材料和试剂

Falcon管，15 ml（Corning，目录号：352096）
Falcon管，50ml（Corning，目录号：352098）
Falcon ® 100 mm TC处理的细胞培养皿，20个/包，200个/箱，无菌（Corning，目录号：353003）＆nbsp;
低保留管，1.5 ml（Fisher Scientific，目录号，Fisherbrand TM ，目录号：02-681-320）
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34120）
Parafilm（Bermis，目录号：PM996）
Amicon Ultra-0.5离心过滤装置（默克，产品目录号：UFC503096）
无菌40微米尼龙网（康宁，目录号：352340）
6管磁力架（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM10055）
24孔板（康宁，目录号：353047）
12孔板（康宁，目录号：353043）
T75烧瓶（康宁，目录号：353136）
Bio-Spin ® P-30凝胶柱，Tris缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：7326232）
Dynabeads TM 绵羊抗大鼠IgG（赛默飞世尔科技，目录号：11035）
DPBS，1x不含钙和镁（Corning，目录号：21-031-CV）
DMSO，二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
Alexa Fluor TM 647 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A20006）
Isothesia（Isoflurane）解决方案（Henry Schein Animal Health，目录号：029405）
异氟醚腔，EZ麻醉
氧气（Tech Air）
氯化钾，KCl，BioXtra，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氯化钙二水合物，CaCl 2 •2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）
氯化镁，MgCl 2 ，无水，≥98％（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
碳酸氢钠，NaHCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：S5761-500G）＆nbsp;
牛血清白蛋白，冻干粉，基本上不含IgG，低内毒素，BioReagent，适合细胞培养（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
HBSS缓冲液：Hank's平衡盐溶液，1x不含钙，镁和酚红（Corning，目录号：21-022-CV）
慢病毒myristoylated-Akt1：通过Lenti-X p24 Rapid Titer Kit（Takara Bio，Clontech，目录号：632200）测量病毒滴度
纤连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：F1141-5MG）（PBS中的工作浓度为1μg/ ml）
胰蛋白酶（Corning，目录号：25-052-CI）
胶原酶（罗氏诊断，目录号：11088793001）
Dispase（Roche Diagnostics，目录号：04942078001）
Polybrene（Sigma-Aldrich，目录号：H9268-5G）＆nbsp;
直接谱系消耗试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-110-470）
Accutase细胞分离解决方案（Corning，目录号：25-058-CI）
StemSpan SFEM（干细胞技术，目录号：09650）
Knockout血清替代品（Thermo Fisher Scientific，目录号：10828028）
重组人SCF，或KitL（PeproTech，目录号：250-03）
UltraPure TM 0.5 M EDTA，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：15575020）
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）（Thermo Fisher Scientific，目录号：D1306）
F-12 medium（Corning，Cellgro，目录号：10-080-CV）
DMEM低葡萄糖培养基（Corning，Cellgro，目录号：10-014-CV）
热灭活FBS（Denville Scientific，目录号：FB5001）
非必需氨基酸（Corning，Cellgro，目录号：25-025-CI）
青霉素/链霉素/两性霉素（Corning，Cellgro，目录号：30-004-CI）
1 M HEPES（Corning，Cellgro，目录号：25-060-CI）
内皮细胞生长补充剂（Alfa Aesar，目录号：J64516）
肝素钠10 mg / ml（Sigma-Aldrich，目录号：H3149-100KU）
GlutaMAX（赛默飞世尔科技，目录号：35050061）
抗体（表1）
胶原酶/分散酶溶液的8倍浓度（参见食谱）
MACS缓冲区（参见食谱）
Polybrene原液（见食谱）
EC完全中等（见食谱）

表1.使用的抗体列表

设备

移液器，Denville Ultra EZpette TM 移液器入门套件（灰色/蓝色）（Denville Scientific，目录号：P3960-SK）
剪刀，直;夏普钝; 4.5“长度（Roboz手术器械，目录号：RS-6800）
镊子，学生等级拇指敷料钳4.5“锯齿（Roboz手术器械，目录号：65-8100）
砂浆和杵。（VWR，目录号：89038-148和89038-164）＆nbsp;
37°C轨道振荡器（Thermo Fisher Scientific，型号：MaxQ TM 4000）
离心机，Sorvall TM Legend TM XT / XF离心机系列（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM Legend TM XT，目录号：75004505）
FACS Aria II细胞分选仪（BD，型号：FACSAria II）
层流罩（The Baker Company，SterileGARD生物安全柜）
NanoDrop光谱仪（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 1000，目录号：ND-1000）

程序

准备BV13-AF647偶联抗体并测量标记程度（DOL）
1. 将AF647染料等分成40μg的单个等分试样，首先将1mg AF647染料重悬于500μlDMSO中，然后将20μl等分至每个管中并旋转干燥。
2. 在0.5 ml Amicon Ultra Filter Unit中将抗体浓缩至1 mg / ml（总共100μg）。＆nbsp;
3. 通过将柱倒置到新管中并在1,000 x g 下旋转3分钟来收集抗体。
4. 用PBS将体积增加至100μl。
5. 加入10μl1MNaHCO 3， 3 。
6. 用抗体溶液重悬沉淀染料，在37℃下孵育2小时。
7. 移液管每20分钟混合均匀结合。
8. 当共轭离开5分钟时，准备Bio-Spin ® 30（Bio-Rad）柱进行纯化。＆nbsp;
  1. 旋转管从盖子中取出浆液。
  2. 取下橙色帽子。
  3. 从底部扭转。
  4. 置于5毫升聚苯乙烯Falcon管中以收集流过液。
  5. 在摆式转子转子中以1,100 x g 旋转3分钟。
9. 将抗体/染料溶液逐滴加载到树脂的中心。
10. 将柱放入收集管中并旋转1,100 x g 5分钟。
11. 放入琥珀色管中，在4°C下储存。
12. 计算：
  
  注意，对于Amax和A280，使用NanoDrop在“蛋白质和标签”部分下测量。 AF647染料，Amax在651nm处测量。灭绝Coeffi为239,000，校正因子为0.03，典型IgG的消光系数为203,000。
通过细胞分选分离原代BMEC
1. 以1mg / ml制备BV13-AF647缀合的抗体。测量标记程度（DOL）。一个好的DOL可以使用4到8个。
2. 每只小鼠，通过在75μl无菌PBS中加入25μl缀合的抗体制备BV13-AF647抗体。
3. 使用异氟醚和氧气流麻醉小鼠。将在步骤B2中制备的100μlBV13-AF647抗体（25μg）逐渐倒入每只小鼠（视频1）。
  
  视频1.BV13-AF647的逆向注射。将小鼠放入异氟醚室中3分钟后，将小鼠麻醉（未在视频中显示）。在通过捏住脚趾间区域和缺乏小鼠运动确认麻醉状态后，将小鼠从异氟醚室中取出并进行眼眶后注射。将鼠标头靠近针头。将拇指和食指放在眼球的两侧，牢牢抓住眼部区域。使用向下运动，尽可能地暴露眼球，同时将眼球保持在静止位置（这需要将拇指和食指紧靠眼球放置，但不要在下方进一步向下）。将针头从眼睛的前端插入眼球下方的区域（可选：可以完全注射针头，直到针头感觉到眶后丛后面的骨骼并稍微取回针头）。将在75μlPBS（总共100μl体积）中稀释的25μgBV13-AF647注射到小鼠中。快速取下针头，用眼睑轻轻盖住眼睛，以防止出血。监测小鼠是否有任何出血或其他不适的迹象，这些迹象通常不会发生。（研究批准。所有动物实验均在纽约州纽约市威尔康奈尔医学院动物护理和使用委员会的批准下进行。所有实验程序均遵循IACUC指南。该视频是在威尔康奈尔医学院根据指南制作的。根据＃2009-0061号协议，美国纽约威尔康奈尔医学院的IACUC。）
4. 十分钟后，安乐死鼠标。
5. 快速打开鼠标，剖开2个股骨和2个胫骨。
6. 使用Kimwipes和剪刀清洁肌肉（视频2）。
  
  视频2.解剖股骨和胫骨。用剪刀揭开并剥掉腿部皮肤。当从小鼠中解剖股骨时，确保尽可能在股骨和髋关节附着的末端切开，以保持股骨的完整性。在从小鼠中解剖出股骨和胫骨之后，使用剪刀从小鼠腿部移除过多的肌肉（未在视频中示出）。然后使用轻微的扭转运动分离股骨和胫骨。为了进一步清除股骨肌肉，Kimwipes用于刮除肌肉，任何使用Kimwipes不易分离的残留肌肉都可以用剪刀剪掉。为了清除胫骨肌肉，将胫骨向下保持，脚趾朝上，脚背朝向操作者。在手腕区域使用剪刀轻轻切割以露出皮肤，然后通过向下拉动脚趾并同时向上推动胫骨骨骼来剥离皮肤和肌肉（有关详细技术，请参阅视频）。（研究批准。所有动物实验均在纽约州纽约市威尔康奈尔医学院动物护理和使用委员会的批准下进行。所有实验程序均遵循IACUC指南。该视频是在威尔康奈尔医学院根据指南制作的。根据＃2009-0061号协议，美国纽约威尔康奈尔医学院的IACUC。）
7. 通过用1x HBSS缓冲液稀释8x胶原酶/分散酶原液制备1x胶原酶/分散酶溶液。
8. 使用研钵和研杵使股骨和胫骨均匀化。使用研杵以圆周方式将骨组织牢固地研磨，顺时针旋转25次，逆时针旋转25次。确保释放所有骨髓组织。＆nbsp;
9. 向研钵中加入5ml 1x胶原酶/分散酶/ HBSS缓冲液，将所有上清液和骨组织转移到15ml Falcon管中。
10. 用封口膜密封Falcon管并将管置于37°C的轨道振荡器上。摇动15分钟。
11. 加入10 ml MACS缓冲液以停止酶消化。
12. 通过无菌的40μm尼龙网（细胞过滤器）过滤细胞，并以500 x g 离心5分钟。
13. 小心地吸出上清液。
14. 使用直接谱系消除试剂盒（Miltenyi Biotech）进行谱系消耗。收集流过的Lin-细胞。
15. 将细胞沉淀重悬于50μlMACS缓冲液中。
16. 用1:50稀释度用TruStain小鼠阻断（FcR阻断或抗CD16 / 32抗体）在冰上封闭5分钟。
17. 将1μlCD31和1μlCD45抗体加入细胞中并在冰上染色25分钟。
18. 加入10 ml MACS缓冲液进行清洗。
19. 准备重新溶解溶液（PBS + 2 mM EDTA + DAPI）。取出上清液后，在每个试管中加入0.4ml（PBS + 2mM EDTA + DAPI）以重悬沉淀。
20. 使用BD对85nm喷嘴处的DAPI - CD45 - CD31 + VE-钙粘蛋白 + 细胞的BMEC进行分类FACSAria II（图1A）。或者，当不进行BV13-AF647的活体标记时，可以将BMEC分类为DAPI - CD45 - CD31 + 细胞（图1B）群组。
21. 从一只2个月大的小鼠中，我们可以获得大约20,000-30,000个BMEC。
22. 将细胞接种到24孔板的一个孔中，在0.5ml小鼠EC完全培养基中。
  
  图1.用于分选的BMEC门控。 A. Lin - 细胞在CD45 - 上进一步门控，随后CD31 + < / sup> VE-钙粘着蛋白 + 群体。获得的细胞群是主要BMEC。 B.或者，BMEC可以分类为CD31 + CD45 - 细胞。
通过CD31-Dynabeads分离原代BMEC
1. 第1天：用大鼠抗小鼠CD31（克隆13.3）抗体涂羊抗大鼠Dynabeads
  1. 使用10μl珠子从一只小鼠的股骨和胫骨。
  2. 在磁架上用1ml MACS缓冲液洗涤珠子三次。
  3. 将珠子重悬于200μlMACS缓冲液中。
  4. 加入4.8μl大鼠抗小鼠CD31抗体。＆nbsp;
  5. 当使用几只小鼠的骨髓样品时，在步骤B1a放大珠子体积并在步骤B1d放大抗体体积，但保持MACS缓冲液体积为200μl。
  6. 在室温下温和混合孵育珠子和抗体1小时，然后在4℃下保持混合过夜。
2. 第2天：分离主要BMEC
  1. 安乐死鼠标。
  2. 快速打开鼠标，剖开2个股骨和2个胫骨。
  3. 使用Kimwipes和剪刀清洁肌肉。
  4. 通过用1x HBSS缓冲液稀释8x胶原酶/分散酶原液制备1x胶原酶/分散酶溶液。
  5. 使用研钵和研杵使股骨和胫骨均匀化。使用研杵以圆周方式将骨组织牢固地研磨，顺时针旋转25次，逆时针旋转25次。确保释放所有骨髓组织。
  6. 向研钵中加入5ml 1x胶原酶/分散酶/ HBSS缓冲液，将所有上清液和骨组织转移到15ml Falcon管中。
  7. 盖上Falcon管，然后用封口膜密封Falcon管。将管置于37°C的轨道振荡器上。摇动15分钟。
  8. 加入10毫升MACS缓冲液以阻止消化。＆nbsp;
  9. 通过无菌的40μm尼龙网（细胞过滤器）过滤细胞，并以500 x g 离心5分钟。
  10. 小心地吸出上清液。
  11. 将细胞沉淀重悬于0.5ml MACS缓冲液中的低保留管中。
  12. 在MACS缓冲液中洗涤珠子3次以除去过量的抗体。在第1天的步骤B1a，每10μl珠子体积在50μlMACS缓冲液中重悬珠子。＆nbsp;
  13. 加入CD31包被的珠子，在4℃下温育45分钟，轻轻摇动。
  14. 使用磁铁收集珠子结合的细胞并在MACS缓冲液中洗涤5次。
  15. 使用PBS中1μg/ ml的纤连蛋白预涂覆12孔板的一个孔。
  16. 使用1ml小鼠EC完全培养基重悬珠子，并转移到12孔板中进行培养。在Dynabeads-CD31富集后，我们将从一只小鼠的2个股骨和2个胫骨获得的所有CD31 + 细胞放入预先涂有纤连蛋白的12孔板的一个孔中。
注意：
1. 建议使用适量的Dynabeads来富集CD31 + 细胞。过多的珠子倾向于积聚在孔板底部并阻止细胞附着，从而降低产量（图2）。
2. 可以使用胰蛋白酶或accutase细胞分离培养基通过酶消化除去Dynabeads。或者，当细胞分裂或在细胞传代期间，Dynabeads将逐渐消失。
3. 细胞分选技术和Dynabeads富集方法之间的比较：BMEC的纯种群将从FACS分选获得，尽管细胞数量低。为了产生稳定的Akt1-BMEC系，Dynabeads方法产生更多的细胞和更好的接种活力。初始步骤中的任何杂质可以通过FACS分选在后面的步骤中处理。
  
  图2. Dynabeads富集后的原代小鼠CD31 + 细胞的代表性图像。 A-B。 Dynabeads的明场图像富含C31 +肺EC。光盘。 Dynabeads的明场图像富含C31 +肝脏ECs。很少有免费的Dynabeads漂浮在细胞培养皿中，使细胞更容易附着。比例尺=200μm。
原发性BMEC和细胞传代的慢病毒转导
1. 第1天
  1. 在室温下在层流罩中用纤连蛋白/ PBS溶液（在无菌PBS中1：1,000稀释纤连蛋白）预涂覆板30分钟。
  2. 吸出纤连蛋白涂层。
  3. 在预涂孔中使小鼠EC完全培养基中的初级BMEC接种。转换排序事件的数量并除以3以得出实际的细胞数，并在较小的孔板内种子，例如24孔板。从一只小鼠的2只股骨和2只胫骨，我们将Dynabeads富集的CD31 + 细胞放入12孔板的一个孔中。我们将FACS纯化的BMEC放入24孔板的一个孔中。
2. 第2天
  1. 接种后一天，一些细胞应附着。细胞倾向于附着在板的中心和边缘。
  2. 将聚凝胺溶液加入培养基中至终浓度为4μg/ ml。
  3. 在37℃下在细胞培养箱中静置5分钟。
  4. 在24孔板的一个孔中加入2,500pg病毒。根据需要放大或缩小。
3. 第3天
  将0.5ml新鲜培养基加入转导孔（24孔板）中。
4. 第4-6天
  1. 小菌落应该在板的中心和边缘生长出来。
  2. 在这些菌落出现后轻轻更换培养基。
5. 第7-20天
  1. 每3天更换一次培养基，直至达到80％以上的汇合。
  2. 在第20天左右，将细胞以1：2的比例传送到更大的孔中。这个第一次通过很棘手，应该非常小心。将它们重新放入新井后丢失细胞是正常的。胰蛋白酶比accutase更好。原代小鼠EC已经在同一个孔中放置3-4周，并且非常牢固地附着在板的底部。使用accutase需要至少30分钟来分离细胞，因此非常有害。 0.05％胰蛋白酶可以更快地分离细胞，并且比accutase显着更好地保留细胞。将1ml 0.05％胰蛋白酶加入12孔板的1孔中，并在37℃下孵育7分钟，或直到在显微镜下观察时细胞向上翻转。使用移液器轻轻地分离细胞。
6. 第20天及以后
  1. 每3-4天更换培养基，直至细胞达到80％以上汇合。
  2. 将1：2通道插入6孔板的一个孔中。
  3. 重复步骤C6a-C6b，直至细胞在T75烧瓶中达到汇合。如有必要，通过分选确认培养的Akt1-小鼠EC的纯度和纯度。
  4. 冷冻保存早期传代Akt1-小鼠ECs的等分试样以备将来使用。
注意：
1. 时间线：在CD31-Dynabeads分离初级EC后，将细胞接种到12孔板中。在慢病毒转导和随后的培养后，在12孔板中到达一个汇合孔需要约3-4周。随后的培养和传代比第一次细胞传代更容易。在一个T75培养瓶中通常需要2个月才能达到融合。
2. 使用胰蛋白酶，而不是用于小鼠ECs的细胞传代，特别是第一次细胞传代。
3. 在进行第一轮细胞传代时稀释1：2。
4. 由于内在的内皮细胞异质性，建议生成多行EC并比较它们的功能。
5. 特别是对于EC的早期传代，在同一个孔中存在多个菌落，并且细胞看起来是异质的（图3A）。传代超过10次后，细胞趋于变得越来越均匀（图3B）。
6. 大多数时候，我在产生小鼠ECs细胞系时使用了20％的氧培养条件。应探索5％的氧气条件以获得更好的产量。
7. 使用上述方案，已成功生成肺，肝和脑等小鼠EC系列。
8. 关键事件：如果您在播种后2-3天看到细胞附着，特别是观察到一些菌落长出并且在接种后第6-7天的慢病毒转导后持续变大，很可能细胞将会生长精细。少数菌落长期存在，并且它们显着增殖以产生具有可扩展细胞数的小鼠EC系列。
  
  图3.不同阶段的Akt1-BMEC的代表性图像。 A.在Akt1转导后第10天，对Dynabeads富集的CD31 +原代BMEC进行转导。注意，孔中存在几个EC菌落（比例尺=500μm）。 B.细胞传代超过10次后，得到的Akt1-BMEC变得均匀（比例尺=500μm）。＆nbsp;
体外 Akt1-BMEC和HSPC共培养试验
1. 将BMEC培养到12孔板中，使其在小鼠EC完全培养基中生长融合。＆nbsp;
2. 安乐死小鼠。解剖股骨和胫骨。＆nbsp;
3. 在研钵中加入5ml MACS缓冲液，然后均匀化股骨和胫骨（视频3）。
4. 将上清液通过40μm细胞过滤器过滤到50ml Falcon管中（视频3）。
  
  视频3.均匀化股骨和胫骨以获得骨髓细胞。将从一只小鼠中解剖出的2个股骨和2个胫骨放入研钵中，并加入5ml冷的无菌MACS缓冲液。牢牢握住杵并施加向下的力来磨碎股骨和胫骨。在股骨和胫骨碎成碎片后，使用圆周运动完全释放骨腔内的骨髓细胞。顺时针旋转25次，逆时针旋转25次。对于我们在该方案中讨论的BMEC的分离，将白色骨组织和细胞悬浮液收集到15ml Falcon管中，然后进行酶消化。为了收集造血细胞以回收用于共培养的Lin-细胞，收集5ml含有细胞悬浮液的上清液，并立即通过40μm细胞过滤器过滤到50ml Falcon管中。将5ml MACS缓冲液加入白色骨质残留物中并进行圆形研磨运动。收集上清液直至红色骨髓完全冲洗掉，只留下白色骨组织。通常，需要3轮5毫升MACS缓冲液和圆形研磨来完成均质化过程。不需要酶消化（胶原酶和分散酶）。总的来说，为了收集造血干细胞，我们在MACS缓冲液中含有约15 ml细胞悬液，可以进行下游处理。
5. 再重复步骤D3-D4两次，直到所有骨髓都呈现白色。
6. 使用直接谱系消除试剂盒富集谱系阴性细胞（Lin - ）细胞。
7. 为了制备用于共培养的Akt1-BMEC，首先从孔中吸出小鼠EC完全培养基。
8. 用不含钙/镁的1x PBS洗涤Akt1-BMECs一次。
9. 使用补充有20ng / ml sKitL，敲除血清替代物，青霉素/链霉素/两性霉素和glutaMAX的StemSpan制备小鼠HSPC培养基。
10. 将Lin - 细胞重悬于0.1百万/ ml StemSpan培养基中。例如，如果需要共培养12孔板的3个孔，则在3ml StemSpan培养基中重悬30万个Lin - 细胞。
11. 第0天：将10百万个Lin - 细胞加入12孔板的一个孔中。这被视为第0天。
12. 第2天：向每个孔中加入1ml补充有sKitL的StemSpan培养基。
13. 准备第二个12孔板的Akt1-BMECs，让它在第4天变得融合。
14. 第4天：轻轻收集漂浮的造血细胞并在500 x g 下旋转5分钟。重悬于1ml StemSpan培养基中，并在第0天分配到12孔板的1孔中。将每种新鲜培养基1ml加入到具有Lin - 细胞共培养物的BMEC的旧孔中。保留旧井和新井进行培养。
15. 第6天：在新井和旧井中加入1毫升新鲜培养基。＆nbsp;
16. 第7天及以后：细胞收集，数据分析和下游功能分析。
  1. 在第7天，收集漂浮的造血细胞。向12孔板的每个孔中加入0.3ml accutase以分离附着的HSPC和BMEC。
  2. 计算总扩张HSPCS：计算总造血细胞数。＆nbsp;
    1. 使用直接谱系消除试剂盒富集Lin - 细胞并计算得到的Lin - 细胞数。＆nbsp;
    2. 然后用CD45，c-Kit和Sca1抗体染色Lin - 细胞以获得cKit + Sca1 + Lin Lin - 细胞中的HSPCs。＆nbsp;
    3. 使用Lin - 细胞数和Lin - 细胞中HSPC的百分比计算扩增的HSPC的总数。
  3. 共培养7天后对谱系细胞进行表型分析
    1. 取出约100万个扩增的细胞，用PBS洗一次。倾析上清液后，将细胞重悬于50μlMACS缓冲液中。用1:50稀释的小鼠FcR阻断细胞在冰上封闭细胞10分钟。将谱系抗体（每种未稀释的抗体1μl）（包括CD45，Gr1，CD11b，B220，CD3，CD41）添加到细胞悬浮液中。将抗体和细胞在冰上染色25分钟。＆nbsp;
    2. 使用1ml MACS缓冲液洗掉过量和非特异性结合的抗体。最后，将细胞重悬于0.4 ml（PBS + 2 mM EDTA + DAPI）溶液中进行流式细胞分析。＆nbsp;
    3. 如果在染色完成的同一天未对细胞进行分析，则在洗去过量抗体后，将细胞在室温下固定在200μl的1％PFA / PBS溶液中3分钟。然后使用1ml MACS缓冲液洗涤PFA。最后，将细胞重悬于0.4ml（PBS + 2mM）缓冲液中。在流式细胞术分析之前，染色的细胞可以储存2天。
    4. 髓样细胞定义为CD45 + Gr1 + 或CD45 + CD11b + ，T细胞定义为CD45 + CD3 + 细胞，B细胞定义为CD45 + B220 + 细胞。巨核细胞谱系定义为CD45 + CD41 + 细胞。
  4. 可以使用体外甲基纤维素测定和竞争性移植测定来进行HSPC的功能分析。对于甲基纤维素测定，在300μlStemSpan培养基中挑选350 cKit + Sca1 + Lin - 细胞（事件）。然后将细胞加入3ml解冻的甲基培养物中，并分成2个低附着的培养皿。在培养后第8天，分析所得的菌落数和菌落类型。
  5. 对于竞争性移植测定，在共培养的第6天以9Gy照射CD45.1小鼠。在第7天，计数50万CD45.2共培养的造血细胞并与0.5百万CD45.1骨髓单核细胞（BMMNC）混合，然后将其后向后注射到CD45.1小鼠中。当进行这种竞争性移植测定时，BMEC没有被分类，并且不会植入CD45.1小鼠。在移植后第4,8,12和16周，分析CD45.2细胞的外周嵌合和谱系分化潜能。

数据分析

请参阅文章（Guo et al。，2017）和图2A-2K中名为“体外 BMEC-HSPC共培养测定”的方法部分进行数据分析。

食谱

胶原酶/分散酶溶液的8倍浓度
1. 制备缓冲液以将酶重悬于：500ml PBS，含有5mM KCl，10mM HEPES，2mM CaCl 2，，1.3mM MgCl 2 。过滤消毒
2. 取无菌瓶，加入2.5克胶原酶A和1克Dispase。加入步骤a中制备的125ml缓冲液;混合重新悬浮。不要过滤。该溶液太粘，无法过滤
MACS缓冲区
PBS
2 mM EDTA
0.1％BSA
青霉素/链霉素/两性霉素（最终浓度：1x。原料为100x，制成MACS缓冲液时稀释1：100）
过滤消毒
Polybrene库存解决方案
使用4 mg / ml的ddH 2 O制备原液浓度
过滤器在层流罩中消毒。
最终工作浓度：4μg/ ml-8μg/ ml，具体取决于细胞类型
小鼠EC完全培养基

注意：使用F-12培养基制备浓度为10 mg / ml的肝素钠粉末。过滤消毒。

致谢

SR由Ansary干细胞研究所，Starr基金会三机制干细胞核心项目，三机制干细胞计划（TRI-SCI 2013-032,2014-023,2016-013），帝国状态干细胞支持理事会和纽约州卫生部授予，并通过NIH R01（DK095039，HL119872，HL128158，HL115128，HL099997）和U54 CA163167的拨款。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有动物实验均在纽约州纽约的Weill Cornell Medicine Institutional Animal Care and Use Committee的批准下进行。所有实验程序均遵循IACUC指南。这些视频是根据美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院IACUC指南，根据协议＃2009-0061）在威尔康奈尔医学院制作的。

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