浮于99.8％D 2 O中。＆nbsp;
转移至1.7 ml微量离心管中。
在室温下孵育30分钟。
在干冰浴中或在-80°C下冷冻。
冷冻干燥。
重复步骤1-5而不更换管。
将质子交换的TA悬浮在550μl的100％D 2 O中。
注意：将一次性安瓿D 2 O用纸巾包起来，小心地从顶部折断以防止受伤。
用安瓿中剩余的150μlD 2 O冲洗干净的NMR管。
轻轻地轻弹或使用长尖吸管移除D 2 O。
小心地将D 2 O中的TA转移到NMR管中。
使用以下典型设置进行NMR：
温度：298 K
脉冲序列：ZG（无水抑制）或ZGPR（通过预饱和抑制水分）
扫描次数：512
光谱宽度：10 ppm
采集时间：5.45秒
回收延迟：5秒
线加宽：0.3 Hz
总实验时间：Bruker Avance III 600大约2小时＆nbsp;
使用水信号作为4.7ppm的参考校准光谱，并指定对应于 S的NMR信号。金黄色葡萄球菌 WTA和LTA，如图3所示。见关于核磁共振标准的说明。

图3.WTA和LTA的样品 1 1 H NMR光谱。 A.WTA从野生型 S的肽聚糖中释放出来。通过NaOH水解引起的金黄色葡萄球菌导致D-ala修饰的丧失。使用没有水抑制的ZG脉冲序列获得该WTA光谱。 B.从野生型 S纯化的LTA。金黄色葡萄球菌具有非常低水平的GlcNAc糖基化但是高度D-氨基化。使用具有水抑制的ZGPR脉冲序列获得该LTA谱。这些NMR光谱改编自Kho和Meredith（2018）中公布的数字。 Rbo =核糖醇; Gro =甘油。

ESI-MS的TA去磷酸化和单体化
注意：氢氟酸极其危险。用户在使用前应咨询标准操作程序及其安全办公室。在化学通风橱中工作并采取一切必要的预防措施。

在1.7 ml微量离心管中称出1 mg纯化TA。＆nbsp;
将LTA悬浮在100μl的48％氢氟酸中。
在室温下孵育20小时。
注意：将微量离心管插入标记清晰的50 ml离心管中作为辅助容器，以防止意外接触。
设置带有过滤气流的密闭容器干燥设备（参见图2）。
将空气通过KOH捕集器并将出口管插入饱和碳酸钠溶液中。
注意：可以使用其他饱和碱溶液。
将微量离心管插入密闭容器中并使用低速气流将其蒸发直至没有残留液体。
将干燥的样品重悬于200μl的5mM碳酸氢铵中。
用稀氢氧化铵调节至pH 7。
在干冰浴中或在-80°C下冷冻。
冷冻干燥过夜或完成。
储存在-20°C。

注意：根据侧链修饰，应调整HF培养时间以使TA单体化最大化，同时尽量减少侧链的切割。

电喷雾电离质谱（ESI-MS）
注意：使用MassLynx软件4.1版（Waters）在Waters Q-TOF Premier四极杆/飞行时间质谱仪（Waters Corporation [Micromass，Ltd。]，Manchester，UK）上进行质谱分析。

使用由50％乙腈（LC-MS级）和50％10mM乙酸铵水溶液组成的流动相，使用直接进样分析样品，流速为0.15ml / min。
将氮气干燥温度设定为300℃，流速为7L / min，毛细管电压为2.8kV。
使用ESI将质谱仪设置为在正离子和负离子模式下从100到1,000 m / z进行扫描。
分配与 S对应的计算质量。金黄色葡萄球菌 LTA，如图4所示。

图4. S的样品正离子模式ESI-MS。金黄色葡萄球菌 LTA过量表达LTA糖基化系统。可以在Kho和Meredith（2018）中找到完整的指定质量列表。

笔记

用于核磁共振的壁磷壁酸（WTA）沉淀

如果重新悬浮颗粒变得困难，用移液管尖端物理刮擦苍白/白色颗粒并涡旋以便重新悬浮。
胰蛋白酶消化是去除任何细胞壁结合蛋白所必需的。
NaOH水解导致WTA上D-丙氨酸修饰的丧失（图3）。或者，可以通过在10ml 10％TCA（w / v）中使用TCA水解并在4℃下恒温振荡或倒置温育18小时来保存D-丙氨酸修饰。
该方案通常产生约5mg的WTA，但它可以是菌株和物种依赖性的。

通过疏水相互作用色谱法纯化脂磷壁酸（LTA）

该方案通常产生5-15mg的LTA并且足以进行NMR分析，但产率取决于菌株。
即使在1-丁醇萃取之前将膜沉淀破碎并且大量涡旋，它仍然可能有点粗糙，但您可以继续进行1-丁醇萃取。在重新悬浮之前将颗粒在-20°C冷冻也可能有所帮助。
仅应包括缓冲液的对照样品用于灰化测定，因为许多标准实验室容器将浸出并有助于背景吸光度。
重要的是广泛透析LTA以最小化NMR和ESI-MS中残留柠檬酸盐信号的干扰。

1 H NMR和ESI-MS分析磷壁酸

常规使用Bruker Avance III 600，但也可以使用更高/更低的场强仪器。
根据TA浓度和场强，可能需要修改扫描次数。
如果预计会出现峰（如异头碳水化合物质子信号），应谨慎使用水信号抑制脉冲程序。
对于初始实验，理想情况下应使用诸如DSS的NMR标准，因为水的化学位移可以变化。该标准可在同轴插入物中外部参考，以保持下游应用的样品纯度。
在核磁共振后可以回收TA，并用于其他应用，如质谱或冷冻干燥，以便长期储存。＆nbsp;
如果计划多个下游应用，则首先等分为工作量然后冷冻干燥更容易。

食谱

用于核磁共振的壁磷壁酸（WTA）沉淀

10x磷酸盐缓冲盐水＆nbsp;
1. 权衡以下内容：
  1.44克Na 2 HPO 4 （MW = 141.96克/摩尔）
  8g NaCl（MW = 58.44g / mol）
  2克KCl（MW = 74.55克/摩尔）
  0.24g KH 2 PO 4 （MW = 136.09g / mol）
2. 溶于100ml MilliQ dH 2 O.
3. 在室温下储存
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
用MilliQ dH 2 O将10 ml 10x PBS稀释到100 ml中在室温下储存
2 M NaCl
1. 称出23.376 g NaCl（MW = 58.44 g / mol）
2. 溶于200ml MilliQ dH 2 O.
3. 在室温下储存
1 M Tris-HCl，pH 7.0
1. 称出24.228克Tris（MW = 121.14克/摩尔）
2. 溶于180ml MilliQ dH 2 O.
3. 调节至pH 7.0
4. 用MilliQ dH 2 O至200ml
5. 在室温下储存
1 M Tris-HCl，pH 7.0，含有1M NaCl
1. 称出24.228克Tris（MW = 121.14克/摩尔）
2. 称出11.688 g NaCl（MW = 58.44 g / mol）
3. 溶于170ml MilliQ dH 2 O.
4. 调节至pH 7.0
5. 用MilliQ dH 2 O至200ml
6. 在室温下储存
0.5％SDS
1. 称出0.5 g SDS（MW = 288.372 g / mol）
2. 溶于100ml MilliQ dH 2 O.
3. 在室温下储存
10％三氯乙酸（w / v）
1. 称出2克TCA（MW = 163.38克/摩尔）
2. 溶于20ml MilliQ dH 2 O中
3. 储存在4°C
3 M NaOAc，pH 5.1
1. 称出40.824克三水合乙酸钠（MW = 136.08克/摩尔）
2. 溶于80ml MilliQ dH 2 O.
3. 用冰醋酸调节至pH 5.1
4. 用MilliQ dH 2 O加至100ml
5. 在室温下储存
胰蛋白酶溶液（0.2mg / ml胰蛋白酶在15mM Tris-HCl，pH7.0中）
1. 使这个解决方案新鲜
2. 用MilliQ dH 2 O稀释300μl1M Tris-HCl，pH 7.0至20 ml
3. 必要时调节至pH 7.0
4. 溶解4毫克胰蛋白酶

通过疏水相互作用色谱法纯化脂磷壁酸（LTA）

20x柠檬酸盐缓冲液（1M柠檬酸钠，pH4.7）
1. 称出21.014克柠檬酸一水合物（MW = 210.14克/摩尔）
2. 溶于70ml MilliQ dH 2 O中
3. 用氢氧化钠颗粒调节至pH4.7
4. 顶部用MilliQ dH 2 O至100 ml
5. 在室温下储存
重悬浮缓冲液（50mM柠檬酸钠，pH4.7）
1. 用MilliQ dH 2 将50ml 20x柠檬酸盐缓冲液稀释至1L
2. 必要时调节至pH 4.7
3. 在室温下储存
平衡缓冲液（50mM柠檬酸钠，pH 4.7，含15％（v / v）1-丙醇）
1. 用MilliQ dH 2 O稀释25 ml 20x柠檬酸盐缓冲液至425 ml
2. 必要时调节至pH 4.7
3. 加入75毫升1-丙醇
4. 在室温下储存
洗脱缓冲液[50mM柠檬酸钠，pH4.7，含65％（v / v）1-丙醇]
1. 用MilliQ dH 2 将25ml 20x柠檬酸盐缓冲液稀释到175ml中
2. 必要时调节至pH 4.7
3. 加入325毫升1-丙醇
4. 在室温下储存
灰化溶液（2 M H 2 SO 4 ，0.44 M HClO 4 ）
1. 使这个解决方案新鲜
2. 测量8.5ml MilliQ dH 2 O.
3. 加入1.11毫升硫酸（分子量= 98.08克/摩尔）
4. 加入0.376毫升70％高氯酸（MW = 100.46克/摩尔）
还原溶液（3mM钼酸铵，0.25M乙酸钠，1％抗坏血酸）
1. 使这个解决方案新鲜
2. 权衡以下内容：
  185.38毫克钼酸铵四水合物（MW = 1235.86）
  1.701g三水合乙酸钠（MW = 136.08）
  0.5克L-抗坏血酸钠盐（MW = 198.11）
3. 溶于50ml MilliQ dH 2 O.
0.1 M磷酸盐缓冲液
1. 称出1.56克磷酸二氢钠二水合物（MW = 156.01克/摩尔）
2. 溶于100ml MilliQ dH 2 O.
磷酸盐标准品（6种浓度; 8 mM至0.25 mM）
1. 添加80μl0.1M磷酸盐缓冲液至920μlMilliQdH 2 O，用于8 mM磷酸盐
2. 在MilliQ dH 2 O中系列稀释2倍直至0.25mM磷酸盐＆nbsp;
注意：其他无机磷酸盐可用作标准。

1 H NMR和ESI-MS分析磷壁酸

饱和碳酸钠溶液
逐渐将碳酸钠（MW = 105.99）搅拌到100ml MilliQ dH 2 O中直至其饱和并停止溶解
1 M碳酸氢铵
将1.58克碳酸氢铵（MW = 79.06）溶于20毫升MilliQ dH 2 O中
5 mM碳酸氢铵
用MilliQ dH 2 O稀释250μl1M碳酸氢铵至50 ml
稀氢氧化铵
用MilliQ dH 2 将100μl氢氧化铵溶液稀释至1ml

致谢

用于PAGE的粗WTA提取的方案改编自Meredith 等人（2008）和Kho和Meredith（2018）。用于PAGE的粗脂磷壁酸提取的方案改编自Kho和Meredith（2018）。 TA-PAGE和染色的方案改编自Wolters 等。（1990），Pollack和Neuhaus（1994），Meredith 等。（2008）和Kho和Meredith（2018）。用于NMR的WTA沉淀的方案改编自Bernal 等人（2009）。 LTA疏水相互作用色谱方案改编自Morath et al。（2001），Draing et al。（2006），Gründling和Schneewind（2014）以及Kho和Meredith（ 2018）。磷酸盐含量分析方案改编自Draing 等人（2006）和Kho和Meredith（2018）。 S的NMR分析。 aureus LTA改编自Morath et al。（2001）和Kho and Meredith（2018）。 TA去磷酸化和ESI-MS的方案改编自Eugster 等（2011），Shen 等。（2017）和Kho and Meredith（2018）。
资金来源：资助由宾夕法尼亚州立大学的埃伯利科学学院提供。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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